28 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH PHAN NGUYỄN THANH VÂN ỨNG DỤNG KỸ THUẬT KHUẾCH ĐẠI GIEN KHẢO SÁT CÁC TỔ HỢP GIEN THƯỜNG GẶP TRONG BỆNH LÝ BẠCH CẦU CẤP Chuyên ngành: Huyết học Mã số: 62.72.25.01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC TP Hồ Chí Minh – Năm 2013 27 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ Cơng trình hồn thành tại: ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH Người hướng dẫn khoa học: - 1.Thư việnTS Quố c gia Việ t nam PGS Nguyễn Tấn Bỉnh - 2.Thư việnBửu Khoa học tổng hợp TP Hồ Chí Minh PGS Mật Phản biện 1: PGS TS Nguyễn Duy Thăng Bệnh viện Trung ương Huế Phản biện 2: TS Phan Bích Liên Bệnh viện Chợ Rẫy Phản biện 3: PGS TS Nguyễn Hà Thanh Viện Huyết học Truyền máu Trung ương Luận án bảo vệ Hội đồng chấm luận án cấp trường họp ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH Vào hồi , ngày tháng năm 2013 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt nam - Thư viện Khoa học tổng hợp TP Hồ Chí Minh - Thư viện Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Phan Nguyễn Thanh Vân, Nguyễn Tấn Bỉnh (2006) “Triển khai kỹ thuật FISH RT-PCR nhằm phát bất thường nhiễm sắc thể gen bệnh lý huyết học bệnh viện Truyền máu Huyết học thành phố Hồ Chí Minh” Tạp Chí Y Học Thực Hành, 545: 73-79 Phan Nguyễn Thanh Vân, Nguyễn Tấn Bỉnh (2007) “Ứng dụng kỹ thuật FISH RT-PCR chẩn đoán điều trị bệnh lý huyết học bệnh viện Truyền máu Huyết học thành phố Hồ Chí Minh” Tạp Chí Y Học Việt Nam, 331: 1-12 Phan Nguyễn Thanh Vân, Nguyễn Tấn Bỉnh (2008) “Kỹ thuật di truyền học tế bào sinh học phân tử chẩn đoán, tiên lượng điều trị bệnh lý huyết học” Tạp Chí Y Học Việt Nam, 344: 1323 Phan Nguyễn Thanh Vân, Nguyễn Thị Kim Định, Phan Thị Xinh (2010) “Khảo sát tổ hợp gen thường gặp bạch cầu cấp dòng lympho BV Truyền Máu - Huyết Học TP HCM” Tạp chí Y học Việt nam, 373: 180-185 Phan Nguyễn Thanh Vân, Phan Thị Xinh, Trần Thị Trúc Thanh, Nguyễn Tấn Bỉnh (2011) “Những bất thường nhiễm sắc thể gien bệnh bạch cầu cấp dòng tủy” Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh, 15 (4): 64-71 Phan Nguyễn Thanh Vân, Phan Thị Xinh, Trần Thị Trúc Thanh, Nguyễn Tấn Bỉnh (2011) “Những bất thường nhiễm sắc thể gien bệnh bạch cầu cấp dòng lympho” Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh, 15 (4): 72-78 Phan Nguyễn Thanh Vân, Nguyễn Tấn Bỉnh, Nguyễn Thị Kim Định, Phan Thị Xinh (2011) “Xác định tổ hợp gien TEL/AML1, BCR/ABL, MLL/AF4, E2A/PBX1 bạch cầu cấp dòng lympho bệnh viện Truyền Máu Huyết Học TP Hồ Chí Minh” Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh, 15 (4): 493-497 Phan Nguyễn Thanh Vân, Nguyễn Tấn Bỉnh, Nguyễn Thị Kim Định, Phan Thị Xinh (2011) “Xác định tổ hợp gien AML1/ETO, PML/RARA, CBFB/MYH11, MLL/AF9 bạch cầu cấp dòng tủy bệnh viện Truyền Máu Huyết Học Thành Phố Hồ Chí Minh” Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh, 15 (4): 498-502 26 GIỚI THIỆU LUẬN ÁN KIẾN NGHỊ Kỹ thuật RT-PCR phát tổ hợp gien thường gặp BCCDT hay BCCDL cách nhanh chóng, có độ nhạy độ đặc hiệu cao, góp phần cho hướng chẩn đốn xác thể bệnh BCCDT, giúp phân nhóm tiên lượng xác góp phần nâng cao chất lượng hiệu điều trị Kỹ thuật đơn giản nên dễ dàng triển khai phịng xét nghiệm sinh học phân tử chuyên ngành Huyết học Trong trường hợp chưa thể phân nhóm tiên lượng, nên dùng khảo sát kỹ thuật giải trình tự gien phân tích nhiễm sắc thể Chúng ta cần phối hợp kỹ thuật PCR phân tích nhiễm sắc thể để đánh giá kiểu hình bất thường gien nhiễm sắc thể đầy đủ, góp phần phân nhóm tiên lượng Kỹ thuật giải trình tự phức tạp hơn, kỹ thuật cao, để xác định đột biến gien FLT3, c-kit, NPM1, CEBPA … giúp phân nhóm tiên lượng cho nhóm khơng có tổ hợp gien bất thường nhiễm sắc thể Chúng ta cần tiến hành khảo sát với số lượng mẫu lớn xây dựng mẫu kiểm soát chất lượng (QC-Quality control) để tiến đến hoàn thiện kỹ thuật hai tổ hợp gien minor BCR/ABL TEL/AML1 Hơn nữa, cần tiếp tục tiến hành xây dựng triển khai kỹ thuật RQ-PCR tổ hợp gien major BCR/ABL tổ hợp gien thường gặp lại bệnh BCCDL BCCDT Từ đó, đưa kỹ thuật RQ-PCR thành công cụ vàng theo dõi tồn lưu ác tính bất thường tổ hợp gien xác định có ảnh hưởng đến tiên lượng bệnh Với mục tiêu cao nâng kỹ thuật RQ-PCR ngang tầm giới, cần tiến hành chuẩn hóa cách nghiêm ngặt để xác định hệ số qui đổi chuẩn quốc tế Để thực điều đó, cần đầu tư thêm trang thiết bị, máy móc đào tạo nhân bản, chuyên sâu Đặt vấn đề Bệnh bạch cầu cấp (BCC) bệnh lý ác tính hệ tạo máu đặc trưng tăng sinh tích tụ tế bào non máu tủy xương BCC chia thành nhóm BCC dịng tủy (BCCDT) BCC dịng lympho (BCCDL) Trong nhóm chia thành nhiều thể khác dựa phân loại FAB, bao gồm thể BCCDT thể BCCDL Trong năm gần nhờ ứng dụng kỹ thuật tế bào dòng chảy xác định dấu ấn bề mặt tế bào giúp phân loại nhóm, nhiên BCC không đồng mặt đáp ứng điều trị Từ năm 1973, nhờ phát triển phương pháp băng nhiễm sắc thể (NST) kỹ thuật di truyền học phân tử kỹ thuật lai chỗ phát huỳnh quang (FISH), PCR, giải trình tự chuỗi DNA… nên bất thường NST gien BCCDT BCCDL phát nghiên cứu mối liên hệ với đáp ứng điều trị Tại Việt Nam, nhiều nhà khoa học thực nhiều nghiên cứu ung thư, từ dịch tễ điều trị Tuy nhiên, việc nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật di truyền phân tích bất thường NST chẩn đốn điều trị bệnh lý bạch cầu cấp cịn hạn chế Từ tháng năm 2006, Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học thành phố Hồ Chí Minh (BV TMHH TP HCM) áp dụng thường qui kỹ thuật sinh học phân tử FISH RT-PCR chẩn đoán, tiên lượng đặc biệt theo dõi đáp ứng điều trị, đánh giá bệnh tồn lưu mức độ phân tử bệnh lý bệnh BCMDT, BCCDT BCCDL Trong năm 2006, 123 bệnh nhân bệnh bạch cầu phân tích kỹ thuật FISH để phát chuyển đoạn t(9;22), t(15;17) t(8;21) kỹ thuật RT-PCR để phát tổ hợp gien BCR/ABL, PML/RARA AML1/ETO Bệnh viện Trong năm, từ 2008 đến 2010, Bệnh viện phối hợp với Đại học Y dược TP HCM triển khai đề tài cấp Nhà nước chuẩn hóa kỹ thuật di truyền phân tử bệnh lý huyết học 4 25 Việc ứng dụng sinh học phân tử (kỹ thuật RT-PCR, Multiplex PCR, PCR định lượng gien) cho kết nhanh chóng so với kỹ thuật di truyền nhiễm sắc thể đồ hay FISH, nên đáp ứng kịp thời với nhu cầu chẩn đốn bệnh chọn lựa phác đồ thích hợp Kỹ thuật có độ nhạy cao, nên thích hợp để theo dõi điều trị bệnh đánh giá nguy tái phát bệnh Bên cạnh đó, phát nhiều bất thường lúc, thay tốn nhiều thời gian chi phí cho việc khảo sát bất thường kỹ thuật FISH, nên phân nhóm tiên lượng bệnh sớm Chính vậy, thực nghiên cứu với mục tiêu tổng quát sau: "Ứng dụng kỹ thuật khuếch đại gien khảo sát tổ hợp gien thường gặp bệnh lý bạch cầu cấp, góp phần phân loại nhóm tiên lượng bệnh theo dõi điều trị, Bệnh viện Truyền máu Huyết học thành phố Hồ Chí Minh, từ ngày 01 tháng 10 năm 2009 đến 31 tháng năm 2011" Để đạt kết trên, cần phải thực mục tiêu chuyên biệt sau: dõi hiệu điều trị, nên sử dụng kỹ thuật RQ-PCR xét nghiệm thường qui khoa huyết học Xác định tỷ lệ tổ hợp gien thường gặp lúc chẩn đốn nhóm bệnh bạch cầu cấp dịng tủy Xác định tỷ lệ tổ hợp gien thường gặp lúc chẩn đốn nhóm bệnh bạch cầu cấp dòng lympho Triển khai kỹ thuật PCR định lượng theo dõi điều trị Tính cấp thiết đề tài Cùng với tính đa dạng hình thái lâm sàng, nhóm bệnh bạch cầu cấp nhiều chế phân tử gây bệnh khác Trên giới, việc đánh giá bất thường nhiễm sắc thể gien kỹ thuật sinh học phân tử coi tiêu chuẩn bắt buộc cho việc phân nhóm tiên lượng hướng dẫn điều trị bệnh nhân bạch cầu cấp Tại Việt nam, vấn đề cần nghiên cứu ứng dụng Ứng dụng kỹ thuật PCR giúp cho việc xác định nhanh tổ hợp gien khoảng 1/3 trường hợp BCC lúc chẩn đoán sử dụng tổ hợp gien dấu ấn để theo dõi trình điều trị vấn đề quan trọng cần thiết giúp phân nhóm tiên lượng, lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp đánh giá đáp ứng điều trị, góp phần nâng cao tỉ lệ lui bệnh, kéo dài thời KẾT LUẬN Qua khảo sát 341 bệnh nhân chẩn đoán bệnh bạch cầu cấp, bao gồm 162 BN bạch cầu cấp dòng tủy 179 BN bạch cầu cấp dòng lympho Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP HCM, từ ngày 01/10/2009 đến ngày 31/07/2011, chúng tơi có kết luận sau: Nhóm bệnh BCCDT có 19 BN biểu AML1/ETO (11,7%), 11 BN biểu PML/RARA (6,8%), BN biểu CBFB/MYH11 (4,3%), BN biểu MLL/AF9 (2,5%) Nhóm bệnh BCCDL có 17 BN biểu TEL/AML1 (9,5%), 16 BN biểu BCR/ABL (8,9%), BN biểu MLL/AF4 (2,8%), BN biểu E2A/PBX1 (4,5%) Chúng tơi thiết lập qui trình RT-PCR chẩn đoán tổ hợp gien thường gặp BCCDT (AML1/ETO, PML/RARA, CBFB/MYH11, MLL/AF9), BCCDL (TEL/AML1, BCR/ABL, MLL/AF9 E2A/PBX1); triển khai RQ-PCR để định lượng số tổ hợp gien để theo dõi đáp ứng xác q trình điều trị Chẩn đoán bạch cầu cấp BCCDT BCCDT BCCDL RT-PCR tổ hợp gien RT-PCR tổ hợp gien Dương tính Định lượng gien Dương tính 24 nên mang tính chủ quan cao, đơi khơng phản ánh tỉ lệ tồn lưu tế bào ác tính gian sống tiết kiệm chi phí điều trị cho bệnh nhân mắc bệnh BCC Việt nam Đáng ý ca 1615, lần gửi mẫu đầu thứ ba (1615-4), lúc bệnh nhân điều trị hoàn tất với Hyper CVAD + Imatinib Khi khảo sát kỹ thuật FISH RT-PCR cho kết âm tính, cịn khảo sát kỹ thuật RQ-PCR cho thấy tỉ lệ minor BCR/ABL 0,26% Điều có hai khả năng: thứ RQ-PCR cho kết dương tính giả, thứ hai độ nhạy kỹ thuật FISH không đủ để phát lượng tế bào tồn lưu q thấp khơng nhìn thấy băng Khi so sánh với kết dấu ấn miễn dịch thực kỹ thuật dòng chảy tế bào thời điểm (mẫu gửi ngày 07/01/2011) cho thấy cịn tồn lưu tế bào ác tính tỉ lệ thấp, kiểu hình CD7+CD22+ chiếm 0,015% Điều cho thấy kết RQ-PCR phù hợp với kết dấu ấn miễn dịch Và kết đồng nghĩa với việc tiềm ẩn nguy tái phát cao Thật vậy, đến lần gửi mẫu ngày 06/06/2011 kết khảo sát tổ hợp gien minor BCR/ABL kỹ thuật RT-PCR dương tính bệnh nhân chẩn đốn BCCDL tái phát tủy lần Những đóng góp luận án Tóm lại, chúng tơi bước đầu triển khai thành công kỹ thuật RQ-PCR tổ hợp gien minor BCR/ABL TEL/AML1 Kết định lượng tồn lưu tế bào ác tính kỹ thuật RQ-PCR thực song song mẫu thử, mẫu chuẩn chứng nội đảm bảo tính khái quát, khách quan, độ tin cậy độ nhạy cao Hơn nữa, kết hiển thị dạng hàm log giúp dễ dàng theo dõi mức độ lui bệnh mặt di truyền học tế bào Vì vậy, qua điều khẳng định độ tin cậy độ nhạy kỹ thuật RQ-PCR mà triển khai Khơng giống kỹ thuật RT-PCR mang tính định tính, kỹ thuật RQ-PCR phản ánh kết tồn lưu tế bào ác tính qua giai đoạn điều trị bệnh nhân khảo sát Điều đặc biệt có ý nghĩa việc theo dõi hiệu điều trị Trên sở kết nghiên cứu, nhận thấy sau phát tổ hợp gien kỹ thuật RT-PCR, để theo Đây nghiên cứu Việt nam thực mẫu lớn, gồm 341 bệnh nhân, để khảo sát tổ hợp gien hai nhóm bạch cầu cấp dòng tủy dòng lympho Ý nghĩa bật cơng trình nghiên cứu việc xây dựng thành cơng kỹ thuật PCR định lượng có ý nghĩa theo dõi thay đổi số lượng tổ hợp gien trình điều trị Việc triển khai ứng dụng kỹ thuật có ý nghĩa thực tiễn lớn công tác điều trị bệnh nhân Bố cục luận án Luận án có 106 trang, bao gồm: đặt vấn đề trang, tổng quan tài liệu 31 trang, đối tượng phương pháp nghiên cứu 18 trang, kết 31 trang, bàn luận 21 trang, kết luận trang kiến nghị trang Có 53 bảng, sơ đồ, biểu đồ, 12 hình 150 tài liệu tham khảo (tiếng Việt 3, tiếng Anh 147) Chương 1: Tổng quan tài liệu 1.1 Di truyền phân tử ý nghĩa BCCDT 1.1.1 Chuyển đoạn t(8;21)(q22;q22) Chuyển đoạn t(8;21)(q22;q22) mô tả lần vào năm 1973 Đây chuyển đoạn thường gặp bệnh BCCDT thể M2 (theo FAB) tạo tổ hợp gien AML1/ETO Gien AML1 bình thường mã hóa protein có vai trị hoạt hóa phiên mã làm tế bào phân chia biệt hóa Khi xuất chuyển đoạn, protein hình thành từ tổ hợp gien AML1/ETO khơng khơng có chức protein AML1 mà cịn ức chế protein AML1 bình thường, dẫn đến tế bào bị ung thư Chuyển đoạn t(8;21) có tiên lượng tốt người lớn bệnh BCCDT, tỷ lệ đạt lui bệnh cao với thời gian lui bệnh kéo dài điều trị củng cố sử dụng liều cao Cytarabine Khác với người lớn, trẻ em có chuyển đoạn t(8;21) đáp ứng trung bình với hóa trị liệu có thời gian sống ngắn 1.1.2 Chuyển đoạn t(15;17)(q22;q11) Chuyển đoạn t(15;17)(q22;q11) tổ hợp gien PML/RARα chuyển đoạn đặc hiệu BCCDT, thể M3 (APL), gợi ý diện nhiều hạt lớn tiền tủy bào kết hợp với đông máu nội mạch lan tỏa, có phân nhóm với hạt li ti Tổ hợp gien PML/RARA sử dụng điểm cho việc phát tế bào APL thời điểm chẩn đoán theo dõi suốt trình điều trị Bình thường, protein sản phẩm gien RARα có chức hoạt hóa trình phiên mã gien có vai trị giúp tế bào trưởng thành Cấu trúc protein có phần gắn vào deoxyribonucleic acid (DNA) phần tương tác với dẫn chất acid retinoic Trong trường hợp chuyển đoạn t(15;17), tổ hợp gien PML/RARα mã hóa protein mới, protein khơng khơng hoạt hóa phiên mã mà cịn ức chế chức RARα bình thường tế bào khơng tổng hợp protein, trình trưởng thành tế bào dừng lại giai đoạn tiền tủy bào Theo y văn, để hoạt động ức chế phiên mã, protein PML/RARα phải gắn với phức chất khác gồm chất đồng ức chế nhân (NcoR: Nuclear CoRepressor) enzym histone de-acetylase Hiện tượng gắn hai phức bị ly giải với có mặt dẫn chất acid retinoic ly giải protein PML/RARα khơng cịn tác dụng Lợi dụng đặc tính này, người ta dùng ATRA (All Trans Retinoic Acid) để điều trị bệnh Những chiến lược điều trị APL tập trung vào giảm thiểu liệu pháp hóa trị, dùng kết hợp ATRA Arsenic trioxide (nhắm vào đích gien PML) liệu pháp ban đầu cho bệnh nhân đáp ứng với anthracycline người lớn tuổi 1.1.3 Đảo đoạn nhiễm sắc thể 16 Đảo đoạn nhiễm sắc thể 16, inv(16)(p13;q22) Le Beau mơ tả bệnh BCCDT vào năm 1983; ngồi ra, bất thường liên hệ khác mô tả chuyển đoạn 23 4.4 Triển khai kỹ thuật PCR định lượng theo dõi điều trị 4.4.1 Điều kiện xây dựng đường chuẩn Chúng xác định nhiệt độ bắt cặp mồi tối ưu 600C chung cho phản ứng PCR khuếch đại chứng nội - gien ABL, tổ hợp gien minor BCR/ABL TEL/AML1 để thu nhận gien đích phục vụ cho q trình xây dựng đường chuẩn Ngoài ra, điều kiện cho phản ứng PCR định lượng xây dựng chung cho gien ABL, tổ hợp gien minor BCR/ABL TEL/AML1 Nhờ đó, đợt RQ-PCR xác định lúc tổ hợp gien minor BCR/ABL TEL/AML1 Điều đặc biệt ý nghĩa giúp tiết kiệm nhiều thời gian, hóa chất, cơng sức giúp đơn giản hóa qui trình Ngồi ra, điều kiện cho phản ứng PCR định lượng xây dựng chung cho gien ABL, tổ hợp gien minor BCR/ABL TEL/AML1 Nhờ đó, đợt RQ-PCR xác định lúc tổ hợp gien minor BCR/ABL TEL/AML1 Điều đặc biệt ý nghĩa giúp tiết kiệm nhiều thời gian, hóa chất, cơng sức giúp đơn giản hóa qui trình Đường chuẩn chứng nội mẫu chuẩn tổ hợp gien minor BCR/ABL TEL/AML1 với độ tuyến tính hiệu suất phản ứng cao 4.4.2 Kết theo dõi đáp ứng điều trị phương pháp RQ-PCR Nhìn chung, tỉ lệ phần trăm tế bào dương tính khảo sát kỹ thuật RQ-PCR cao so với kỹ thuật FISH chí có ca cho kết khác biệt âm dương Cụ thể, ca 1598-2, 1874-3 có kết RQ-PCR dương tính (phù hợp với kết RT-PCR) kết FISH lại âm tính Điều lý giải kỹ thuật FISH phân tích 200 tế bào nên độ nhạy khơng cao, dễ bỏ sót tế bào dương tính q Ngoài ra, tùy vùng đọc mà cho tỉ lệ tế bào dương khác 22 4.3 Theo dõi điều trị kỹ thuật RT-PCR Số lượng bệnh nhân tham gia vào giai đoạn đánh giá tổ hợp gien sau điều trị 36 người, chiếm 10% so với lúc chẩn đoán (341 người) Trong 36 bệnh nhân BCCDT BCCDL theo dõi sau điều trị RT-PCR, có đến hai phần ba trẻ em (24/36 tổng số), bao gồm nhóm bệnh: BCCDL-B, BCCDL-T, BCCDT BCCDL-B có số lượng đơng 61% (22/36 tổng số) 91% số trẻ em 15 tuổi (20/22 BCCDL) Tương tự, có 2,7% bệnh nhân thuộc nhóm BCCDL T (1/36 tổng số) trẻ em 15 tuổi Tuy nhiên, 36,1% bệnh nhân BCCDT (13/36 tổng số) có 76,9% 15 tuổi (10/13 trường hợp) Tỉ lệ trẻ em tham gia giai đoạn nhiều người lớn giải thích: bệnh BCCDL tập trung vào nhóm trẻ em nhiều hơn, khả chữa khỏi cao theo nghiên cứu tác giả Võ Thị Thanh Trúc 97,6%, tác giả Ching-Hon Pui 98%; đa số trẻ em bảo hiểm y tế chi trả từ 80 - 100% kinh phí khám chữa bệnh, chi phí thực xét nghiệm chẩn đốn theo dõi bệnh nên có điều kiện theo đuổi điều trị lâu dài Trong nghiên cứu, sau đợt hóa trị liệu cơng, tổng số 49 trường hợp BCCDT có biểu gien lúc chẩn đoán, 13 trường hợp theo dõi sinh học phân tử, trường hợp (53,9%) biểu gien bất thường lui bệnh hoàn toàn sau điều trị công Trong tổng số 52 trường hợp BCCDL có biểu gien lúc chẩn đốn, 23 trường hợp theo dõi sinh học phân tử, (34,9%) trường hợp biểu gien bất thường lui bệnh hoàn toàn sau điều trị công Điều phù hợp với quan điểm chung nhà khoa học giới, vào giai đoạn lui bệnh hồn tồn dựa vào hình thái học, bệnh nhân BCC tồn lưu khoảng 1010 tế bào ác tính tủy xương Bằng kỹ thuật RT-PCR, phát tồn lưu tế bào ác tính qua việc biểu kiểu hình gien bất thường t(16;16)(p13;q32) Bất thường xảy chủ yếu (khoảng 50%) bệnh nhân BCC dịng tủy-monơ bào có kèm tăng bạch cầu toan (BCCDT-M4Eo) Những bệnh nhân BCCDT có inv(16)/t(16;16) có tiên lượng tốt với tỷ lệ đạt lui bệnh cao thời gian sống kéo dài (hơn 50% bệnh nhân) Sự chuyển đoạn xảy 10% bệnh nhân lớn 60 tuổi bệnh BCCDT 1.1.4 Chuyển đoạn t(9;11)(p22;q23) Gien MLL tổ hợp với 60 gien đồng hành khác tạo thành chuyển đoạn NST bệnh bạch cầu cấp khác nhau, hình thành nên protein tổ hợp MLL phức tạp Trong số chuyển đoạn liên quan đến bất thường NST 11 chuyển đoạn t(9;11)(p21-22;q23) chiếm tỉ lệ cao bệnh BCCDT, đặc biệt bệnh BCCDT thứ phát điều trị với chất ức chế men topoisomerase II; gặp bệnh BCCDL Tổ hợp gien MLL/AF9 chứng minh có vai trị quan trọng phát triển tế bào gốc hình thành ung thư ức chế biệt hóa tế bào đầu nguồn hệ tạo máu Nhìn chung, bệnh nhân BCCDT có mang tổ hợp gien MLL/AF9 xếp vào nhóm có tiên lượng trung bình 1.2 Di truyền phân tử ý nghĩa BCCDL 1.2.1 Chuyển đoạn t(12;21)(p13;q22) Chuyển đoạn t(12;21)(p13;q22) Romana nhận dạng kỹ thuật FISH vào năm 1994 Đến năm 1995, Golub chứng minh tổ hợp gien chuyển đoạn TEL/AML1 Chuyển đoạn không dễ phát kỹ thuật phân tích NST kích thước NST thay đổi khơng đáng kể Những nghiên cứu khác sau chứng minh chuyển đoạn thường gặp bệnh BCCDL trẻ em, chiếm khoảng 25% trường hợp BCCDL trẻ em Phần lớn bệnh nhân dương tính nằm độ tuổi từ đến 12 tuổi thời điểm chẩn đoán, thường gặp độ tuổi từ đến tuổi; tất thể dấu ấn miễn dịch thuộc dòng tế bào precursor-B, đặc biệt 21 BCCDL thể common BCCDL thể pre-B, gặp dòng tế bào BCCDL thể pro-B bệnh nhân BCCDL Căn vào kết xác định gien, nhóm tiên lượng tốt (TEL/AML1) chiếm tỉ lệ 9,5%, nhóm cịn lại chiếm tỉ lệ cao 90,5% Tuy nhiên, nhóm khơng thể xếp loại nhóm tiên lượng khơng tốt chưa loại trừ trường hợp đa bội nhóm Với 90,5% số bệnh nhân lại mang bất thường NST khác đa bội, thiểu bội, đoạn, thêm đoạn chuyển vị NST khác gặp phải cần kết NST đồ Mỗi kỹ thuật có ưu điểm riêng mà kỹ thuật khác thay Kỹ thuật RT-PCR sử dụng để khảo sát riêng lẻ mà phải bổ sung với kỹ thuật NST đồ Cả gien TEL gien AML1 mã hóa cho yếu tố điều hịa phiên mã nhân Tổ hợp gien phá vỡ chức bình thường gien TEL và/ tạo yếu tố ức chế phiên mã, làm suy giảm biểu gien AML1 Tiên lượng nhóm bệnh nhân tốt độc lập với yếu tố nguy chuẩn lâm sàng tuổi số lượng bạch cầu Kết điều trị tốt với tỷ lệ sống khỏi bệnh đến 90% Tổ hợp gien TEL/AML1 có tần suất xuất cao bệnh BCCDL precursor-B thúc đẩy nhiều nhóm nghiên cứu phát triển kỹ thuật RT-PCR định lượng nhằm vào tổ hợp gien để theo dõi tồn lưu tế bào ác tính 1.2.2 Chuyển đoạn t(9;22)(q34;q11) Khoảng 20-30% bệnh nhân BCCDL người lớn có mang NST Ph với tạo thành tổ hợp gien BCR/ABL mã hóa cho protein BCR/ABL có trọng lượng phân tử 190 kDa gọi P190 BCR/ABL Tỷ lệ chí lên đến 50% nhóm bệnh nhân 50 tuổi BCR/ABL fusion protein dẫn đến kích hoạt tyrosine kinase mà đóng vai trị trung tâm tiến triển bệnh BCCDL BCMDT mang Ph+ Phát giúp cải thiện đáng kể tiên lượng cho bệnh nhân điều trị thêm thuốc ức chế đặc hiệu hoạt tính ABL imatinib Cũng BCMDT, kháng imatinib xuất thêm đột biến vùng gắn imatinib BCR/ABL thường gặp lâm sàng sau thời gian điều trị Các thuốc ức chế ABL hệ dasatinib, nilotinib hay bosutinib giải pháp thay hiệu có kháng imatinib 1.2.3 Chuyển đoạn t(4;11)(q21;q23) Những nghiên cứu phân tử t(4;11)(q21;q23) liên quan đến gien MLL nằm NST 11 gien AF4 nằm NST Bình thường gien MLL mã hóa cho protein có khả gắn kết DNA có vai trò quan trọng cho hoạt động phiên mã gien liên quan đến q trình biệt hóa Trong chuyển đoạn t(4;11), gien bị chuyển tới gắn với gien AF4 nhiễm sắc thể số 4, làm Kỹ thuật Multiplex PCR giúp phát tổ hợp gien khác tổ hợp gien STIL/TAL1, FUS/ERG, ETV6/MN1 Trong tổ hợp gien STIL/TAL1 thường gặp BCCDL-T Trong nghiên cứu này, phát ca dương tính với tổ hợp gien STIL/TAL1 33 ca BCCDL-T, chiếm tỉ lệ 6,06%, với độ tuổi 10 14 tuổi Kết phù hợp với kết nghiên cứu khác giới cho thấy tổ hợp gien STIL/TAL1 diện khoảng 5-25% BN BCCDL-T trẻ em Cho đến nay, ý nghĩa tiên lượng tổ hợp gien STIL/TAL1 chưa hiểu rõ Tuy nhiên, tổ hợp gien dùng gien đích để theo dõi điều trị thành công Kết nghiên cứu Mansur MB cộng cho thấy BN có mang đột biến gien NOTCH1 đồng thời dương tính với tổ hợp gien STIL/TAL1 có tiên lượng xấu Qua kết nghiên cứu, nhận thấy rằng: sau chẩn đoán xác định BCCDT hay BCCDL, nên sử dụng RT-PCR xác định tổ hợp gien thường gặp BCCDT (AML1/ETO, PML/RARA, CBFB/MYH11, MLL/AF9), BCCDL (TEL/AML1, BCR/ABL, MLL/AF9 E2A/PBX1) Xét nghiệm nên thực thường qui bệnh viện chuyên khoa huyết học, sở để phân nhóm tiên lượng lựa chọn phác đồ điều trị thích hợp 20 kê (p < 0,0001) Điều phù hợp với quần thể nghiên cứu, tủy đồ dấu ấn miễn dịch tế bào phù hợp chặt chẽ với chẩn đốn phân nhóm từ M0 đến M7, với Kappa = 0,751 tính bình thường gien MLL sản phẩm protein khả gắn kết DNA làm cho tế bào khơng biệt hóa Mặc dù với số mẫu khảo sát nhóm bệnh chưa nhiều, chúng tơi xác định có liên hệ hình thái học, dấu ấn miễn dịch đột biến NST Cho đến nay, bất thường NST liên quan chặt chẽ với bệnh lý ác tính hệ tạo máu định quan trọng việc chẩn đốn tiên lượng bệnh 4.2.2 Nhóm bệnh bạch cầu cấp dòng lympho Từ 01/10/2009 đến 31/07/2011, khảo sát 179 bệnh nhân (BN) BCCDL chẩn đoán kỹ thuật RT-PCR, phát 17 BN biểu TEL/AML1 (9,5%), 16 BN biểu BCR/ABL (8,9%), BN biểu MLL/AF4 (2,8%), BN biểu E2A/PBX1 (4,5%) Tỉ lệ tổ hợp gien E2A/PBX1, MLL/AF4, BCR/ABL tương đương với nghiên cứu khác; riêng tỉ lệ TEL/AML1 9,5% (17/179) khác biệt Nếu xét nhóm BCCDL 15 tuổi BCCDL-B tỷ lệ BN dương tính với TEL/AML1 11,9% (16/134) 11,6% (17/146) Đây tỷ lệ thấp so với tần xuất thường báo cáo TEL/AML1 BN BCCDL trẻ em 20-25% Tuy nhiên, so sánh với nghiên cứu tương tự tác giả Elia L.; kết chúng tơi phù hợp (11,6% so với 11,4%) Cụ thể, tác giả sử dụng phương pháp Multiplex RT-PCR khảo sát 170 BN BCCDL (70 BN trẻ em 100 BN người lớn) phát 67/170 (39%) BN có mang đột biến gien Trong đó, nhóm BCCDL trẻ em TEL/AML1 chiếm tỷ lệ 11,4% (8/70) Vì vậy, để lý giải cho khác biệt lớn tỷ lệ TEL/AML1 dương tính so với tần suất thường báo cáo giới cần có nghiên cứu sâu quần thể người Việt Nam với cỡ mẫu lớn tập trung vào nhóm BN BCCDL trẻ em Trong nghiên cứu này, với kỹ thuật RT-PCR, chúng tơi phát 46 bệnh nhân có mang kiểu tổ hợp gien thường gặp trên, chiếm tỷ lệ 25,7% giúp phân nhóm tiên lượng Tổ hợp gien MLL/AF4 xác định yếu tố bất lợi bệnh bạch cầu nhũ nhi nhiều nhóm nghiên cứu Chuyển đoạn gắn liền với tiên lượng xấu người lớn, dường tiên lượng cải thiện dùng Ara-C liều cao giai đoạn công bệnh BCCDL người lớn Ở ca trẻ em, có vài ý kiến cho nhóm tuổi khác có tiên lượng khác Bên cạnh đó, theo Young Godley, bệnh nhân BCCDL có chuyển đoạn t(4;11) tiên lượng xấu với tỷ lệ đáp ứng điều trị ban đầu cao thời gian lui bệnh ngắn năm 1.2.4 Chuyển đoạn t(1;19)(q23;p13) Năm 1984, Williams mô tả chuyển đoạn liên quan nhiễm sắc thể 19 t(1;19)(q23;p13) 5% bệnh BCCDL tế bào pre-B, điểm cho trường hợp có nguy cao tái phát hệ thần kinh trung ương Chuyển vị t(1;19) tìm thấy khoảng 5-6% bệnh nhân BCCDL trẻ em khoảng 3% bệnh nhân BCCDL người lớn Tổ hợp gien E2A/PBX1 mã hóa cho yếu tố hoạt hóa phiên mã liên tục (chimeric), gọi oncoprotein (protein gây ung thư) với vùng hoạt hóa phiên mã đầu N gien E2A gắn với vùng homeobox gắn kết DNA đầu C gien PBX1 Từ làm tế bào tăng sinh q mức khơng kiểm sốt Hoạt động biến dạng protein chứng minh ống nghiệm (in vitro), lẫn tế bào sống (in vivo) Bệnh nhân BCCDL có tổ hợp gien tiên lượng xấu đáp ứng với hóa trị liệu Chương 2: Đối tượng phương pháp nghiên cứu 2.1 Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả loạt ca triển khai kỹ thuật 2.2 Đối tượng nghiên cứu 10 2.2.1 Dân số 2.2.1.1 Dân số nghiên cứu: Bệnh nhân chẩn đoán bệnh bạch cầu cấp Bệnh viện Truyền máu Huyết học thành phố Hồ Chí Minh 2.2.1.2 Dân số mục tiêu: Bệnh nhân chẩn đoán bệnh bạch cầu cấp Bệnh viện Truyền máu Huyết học thành phố Hồ Chí Minh hội đủ tiêu chuẩn chọn mẫu, thuộc mẫu chọn thời gian nghiên cứu từ ngày 01 tháng 10 năm 2009 đến 31 tháng 07 năm 2011 2.2.2 Tiêu chuẩn chọn mẫu 2.2.2.1 Tiêu chuẩn nhận vào nghiên cứu: Đối tượng dân số mục tiêu nhận vào nghiên cứu hội đủ điều kiện sau: ♦ Vào thời điểm chẩn đoán: Bệnh nhân chẩn đốn xác định BCC dịng tủy hay lympho tiến hành khảo sát tổ hợp gien lần ♦ Theo dõi điều trị: Tiến hành khảo sát tổ hợp gien bệnh nhân có biểu dương tính lúc chẩn đoán 2.2.2.2 Tiêu chuẩn loại trừ: Đối tượng hội đủ tiêu chuẩn nhận vào nghiên cứu có yếu tố sau bị loại khỏi nghiên cứu: ♦ Bệnh nhân thân nhân không đồng ý tham gia chương trình ♦ Bệnh nhân cũ, điều trị chưa tiến hành xác định gien ♦ Mẫu không đạt chất lượng 2.2.3 Cỡ mẫu: toàn Từ ngày 01/10/2009 đến ngày 31/07/2011, 341 bệnh bạch cầu cấp (162 BCCDT 179 BCCDL) chọn vào nhóm nghiên cứu 19 chuyển đoạn thường gặp bệnh BCCDT, kết tạo thành tổ hợp gien MLL/AF9 Khi khảo sát bất thường thường gặp bệnh BCCDT kỹ thuật RT-PCR, ghi nhận tổ hợp gien MLL/AF9 chiếm tỉ lệ 2,5% Kết tương đương so với tỉ lệ khoảng 2,1% so với báo cáo tác giả Mrozek K cộng Chúng nhận thấy BN dương tính với tổ hợp gien MLL/AF9 có đến BN (75%) có độ tuổi 15 Ngồi ra, có đến số ca (75%) dương tính với tổ hợp gien MLL/AF9 thuộc thể M5 Những kết hoàn toàn phù hợp so với kết nghiên cứu tác giả Swansbury GJ cộng cho thấy BN dương tính với tổ hợp gien MLL/AF9 gặp lứa tuổi có 50% BN 15 tuổi có 75% BN dương tính với MLL/AF9 thuộc thể M5 Ngồi ra, kỹ thuật Multiplex PCR giúp phát thêm tổ hợp gien khác tổ hợp gien Trong phần lớn bất thường liên quan đến gien MLL Do đó, tương lai cần khảo sát đột biến liên quan đến gien nhằm hỗ trợ cho việc phân nhóm tiên lượng Đáng ý phát 01 ca BCCDT-M7 có biểu BCR/ABL mà bình thường tổ hợp gien khơng khảo sát nhóm bệnh BCCDT có tần xuất thấp Theo nhóm nghiên cứu SWOG/ECOG BN BCCDT mang tổ hợp gien xếp vào nhóm tiên lượng xấu Tuy nhiên, kỹ thuật Multiplex PCR đòi hỏi tốn nhiều thời gian công sức phải thực qua hai giai đoạn, giai đoạn hai bước PCR với nhiều cặp mồi Trong nghiên cứu chúng tơi, có mối liên quan chẩn đốn tủy đồ tổ hợp gien (P < 0,0001), cụ thể liên quan có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) chẩn đoán BCCDT thể M2 gien AML1/ETO, thể M3 gien PML/RARA Nói cách khác, tổ hợp gien PML/RARA thường gặp BCCDT thể M3 không gặp BCCDT thể M2 thể khác; tổ hợp gien AML1/ETO thường gặp BCCDT thể M2, phù hợp với kết tác giả Rowe D cộng Điều góp phần cho hướng chẩn đốn xác thể bệnh BCCDT Tương tự vậy, dấu ấn miễn dịch tế bào tổ hợp gien liên quan có ý nghĩa thống 18 tự so với tác giả C H Pui Trong trường hợp khơng có thống hai kỹ thuật xét nghiệm, cho dấu ấn miễn dịch tế bào có kết luận đáng tin cậy phương pháp phân tích khách quan, phản ánh trung thực dương tính dấu ấn đặc trưng dịng, kết hợp với âm tính dấu ấn thuộc dịng khác Ngồi ra, kết dấu ấn miễn dịch tế bào phụ thuộc vào người đọc khác 4.2 Các tổ hợp gien lúc chẩn đoán Từ ngày 01/10/2009 đến ngày 31/07/2011, 341 bệnh nhân mắc bệnh bạch cầu cấp chọn vào nhóm nghiên cứu để xác định bất thường gien, bao gồm nhóm BCCDT (162 BN, chiếm tỉ lệ 47,5%) nhóm BCCDL (179 BN, chiếm tỉ lệ 52,5%) Các kết trình bày sau theo nhóm bệnh lý: BCCDT BCCDL 11 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Các bước tiến hành: mô tả sơ đồ 2.1 Chẩn đoán BCC BCCDT RT-PCR BCCDL Âm tính Âm tính Multiplex PCR tổ hợp gien Trong nghiên cứu này, với kỹ thuật RT-PCR, chúng tơi phát 41 bệnh nhân có mang kiểu tổ hợp gien thường gặp trên, chiếm tỷ lệ 25,3% giúp phân nhóm tiên lượng bệnh nhân BCCDT Trong đó, nhóm tiên lượng tốt (AML1/ETO, PML/RARA, CBFB/MYH11) chiếm tỉ lệ 22,8%, tỉ lệ tương đương với nghiên cứu United Kingdom Medical Research Council (MRC-10) Nhóm cịn lại chiếm tỉ lệ 77,2% có biểu MLL/AF9 hay không biểu tổ hợp gien số tổ hợp gien khảo sát, nhiên chưa thể loại trừ bất thường nhiễm sắc thể (NST) khác nên khơng xếp vào nhóm tiên lượng trung bình Trong số chuyển đoạn liên quan đến NST 11q23 t(9;11) chuyển đoạn chiếm tỉ lệ cao tổ hợp gien Dương tính 4.2.1 Nhóm bệnh bạch cầu cấp dịng tủy Từ 01/10/2009 đến 31/07/2011, khảo sát 162 bệnh nhân (BN) BCCDT chẩn đốn kỹ thuật RT-PCR, chúng tơi phát 19 BN biểu AML1/ETO (11,7%), 11 BN biểu PML/RARA (6,8%), BN biểu CBFB/MYH11 (4,3%), BN biểu MLL/AF9 (2,5%) RT-PCR Dương tính Định lượng gien Dương tính Sơ đồ 2.1 Các bước tiến hành xác định gien 2.3.2 Mô tả kỹ thuật: Các mẫu thực qua bước sau ♦ Lấy mẫu, vận chuyển mẫu chuẩn bị mẫu ♦ Ly trích RNA ♦ Tổng hợp cDNA ♦ Phản ứng khuếch đại gien Kiểm tra chất lượng cDNA Khảo sát tổ hợp gien BCCDT Khảo sát tổ hợp gien BCCDL ♦ Multiplex PCR Giai đoạn Master PCR 12 Giai đoạn Split – out PCR ♦ PCR định lượng gien (RQ-PCR) Xây dựng đường chuẩn Chuẩn bị mẫu chứng nội Phản ứng PCR định lượng (RQ-PCR) 2.4 Phân tích số liệu ♦ Sử dụng phần mềm vi tính Excell MedCalc 11.6 for Windows để nhập, xử lý phân tích số liệu ♦ Kết trình bày dạng bảng tần số Kết xử lý thống kê trình bày dạng trung vị, tỷ lệ ♦ Đánh giá tương quan phép kiểm Chi bình phương; giá trị p < 0,05 xem có ý nghĩa thống kê Đối với bảng có số liệu < 5, sử dụng phép kiểm Fisher’s exact ♦ Đánh giá phù hợp kỹ thuật chẩn đoán tủy đồ dấu ấn miễn dịch tế bào độ phù hợp Kappa Chương 3: Kết nghiên cứu 3.1 Đặc điểm chung quần thể nghiên cứu Từ ngày 01/10/2009 đến ngày 31/07/2011, 341 bệnh nhân mắc bệnh bạch cầu cấp chọn vào nhóm nghiên cứu để xác định bất thường gien, bao gồm nhóm BCCDT (162 BN, chiếm tỉ lệ 47,5%) nhóm BCCDL (179 BN, chiếm tỉ lệ 52,5%) Trong số này, có 36 BN theo dõi sinh học phân tử Các kết trình bày sau theo nhóm bệnh lý 3.1.1 Nhóm bệnh bạch cầu cấp dòng tủy 162 bệnh nhân BCCDT, chiếm tỉ lệ 47,5% tổng số bạch cầu cấp, xác định tổ hợp gien AML1/ETO, PML/RARA, CBFB/MYH11 MLL/AF9 17 phân biệt dòng B T kỹ thuật dấu ấn miễn dịch tế bào Trong dựa vào dấu ấn miễn dịch tế bào, phân thành nhóm khác nhau: BCCDT, BCCDL-B, BCCDL-T BCC biphenotype Điều cần thiết cho bác sĩ điều trị việc chẩn đoán, chọn lựa phác đồ điều trị tiên lượng bệnh Với bệnh BCCDT, hai phương pháp dấu ấn miễn dịch tế bào tủy đồ có khả phân loại nhóm từ M0 đến M7 Tỉ lệ phù hợp hai phương pháp là: trường hợp M0; trường hợp M1; 81 trường hợp M2; 22 trường hợp M3; 14 trường hợp M4; trường hợp M5 trường hợp M7 Tủy đồ dấu ấn miễn dịch tế bào có phù hợp chặt chẽ với chẩn đốn phân nhóm từ M0 đến M7, với Kappa = 0,751 Đặc biệt đó, trường hợp phân nhóm M3 chẩn đốn xác định dựa vào nhiều xét nghiệm khác nhau: tủy đồ, PCR dấu ấn miễn dịch tế bào Tiêu chuẩn xác định dấu ấn miễn dịch tế bào thường vào HLA.DR âm tính (HLA.DR-) Tuy nhiên, ngày nay, yếu tố định xác BCCDT phân nhóm M3 lại phức hợp PML/RARA (dựa vào PCR) Ở BCCDL, tủy đồ phân BCCDL thành nhóm L1, L2, L3 dựa vào tiêu chuẩn phân loại hình thái Chẩn đốn tủy đồ gồm nhóm chính: L1 (2,2%) L2 (97,8%); khác với nghiên cứu tác giả C H Pui có tỉ lệ L1 cao Có khác biệt phân loại hình thái học theo FAB thường dựa vào chủ quan người đọc tủy đồ khơng có tiêu chuẩn rõ ràng để phân biệt L1 L2 Song phân biệt L1 L2 khơng có ý nghĩa nhiều việc tiên lượng điều trị Trong nghiên cứu chúng tơi, khơng có mối liên quan hình thái tế bào đột biến NST, điều phù hợp tác giả C H Pui Trong đó, kỹ thuật dấu ấn miễn dịch tế bào nhận diện chất tế bào thuộc dòng B hay T, ngồi cịn xác định giai đoạn trưởng thành tế bào Ở nghiên cứu này, phân bố dòng tế bào theo dấu ấn miễn dịch tế bào tập trung dòng lympho B (81,6%), bao gồm thể BCCDL Precursor B, Pro B, common B B Tỷ lệ bệnh nhân có dấu ấn miễn dịch tế bào dòng B chiếm tỷ lệ cao tỷ lệ tương 16 Chương 4: Bàn luận 4.1 Đặc điểm chung quần thể nghiên cứu Từ ngày 01/10/2009 đến ngày 31/07/2011, 341 bệnh nhân mắc bệnh bạch cầu cấp thỏa mãn tiêu chuẩn chọn vào nghiên cứu tiêu chuẩn loại trừ, chọn vào nhóm nghiên cứu để xác định bất thường gien 4.1.1 Phân nhóm bạch cầu cấp theo tuổi giới tính Trong nghiên cứu này, 341 bệnh nhân chia làm nhóm bệnh: 42,8% BCCDL-B; 47,5% BCCDT; 9,6% BCCDL-T Điều phù hợp với nhận định chung dịch tễ học ghi vào y văn giới Nhằm đánh giá biểu tổ hợp gien nhóm bệnh, chúng tơi loại nhóm BCC biphenotype khỏi nghiên cứu, mô tả phần Phương pháp nghiên cứu Mẫu nghiên cứu có tuổi thấp 10 tháng tuổi cao 84 tuổi, thấy tuổi mắc bệnh BCC Tuổi trung vị BCCDT 35,5 tuổi, BCCDL tuổi; nhóm tuổi mắc bệnh BCCDT cao 15 tuổi (chiếm 77,8% nhóm bệnh BCCDT) nhóm tuổi mắc bệnh BCCDL cao 15 tuổi (chiếm 74,9% nhóm bệnh BCCDL) Đối với nhóm BCCDL B T, trẻ em nhiều người lớn với tỉ lệ khoảng 3:1 Ngược lại, nhóm BCCDT, người lớn gặp nhiều trẻ em với tỉ lệ khoảng 4:1 nhận định phù hợp với báo cáo thống kê nước giới từ trước đến 4.1.2 So sánh kết phân nhóm bạch cầu cấp dựa vào dấu ấn miễn dịch tế bào tủy đồ: Khảo sát tủy đồ dấu ấn miễn dịch tế bào thực độc lập, lúc cho kết chẩn đoán phân loại nhóm Theo phân loại hình thái học, ghi nhận có hai nhóm: BCCDL (52,5%) BCCDT (47,5%) Tủy đồ có hạn chế khơng thể 13 Tuổi bệnh nhân đa phần 15 tuổi (77,8%) Tuổi trung vị 35,5 tuổi, giá trị bách phân thứ 25 (25%) 16 giá trị bách phân thứ 75 (75%) 46 Trong đó, tuổi trung vị giới nam 39, giới nữ 31,5 Tỉ lệ nam (51,9%) nữ (48,1%) gần tương đồng nhóm bệnh BCCDT Kết tủy đồ chiếm đa số M2 (61,1%); kế tiếp, M3 (14,2%), M4 (12,3%); tương đồng với kết dấu ấn miễn dịch tế bào M2 (62,5%); kế tiếp, M3 (14,2%), M4 (11,7%) Khảo sát tủy đồ dấu ấn miễn dịch làm độc lập, lúc cho kết chẩn đoán bệnh gần giống dựa vào tỉ lệ tế bào non diện tủy Tỉ lệ phù hợp hai phương pháp là: trường hợp M0; trường hợp M1; 81 trường hợp M2; 22 trường hợp M3; 14 trường hợp M4; trường hợp M5 trường hợp M7 Tủy đồ dấu ấn miễn dịch tế bào có phù hợp chặt chẽ với chẩn đốn phân nhóm từ M0 đến M7, với Kappa = 0,751 3.1.2 Nhóm bệnh bạch cầu cấp dịng lympho 179 bệnh nhân BCCDL, chiếm tỉ lệ 52,5% tổng số bạch cầu cấp, xác định tổ hợp gien E2A/PBX1, MLL/AF4, BCR/ABL, TEL/AML1 Tuổi bệnh nhân đa phần 15 tuổi (74,9%) Tuổi trung vị tuổi, giá trị bách phân thứ 25 (25%) giá trị bách phân thứ 75 (75%) 15,5 Trong đó, tuổi trung vị giới nam 6, giới nữ Tỉ lệ nam (55,9%) cao nữ (44,1%) Tủy đồ phân BCCDL thành nhóm L1, L2, L3 dựa vào tiêu chuẩn phân loại hình thái Kết 97,8% trường hợp BCCDL có hình thái thuộc nhóm L2, 2,2% cịn lại thuộc nhóm L1 Trong đó, kỹ thuật dấu ấn miễn dịch tế bào nhận diện chất tế bào thuộc dịng B hay T, ngồi xác định giai đoạn trưởng thành tế bào Ở nghiên cứu này, phân bố dòng tế bào theo dấu ấn miễn dịch tế bào tập trung dòng lympho B (81,6%), bao gồm thể BCCDL Precursor B, Pro B, common B B 14 3.2 Các tổ hợp gien lúc chẩn đoán Sau tổ hợp gien loại bệnh BCC qua khảo sát kỹ thuật RT-PCR Multiplex PCR lúc chẩn đốn phân nhóm tiên lượng 3.2.1 Nhóm bệnh bạch cầu cấp dịng tủy Qua khảo sát 162 bệnh nhân (BN) BCCDT, 19 BN biểu AML1/ETO (11,7%), 11 BN biểu PML/RARA (6,8%), BN biểu CBFB/MYH11 (4,3%), BN biểu MLL/AF9 (2,5%) Trong đó, nhóm tiên lượng tốt (AML1/ETO, PML/RARA, CBFB/MYH11) chiếm tỉ lệ 22,8%, nhóm cịn lại chiếm tỉ lệ 77,2% 121 trường hợp không biểu gien qua khảo sát RT-PCR thực Multiplex PCR, kết có tất trường hợp phát thêm tổ hợp gien, cịn lại âm tính Đa số trường hợp liên quan đến gien MLL (11q23), trường hợp BCR/ABL1 b3a2: 472 bp, phù hợp với kết kiểm tra lại kỹ thuật FISH Chẩn đoán tủy đồ có liên quan với tổ hợp gien Khảo sát cụ thể mối liên quan thể BCCDT tổ hợp gien, phát liên quan có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) chẩn đoán BCCDT thể M2 gien AML1/ETO,thể M3 gien PML/RARA Tương tự vậy, dấu ấn miễn dịch tế bào tổ hợp gien liên quan có ý nghĩa thống kê (p < 0,0001) 3.2.2 Nhóm bệnh bạch cầu cấp dòng lympho Qua khảo sát 179 bệnh nhân (BN) BCCDL, 17 BN biểu TEL/AML1 (9,5%), 16 BN biểu BCR/ABL (8,9%), BN biểu MLL/AF4 (2,8%), BN biểu E2A/PBX1 (4,5%) Trong đó, nhóm tiên lượng tốt (TEL/AML1) chiếm tỉ lệ 9,5%, nhóm cịn lại chiếm tỉ lệ cao 90,5% 133 trường hợp không biểu gien qua khảo sát RT-PCR thực Multiplex PCR, kết có tất trường hợp phát thêm tổ hợp gien, cịn lại âm tính 15 Đặc biệt, phát trường hợp biểu gien STIL/TAL1 Sự tương quan tuổi tổ hợp gien có ý nghĩa thống kê với p = 0,011 Khảo sát nhóm tuổi tổ hợp gien BCR/ABL tương quan có ý nghĩa thống kê với p = 0,0015 Sự tương quan khơng có ý nghĩa thống kê giới tính tổ hợp gien (p = 0,0686); nhiên, giới tính tổ hợp gien BCR/ABL có ý nghĩa thống kê (p = 0,0192) 3.3 Theo dõi điều trị kỹ thuật RT-PCR Số lượng bệnh nhân tham gia vào giai đoạn đánh giá tổ hợp gien sau điều trị 36 người, chiếm 10% so với lúc chẩn đoán (341 người) Trong tổng số 49 trường hợp BCCDT có biểu gien lúc chẩn đốn, 13 trường hợp theo dõi sinh học phân tử, trường hợp (53,9%) biểu gien bất thường lui bệnh hoàn toàn sau điều trị công Trong tổng số 52 trường hợp BCCDL có biểu gien lúc chẩn đốn, 23 trường hợp theo dõi sinh học phân tử, trường hợp (34,8%) biểu gien bất thường lui bệnh hồn tồn sau điều trị cơng 3.4 Triển khai kỹ thuật PCR định lượng theo dõi điều trị 3.4.1 Điều kiện xây dựng đường chuẩn Chúng xây dựng thành công đường chuẩn cho chứng nội (gien ABL), mẫu chuẩn tổ hợp gien minor BCR/ABL, TEL/AML1 3.4.2 Kết theo dõi đáp ứng điều trị phương pháp RQ-PCR Với điều kiện PCR định lượng thiết lập, khảo sát mức độ biểu tổ hợp gien minor BCR/ABL, TEL/AML1 qua giai đoạn điều trị 04 bệnh nhân chẩn đoán BCCDL-B thỏa mãn điều kiện chọn mẫu  ... dụng kỹ thuật RQ-PCR xét nghiệm thường qui khoa huyết học Xác định tỷ lệ tổ hợp gien thường gặp lúc chẩn đốn nhóm bệnh bạch cầu cấp dòng tủy Xác định tỷ lệ tổ hợp gien thường gặp lúc chẩn đoán... khảo sát bất thường kỹ thuật FISH, nên phân nhóm tiên lượng bệnh sớm Chính vậy, chúng tơi thực nghiên cứu với mục tiêu tổng quát sau: "Ứng dụng kỹ thuật khuếch đại gien khảo sát tổ hợp gien thường. .. 3.2 Các tổ hợp gien lúc chẩn đoán Sau tổ hợp gien loại bệnh BCC qua khảo sát kỹ thuật RT-PCR Multiplex PCR lúc chẩn đoán phân nhóm tiên lượng 3.2.1 Nhóm bệnh bạch cầu cấp dịng tủy Qua khảo sát