MỞ ĐẦU Hình 1: Mẫu nước bị nhiễm bẩn Bộ công thương Đại học Công nghiệp Thực phẩm Tp Hồ Chí Minh Khoa: Cơng nghệ Sinh học Kĩ thuật mơi trường Mơn: KĨ THUẬT PHÂN TÍCH VI SINH VẬT Đề tài: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH COLIFORMS VÀ E.COLI GVHD: Trần Quốc Huy Nhóm Tuần 12 -Thứ – Tiết 7-8 DANH SÁCH NHÓM Họ Tên Mã số sinh viên Nguyễn Thị Ngọc Anh 2008130183 Nguyễn Thị Hiền 2008130188 Đặng Thị Cẩm Linh 2008130179 Nguyễn Thị Hồng Nhi 2008130161 Nguyễn Trọng Nghĩa 2008130036 Nguyễn Thị Ngọc Phương 2008130182 Đỗ Thị Thùy Trang 2008130113 NỘI DUNG 01 02 SƠ LƯỢC VỀ COLIFORMS VÀ E.COLI PHƯƠNG PHÁP TRUYỀN THỐNG 03 04 PHƯƠNG PHÁP HIỆN ĐẠI KẾT LUẬN 05 TÀI LIỆU THAM KHẢO 01 SƠ LƯỢC VỀ COLIFORMS VÀ E.COLI 1) Phân loại: Coliforms có khả lên men lactose sinh khoảng 24h Coliforms Co lif or m Coliforms chịu nhiệt có khả sinh indole ủ khoảng 24h 44,5 C môi trường Trypton s m r fo i l Co ủ 44 C môi trường EC sc hịu ân h p nh iệt E.coli Klebsiella pneumoniae Enterobacter aerogenes 01 SƠ LƯỢC VỀ COLIFORMS VÀ E.COLI 1) Phân loại: Vi khuẩn Coliforms ••Hiện diện hình trongque, hệ Gram tiêu hóa cũnghình đượcthành tìm thấy Vi khuẩn âm,vàkhơng bào tử • đất thực vật hiếu khí kỵ khí tùy ý Vi khuẩn •Có khả lên men lactose sinh acid sinh 37oC, 24 - 48h •Gồm nhóm Citrobacter freundii SƠ LƯỢC VỀ COLIFORMS VÀ E.COLI 2) 01 Escherichia coli: Escherichia coli (Bacteriam coli Commue) ông Escherich phát năm 1885 trường hợp tiêu chảy trẻ em Hình 4: Vi khuẩn Escherichia coli SƠ LƯỢC VỀ COLIFORMS VÀ E.COLI 2) Escherichia coli: Khả Đặc điểm hình thái: lên men sinh •Trực  Tạokhuẩn độc tố:Gram (-), kích thước trung bỡnh 2-3àm x 0,5àm ãHai u trũn, cú kh nng di động, khơng hình thành nha bào •Hiếu khí kị khí tùy ý •Nhiệt độ phát triển: 37oC, pH=7.4 Hình 4: Cấu trúc Escherichia coli 01 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRUYỀN THỐNG SƠ LƯỢC VỀ COLIFPRMS VÀ E.COLI 1) 02 Phương pháp MPN: (mẫu thực phẩm chứa mật độ thấp) Quy  Ngun trình:tắc: •Dựa ngun tắc xác suất thống kê phân bố vi sinh vật độ pha loãng khác mẫu Khuẩn lạc Ống (+) Ống (+) Ống Ống (+) (+) PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRUYỀN THỐNG SƠ LƯỢC VỀ COLIFPRMS VÀ E.COLI 1) 02 Phương pháp MPN: (mẫu thực phẩm chứa mật độ thấp) Kết quả: Bảng Kết thể đặc tính sinh học Coliforms phương pháp MPN Vi khuẩn Indole Escherichia coli + (-) Enterobacter or Klebsiella Citrobacter Hình 2.1 Kếtred tăng trưởng củaVoges-Proskauer Methyl Coliforms môi trường Citrate + - - - (+) - (+) + + - (+) + - + Trypton (bên trái), EC (bên phải) PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HIỆN ĐẠI PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRUYỀN THỐNG Gen độc lực 1) Primer Trình tự đoạn primer (5’→ 3’) Stx1-F ATAAATCGCCATTCGTTGACTAC Phương pháp PCR: (kỹ thuật Mutiflex – PCR): stx1 Stx1-R AGAACGCCCACTGAGATCATC Eae-R CCACCTGCAGCAACAAGAGG HlyA-F GCATCATCAAGCGTACGTTCC HlyA-R AATGAGCCAAGCTGGTTAAGCT 03 Kích cỡ đoạn DNA khuếch đại (bp) 180  Cơ chế: Stx2-F GGCACTGTCTGAAACTGCTCC   Nguyên  Quy trình:tắc: Kết quả: stx2 255 Stx2-R TCGCCAGTTATCTGACATTCTG •Nhân lên đồng đoạn DNA mong muốn cách sử dụng nhiều cặp primer phản ứng Eae-Fthời nhiều GACCCGGCACAAGCATAAGC eaeA hlyA lt-I sta stb Mẫu vt2e LT-F GGCGACAGATTATACCGTGC LT-R CCGAATTCTGTTATATATGTC STa-F TTAATAGCACCCGTACAAGCAGG 384 Trích ly DNA 534 Chọn khuẩn lạc, thử 696 nghiệm sinh hóa 147 Cấy vào môi trường, STa-R CTTGACTCTTCAAAAGAGAAAATTAC STb-F ATCGCATTTCTTCTTGCATC STb-R GGGCGCCAAAGCATGCTCC Vt2e-F CCTTAACTAAAAGGAATATA o ủ 37 C, 24h 172 230 Hình 11: Kết điện di sản phẩm multiplex - PCR2H44: Đối chứng dương (lt-I, vt2e, stb) Lad: Thang chuẩn 1, 2, 3, Vt2e-R CTGGTGGTGTATGATTAATA mẫu xét nghiệm Bảng : Trình tự đoạn mồi sử dụng multiplex – PCR 03 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HIỆN ĐẠI PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRUYỀN THỐNG 2)Phương pháp phát E.coli bằng phức hợp kháng thể + hạt nano silica phát quang: Nguyên lý: •Dựa Kỹ thuật kỹ dựathuật miễn tính chất dịch huỳnh thuốc quang: kết hợp kháng nguyên kháng thể Là kháng thể nhuộm kháng nguyên đượckích đánhthích dấu thuốc xạnhuộm có huỳnh quang bước sóng đặc hiệu phát sáng Hình Màu bước sóng chất huỳnh quang PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HIỆN ĐẠI PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRUYỀN THỐNG 2)Phương pháp phát E.coli bằng phức hợp kháng thể + hạt nano silica phát quang: Quy trình: 03 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HIỆN ĐẠI PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRUYỀN THỐNG 2)Phương pháp phát E.coli bằng phức hợp kháng thể + hạt nano silica phát quang: Quy trình: • • Quan sát kính hiển vi huỳnh quang: Xây dựng đường chuẩn Pha lỗng dịch chuẩn chứa xác số lượng vi khuẩn đích gắn phức hợp mật độ thấp Xây dựng đường chuẩn cường độ huỳnh quang phụ thuộc số lượng vi khuẩn đích  Đo phổ huỳnh quang Tỉ lệ % tế bào gắn kết 03 03 PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP HIỆN ĐẠI PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP TRUYỀN THỐNG 2)Phương pháp phát E.coli bằng phức hợp kháng thể + hạt nano silica phát quang: Cơ chế: Hình Gắn kết vi khuẩn đích với kháng thể hạt nano silica PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP HIỆN ĐẠI 03 PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP TRUYỀN THỐNG 2)Phương pháp phát E.coli bằng phức hợp kháng thể + hạt nano silica phát quang: Kết quả: Hình 13 : (a) phức hợp hạt nano silica – kháng thể; (b) VK gắn với phức hợp kháng thể - Silica; (c) VK gắn với phức hợp kháng thể - QDs 04 KẾT LUẬN MPN PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HIỆN ĐẠI •Mẫu có mật độ thấp •Các mẫu nước có độ đục cao Mutiplex – PCR •Thời gian cho kết nhanh, phát vi sinh vật khó ni cấy •Việc tăng sinh đơn giản •Hóa chất dễ tìm, khơng cần dụng cụ mơi trường phân tích •Hiệu Ưu điểm cho việc phân tích mẫu bùn, bùn, phù sa Phức hợp kháng thể + hạt nano silica phát quang •Phát nhanh (30-60ph) •Có độ xác cao nồng độ vi khuẩn đích mẫu từ 102 CFU/ml trở lên phức tạp •Ít tốn mặt nhân sự, giảm chi phí Nhược điểm •Thời gian kéo dài •Kết có độ tin cậy khơng cao •Tốn chi phí •Xảy dương tính giả •Khơng hoạt động với đoạn DNA > 3kb •Mẫu thực phẩm thường có thành phần phức với dung dịch có độ pH nồng độ ion biến đổi •Cấy làm giàu để có mật độ đủ để phát •Trường hợp dương tính giả DNA từ tế bào chết điểm cao tạp •Giảm mức độ tin cậy phép đo tiến hành •Sử dụng máy móc chun dụng •Giá thành kháng thể đơn dòng hạt silica thời TÀI LIỆU THAM KHẢO 05 [1] GS TS Lê Huy Chính, 2007 Vi sinh vật y học, NXB Y học, Hà Nội [2] Trần Linh Thước, Các phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm, NXB Giáo dục [3] Cebula T A., Payne W L., and Feng P., 1995 Simultaneous Identification of Strains of Escherichia coli Serotype O157:H7 and Their Shiga – Like toxin Type by Mismatch Amplification Mutation Assay – Multiplex PCR J Clin KẾT LUẬN Microbiol 33: 248 - 250 [4] Youngsheng He, James, E.Keen, Ralph B.Westama, E.Travis Littledike, Jimmy Kwang, 1996 Monoclonal Antibodies for Dectiction of the H7 Antigen of Escherichia Coli, Applied and enviromental microbiology, Vol-62 No 9p 3325-3332 CẢM ƠN THẦY VÀ CÁC BẠN ĐÃ LẮNG NGHE !!! ... quang PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HIỆN ĐẠI PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRUYỀN THỐNG 2 )Phương pháp phát E.coli bằng phức hợp kháng thể + hạt nano silica phát quang: Quy trình: 03 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HIỆN... PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HIỆN ĐẠI PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRUYỀN THỐNG 2 )Phương pháp phát E.coli bằng phức hợp kháng thể + hạt nano silica phát quang: Nguyên lý: •Dựa Kỹ thuật kỹ dựathuật miễn tính. .. (+) (+) PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRUYỀN THỐNG SƠ LƯỢC VỀ COLIFPRMS VÀ E.COLI 1) 02 Phương pháp MPN: (mẫu thực phẩm chứa mật độ thấp) Kết quả: Bảng Kết thể đặc tính sinh học Coliforms phương pháp MPN