CHƯƠNG MỞ ĐẦU Phospho nguyên tố thiết yếu cho tăng trưởng, phát triển sinh sản động vật Tuy nhiên, có khoảng 60-75% phospho ngũ cốc hạt dầu thức ăn động vật tìm thấy dạng phytate (inositol hexaphosphat) acid phytic (myo-inositol-1,2,3,4,5,6-hexakisphosphoric acid) Động vật dày ngăn gia cầm, lợn cá hấp thụ phospho phytate chúng enzyme phytase đường ruột Do đó, phospho vô thêm vào thức ăn để đáp ứng yêu cầu Ngoài ra, phospho dạng phytate thức ăn không động vật hấp thu bị đào thải phân phospho dư thừa phân bị rửa trôi theo luồng nước thải gây phát triển nhanh chóng tảo ảnh hưởng đến lượng oxy nước, làm cho cá chết Phytase enzyme acid phosphohydrolase, xúc tác thủy phân acid phytic thành phosphate vô dẫn xuất myo-inositol phosphate Hoạt tính phytase vi sinh vật thường tìm thấy nhiều nấm mốc Phytase quan tâm cho ứng dụng công nghệ sinh học, đặc biệt giảm phytate thức ăn nguyên liệu Bổ sung phytase vào nguyên liệu thức ăn chăn nuôi làm tăng giá trị sinh học phosphate, giảm ô nhiễm phospho vùng chăn nuôi tập trung Sự thủy phân acid phytic enzyme không sinh sản phẩm có độc tố Như vậy, khai thác enzyme công nghiệp thân thiện với môi trường hỗ trợ phát triển công nghệ Tuy nhiên, khả ứng dụng enzyme để thương mại hóa không khả thi nhiều năm, hoạt tính thấp giá thành cao sản xuất phytase theo phương pháp lên men truyền thống Để tạo lượng lớn phytase có hoạt tính cao, ổn định, không gây độc tố, có khả áp dụng sản xuất công nghiệp, nhà nghiên cứu tiến hành nghiên cứu tạo dòng gen phytase từ vi sinh vật vào vector biểu biến nạp vào hệ thống biểu chủ Trong hệ thống biểu Pichia pastoris xem có nhiều ưu việc biểu enzyme phytase tái tổ hợp với suất cao có khả chịu nhiệt tốt Do vậy, tiến hành đề tài với mục đích tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp phytase từ chủng nấm men Pichia pastoris GS115 tái tổ hợp mang gen phyAI mã hóa cho enzyme phytase Aspergillus ficuum Nội dung nghiên cứu đề tài:  Kiểm tra khả sinh tổng hợp phytase tái tổ hợp nấm men Pichia pastoris GS115-phyAI  Tối ưu hóa điều kiện lên men cho trình sản xuất phytase tái tổ hợp:  Khảo sát môi trường sản xuất phytase thích hợp cho Pichia pastoris GS115  Khảo sát tỉ lệ giống thời gian sản xuất tối ưu cho trình sản xuất phytase  Khảo sát ảnh hưởng việc bổ sung khoáng vào môi trường sản xuất phytase  Khảo sát nguồn cacbon nồng độ glucose thích hợp  Khảo sát nguồn nitơ thích hợp  So sánh khả lên men sản xuất phytase nấm men Pichia pastoris GS115 theo phương pháp nuôi cấy máy lắc bình lên men có cánh khuấy  Định lượng protein theo phương pháp Bradford  Điện di SDS-PAGE sản phẩm enzyme thu nhận CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 ACID PHYTIC 2.1.1 Giới thiệu Acid phytic acid hữu có danh pháp quốc tế myo-inositol (1,2,3,4,5,6) hexakisphosphoric acid Muối acid phytic đuợc gọi phytate tìm thấy thực vật, động vật đất Phytate thường tìm thấy loại hạt, ngũ cốc đậu chiếm khoảng 0,5-5% khối lượng hạt Nó thường tìm thấy hạt dạng muối Ca Mg không tan (được gọi phytin) Ở ngũ cốc hạt có dầu, phytate dạng dự trữ phospho inositol, chiếm 80% tổng lượng hợp chất có chứa phospho hạt Với cấu trúc ổn định, điều kiện thường acid phytic dễ dàng liên kết với Ca2+, Mg2+, Fe2+ Zn 2+ Ngoài ra, acid phytic có khả liên kết hình thành phức chất với acid amin protein, điều gây cản trở làm giảm khả hấp thụ chất dinh dưỡng người động vật 1, 4 Hình 2.1 Acid phytic phức hợp tồn thực vật (Thompson, 1986 Kies, 1998) 2.1.2 Nguồn gốc tự nhiên Phytic acid tìm thấy hầu hết loại hạt, ngũ cốc đậu Những nguồn giàu acid phytic cám lúa mì hạt lanh (3%) Phân bố phytate hạt thay đổi tuỳ loài Khoảng 90% phytate hạt bắp nằm phần nhân hạt Trong đó, lúa gạo lúa mì, hầu hết phytate lớp vỏ cám bên Trong hạt lấy dầu hạt họ đậu, phytate thường dạng kết hợp với protein chứa túi nhỏ nằm rải rác nhân hạt Ngược lại đậu nành, phytate không tập trung phân bố vị trí định Bên cạnh đó, hàm lượng phospho có đất ảnh hưởng đến hàm lượng phytate có hạt Đất giàu phospho hàm lượng phytate hạt cao Bảng 2.1 Hàm lượng phospho phytate số trồng 17 Tỷ lệ % phospho Hàm lượng Hàm lượng phospho tổng phospho số (%) phytate (%) Đậu hà lan 0,48 0,24 50 Đậu nành 0,61-0,65 0,39 60-61 Hạt cải 1,18 0,70 59 Hạt hướng dương 1,16 0,89 77 Bắp 0,26-0,33 0,24 66-72 Lúa mạch 0,34-0,42 0,27 56-64 0,35 0,27 77 Nguồn Gạo phytate so với hàm lượng phospho tổng Ở động vật, phytate có mô, quan Trong thể người acid phytic giữ chức dự trữ phosphate Nó đuợc phân giải phytase tạo thành phosphate myo-inositol thể hấp thụ 1, 4, 18 2.1.3 Cấu trúc tính chất hoá học 2.1.3.1 Cấu trúc Phytic acid có công thức tống quát C6H18O24P6 Nó tồn dạng lập thể khác xác định thực nghiệm  Dạng cấu trúc tripyrophosphate bất đối xứng  Dạng cấu trúc hexa-orthophosphate đối xứng 1 Hình 2.2 Acid phytic 21 2.1.3.2 Tính chất hoá học Acid phytic có cấu trúc hoá học ổn định Do mang nhiều nhóm acid phosphoric nên tích điện âm cao tồn phổ pH rộng Vì tích điện âm nên acid phytic gắn chặt với cation kim loại như: Ca2+, Mg2+, Zn2+, Mn2+, Fe2+, K+, tạo thành muối không tan Một cation kim loại gắn với nhiều nhóm phosphate có phân tử phytate gắn với nhóm phosphate thuộc nhiều phân tử khác Muối phytate tồn dạng không liên kết với kim loại tạo phức hợp với kim loại tùy thuộc vào pH nồng độ ion dung dịch Ở pH thấp, phytate có khả hòa tan tốt pH cao Lý pH acid, phytate dạng không liên kết với ion kim loại proton hoá nhóm acid phosphoric phân tử phytate Ngược lại pH trung tính, nhóm phosphate phytate bị khử proton nên tăng lực với cation kim loại hoá trị hai Do đó, phytate hình thành phức hợp với cation kim loại hoá trị hai, chủ yếu Mg2+ Ca2+ Các nhóm acid phosphoric phytate có khả kết hợp với nhóm mang điện tích dương protein, amino acid, tinh bột, lipid Tương tác phytate với protein phụ thuộc vào pH Ở giá trị pH điểm đẳng điện protein, nhóm phosphate tích điện âm phytate gắn chặt với nhóm tích điện dương protein tạo phức hợp không tan Những phức hợp phytate-protein bị phá vỡ tác động cạnh tranh cation kim loại hoá trị Ở giá trị pH nằm điểm đẳng điện phytate protein, protein phytate tích điện âm Nhưng có diện cation kim loại đa hoá trị, phức hợp tan protein-cation kim loại-phytate tạo thành Những phức hợp bị phá vỡ lực ion mạnh, pH cao (>10) 1, 18 2.1.4 Chức 2.1.4.1 Chức sinh lý Trong loại hạt, acid phytic đóng vai trò như:  Nguồn dự trữ phospho  Nguồn dự trữ luợng  Nguồn cation  Nguồn myo-inositol  Chất khởi động trình nảy mầm hạt Trong thể người động vật, acid phytic giúp tăng cường trình điều hoà trao đổi chất, kích thích tạo máu, tăng vận chuyển hemoglobin oxygen hỗ trợ trình hình thành mô xương 1 2.1.4.2 Tác động kháng dưỡng Nhiều nghiên cứu cho thấy phytic acid thức ăn gia súc có ảnh hưởng kháng dưỡng mạnh số lý sau:  Động vật dày ngăn thiếu enzyme phân giải phytate sử dụng phospho có phytate  Vì nhóm acid phosphoric mang điện tích âm nên gắn chặt với cation như: Ca2+, Mg2+, Zn 2+, Mn2+, Fe2+, K+, tạo thành muối không tan làm ảnh hưởng đến khả hấp thụ tiêu hóa chất khoáng động vật làm giảm nguồn cung cấp sinh học khoáng  Nhóm acid phosphoric phytate gắn kết với nhóm protein, amino acid, tinh bột lipid có thức ăn làm giảm khả hoà tan chất ảnh hưởng lên khả tiêu hoá chất  Các nhóm acid phosphoric gắn với protein thể như: amylase, pepsin, trypsin acid phosphorylase để làm giảm hoạt tính enzyme ảnh hưởng lên khả sử dụng chất dinh dưỡng 1, 4, 18 2.1.5 Các biện pháp giảm thiểu tác động bất lợi phytic acid Để giải bất lợi gây phytate chăn nuôi, nhiều phương pháp đề nghị:  Ngâm hạt ngũ cốc nước trước cho ăn Đây biện pháp đơn giản số nông dân áp dụng Việc ngâm thức ăn nước giúp hoạt hoá phytase, số enzyme tự nhiên có hạt Enzyme phân giải phytate, giải phóng phospho vô Phương pháp tương tự với phương pháp ngâm hạt giống để kích thích việc nảy mầm hạt dùng nông nghiệp.Tuy nhiên phương pháp tỏ không đáng tin cậy không khả thi thực qui mô chăn nuôi lớn  Tạo dòng loại ngũ cốc có hàm lượng enzyme phytase cao Phương pháp xem có nhiều hứa hẹn Tuy nhiên đòi hỏi nhiều thời gian nghiên cứu thêm  Tạo dòng loại ngũ cốc có hàm lượng acid phytic thấp nhờ giảm thiểu tác động lên môi trường Tuy nhiên lại cần phải bổ sung thêm phospho vào thức ăn vật nuôi Bên cạnh đó, hạt giống cần có acid phytic để nảy mầm phát triển khỏe mạnh Nghiên cứu bắp cho thấy hạt có hàm lượng acid phytic 75% trung bình phát triển cho suất từ 5-15% sản lượng trung bình  Tạo dòng gia súc, gia cầm có khả tự tổng hợp phytase Một số nhà nghiên cứu Canada tạo giống lợn biến đổi gen Enviro có khả tự tổng hợp enzyme phytase tuyến nuớc bọt Giống lợn Enviro có mang gen mã hoá cho phytase tạo dòng từ chủng E.coli không gây bệnh Thí nghiệm cho thấy lượng phytate chất thải lợn giảm 75% so với lợn bình thường Tuy nhiên việc đưa giống lợn ứng dụng sản xuất nhiều khó khăn  Một phương pháp khác thêm enzyme phytase tái tổ hợp vào thức ăn Đây xem phương pháp phổ biến Việc bổ sung phytase vào thức ăn giúp giải phóng phospho khỏi phytic acid, loại bỏ ảnh hưởng kháng dưỡng acid phytic, nhờ kích thích tăng trưởng vật nuôi không cần bổ sung thêm phospho vào thức ăn Giúp giảm đáng kể chi phí sản xuất giải tác động có hại lên môi trường Phytase thương mại thường sản xuất nhờ lên men chủng Aspergillus niger, A.ficuum A.oryzae Hiện nhiều nghiên cứu tập trung vào việc biểu phytase hệ thống biểu Pichia pastoris thu thành công đáng kể 1, 15 2.2 ENZYME PHYTASE 2.2.1 Khái quát Phytase (myo-inositol (1,2,3,4,5,6) hexakisphosphate phosphohydrolase) enzyme phosphatase đặc hiệu cho phytate, xúc tác cho phản ứng thủy giải liên kết monophosphoester acid phytic muối phytate, giải phóng acid phosphoric, myo-inositol dẫn xuất Hiện nay, nghiên cứu tập trung vào việc tạo dòng, sản xuất enzyme mức độ thương mại, đặc biệt phytase có nguồn gốc vi sinh vật thích hợp cho sản xuất quy mô công nghiệp 1 2.2.2 Lịch sử nghiên cứu phytase 1903 – Posternak: mô tả acid phytic 1907 – Suzuki cộng sự: mô tả tách chiết phytase từ cám gạo 1911 – Dox Golden: tìm phytase Aspergilli 1913 – Plimmer Anderson: xác định phức hợp phospho hữu nguyên liệu thực vật 1914 – Anderson: xác định cấu trúc acid phytic 1959 – Casida: tìm 20 chủng nấm mốc từ đất có hoạt tính phytase 1962-1971: Tổ chức Khoáng sản hóa học quốc tế, bước đầu thử nghiệm thương mại hóa phytase 1967 – Ware Shieh: nhận phát minh acid phytic 1968 – Ware Shieh: phân lập 2000 chủng có hoạt tính phytase Phân lập Aspergilluc niger NRRL 3135 A.ficuum thu nhận gen phyA phyB có hiệu suất cao so với báo cáo trước đó, chủng có biến đổi di truyền 1971 – Nelson cộng sự: cho ăn bổ sung trực tiếp phytase từ A.niger NRRL 3135 gà bữa ăn thử nghiệm có hàm lượng định 1984 – Dịch vụ nghiên cứu nông nghiệp Trung tâm nghiên cứu phía nam, phận nông nghiệp Hoa Kỳ, bắt đầu nghiên cứu phytase 1988 – Ullah: tinh sạch, mô tả xác định thành phần, trình tự amino acid gen phyA thu nhận từ A niger NRRL 3135 1990 – Simons cộng sự: chứng minh hiệu phytase gà heo 1993 – Ehrlich cộng sự: tạo dòng gen phyB, mã hóa cho enzyme acid phosphatase pH 6,0, từ A.niger NRRL 3135 1993 – Pen cộng sự: cho biểu gen phyA từ nấm mốc, mã hóa cho phytase, vào tobacco 1994 – Ullah cộng sự: tạo dòng gen, từ A.niger NRRL 3135, mã hóa cho enzyme acid phosphatase pH 6,0 1993 – Beudeker Pen: cho biểu gen phyA từ nấm mốc, mã hóa cho phytase, vào Canoda (Brassica napus) 1 2.2.3 Phân loại 2.2.3.1 Dựa vị trí nhóm phospho bị enzyme tác động Theo tổ chức Sinh hóa Sinh học phân tử quốc tế (IUBMB), tổ chức định danh sinh hóa (JCBN), enzyme phytase phân thành hai nhóm dựa vào vị trí nhóm phospho bị enzyme tác động:  EC 3.1.3.8 Tên thường gọi: 3-phytase Tên hệ thống: Myo-inositol-hexakisphosphate 3-phosphohydrolase Các tên khác: Phytase, phytate 3-phosphatase Enzyme phân giải nhóm phosphate myo-inositol-hexakisphosphate vị trí D-3 trước tiên tạo sản phẩm 1D-myo-inositol 1,2,4,5,6-pentakisphosphate phosphate tự Phytase có nguồn gốc từ nấm vi khuẩn thường thuộc nhóm  EC 3.1.3.26 Tên thường gọi: 6-phytase Tên hệ thống: Myo-inositol-hexakisphosphate 6-phosphohydrolase Các tên khác: Phytase, phytate 6-phosphatase, 4-phytase Enzyme phân giải nhóm phosphate vị trí L-6 trước tiên tạo sản phẩm 1Lmyo-inositol 1,2,3,4,5-pentakisphosphate phosphate tự do, tác động vào nối monophosphoester vị trí D-4 tạo sản phẩm 1D-myo-inositol 1,2,3,5,6pentakisphosphate Do enzyme có tên gọi khác 4-phytase 6-phytase có nguồn gốc từ thực vật 1, 5, 17 2.2.3.2 Dựa pH tối ưu Phytase chia làm loại:  Acid phytase: chủ yếu enzyme có nguồn gốc vi sinh vật với pH tối ưu khoảng 4,5-6,0  Alkaline phytase: chủ yếu enzyme có nguồn gốc thực vật hạt, phấn hoa, enzyme ruột chuột với khoảng pH tối ưu 6,5 5,16 2.2.4 Đặc điểm sinh lý sinh hoá enzyme phytase 2.2.4.1 Cấu tạo trọng lượng phân tử Hầu hết phytase xác định enzyme đơn phân tử, phytase từ vi nấm, E.coli, Bacillus subtilis Tuy nhiên, phytase số động vật thực vật gồm nhiều tiểu đơn vị Như phytase hình thành trình nảy mầm hạt bắp xem enzyme gồm hai tiểu đơn vị có trọng lượng 38 kDa, phytase tinh từ ruột chuột có hai loại phytase kích thuớc 70 90 kDa Hầu hết phytase vi khuẩn có trọng lượng phân tử nhỏ phytase nấm Theo kết nghiên cứu thực nghiệm, phytase nấm có trọng lượng phân tử khoảng 62-128 kDa Ở Aspergillus ficuum, phyA phyAI có trọng lượng phân tử nằm khoảng 85-100 kDa phyB có trọng lượng phân tử khoảng 62-68 kDa 1, 6, 17 2.2.4.2 Nhiệt độ Hầu hết phytase có nhiệt độ tối ưu dao động khoảng 45-60oC Tuy nhiên phytase vi khuẩn có khoảng nhiệt độ rộng (35-63oC) Phytase Aspergillus ficuum có hoạt tính tối ưu 55oC chịu nhiệt độ 70oC 15-30 giây Một số phytase có khả chịu nhiệt 100 oC 20 phút mà 10% hoạt tính so với ban đầu Trong chế biến thức ăn gia súc, phytase cần phải có nhiệt độ tối ưu cao trình kết vón thực phẩm thực 80-100 oC vài giây Một vài nghiên cứu cho thấy dùng kỹ thuật protein để làm tăng tính ổn nhiệt phytase thay proline tạo cầu disulfite dùng kỹ thuật sinh học phân tử để tạo dòng phytase chịu nhiệt từ nấm chịu nhiệt M.thermophila T.thermophilus 1, 5, 6 10 6: thể tích hỗn hợp N: độ pha loãng enzyme v (ml): thể tích dịch enzyme thô đem phản ứng 3.5 Tối ưu hóa điều kiện lên men cho trình sản xuất phytase nấm men Pichia pastoris GS115 3.5.1 Khảo sát môi trường sản xuất phytase thích hợp cho Pichia pastoris Nấm men Pichia pastoris sau nhân giống môi trường BMGY tiến hành ly tâm thu sinh khối, bổ sung giống (tỉ lệ giống 1%) vào hai môi trường sản xuất mBMMHY môi trường BSM Quá trình lên men tiến hành điều kiện to = 27-30oC, pH = 5-6, thời gian lên men 96 Sau 12 bổ sung 1% methanol Thu nhận dịch enzyme thô xác định hoạt tính enzyme 3.5.2 Khảo sát tỉ lệ giống thời gian lên men tối ưu cho trình sản xuất phytase Nấm men Pichia pastoris GS115 hoạt hóa môi trường YBD, sau 24 chuyển vào môi trường nhân giống BMGY với tỉ lệ khác nhau: 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, nuôi cấy lắc 24 giờ, sau ly tâm thu sinh khối chuyển vào môi trường BSM Thu nhận mẫu enzyme (5 ml) sau 24 đem xác định hoạt tính phytase Tiến hành khảo sát 24-48-72-96-120 Xác định mật độ tế bào nấm men tỉ lệ giống 1%, 2%, 3%, 4%, 5% phương pháp đếm khuẩn lạc trình bày mục 3.4.1 3.5.3 Khảo sát ảnh hưởng việc bổ sung khoáng vào môi trường sản xuất phytase Khảo sát ảnh hưởng khoáng bổ sung vào môi trường sản xuất phytase (thành phần dung dịch khoáng giới thiệu mục 3.2.2.2) tiến hành sau: 45 M1 M2 M3 M4 Môi trường Môi trường BSM Môi trường BSM có Môi trường BSM BSM không bổ có bổ sung khoáng bổ sung khoáng có bổ sung khoáng sung khoáng sau bổ sung (sau 12 giờ) (sau 24 giờ) giống vào môi trường 3.5.4 Khảo sát nguồn cacbon nồng độ glucose thích hợp 3.5.4.1 Khảo sát nguồn cacbon thích hợp Trong môi trường BSM sử dụng nguồn cacbon glucose glycerol (Hang cs, 2008) Vì thí nghiệm khảo sát nguồn cacbon tiến hành môi trường BSM thay nguồn cacbon: glucose (45 g/l), glycerol (400 g/l) Quá trình lên men tiến hành điều kiện to = 27-30oC, pH = 5-6, thời gian lên men 96 Sau 12 bổ sung 1% methanol Thu nhận dịch enzyme thô xác định hoạt tính enzyme 3.5.4.2 Khảo sát nồng độ glucose thích hợp Nồng độ glucose môi trường BSM sử dụng 45 g/l 20 g/l (Hang cs, 2008) Do khảo sát nồng độ glucose tiến hành môi trường BSM với nồng độ: 20 g/l, 45 g/l Các điều kiện lên men sau: to = 27-30 oC, pH = 5-6, thời gian lên men 96 Sau 12 bổ sung 1% methanol Thu nhận dịch enzyme thô xác định hoạt tính enzyme 3.5.5 Khảo sát nguồn nitơ thích hợp Nguồn nitơ môi trường BSM (NH4))2SO4 (2%) thay nguồn nitơ khác: CH3COONH4, NaNO3, NH4H2PO4, beef extract, malt extract, peptone, tryptone, urê, yeast extract Quá trình lên men tiến hành điều kiện to = 27-30 oC, pH = 5-6, thời gian lên men 96 Sau 12 bổ sung 1% methanol Thu nhận dịch enzyme thô xác định hoạt tính enzyme 46 3.5.6 So sánh khả lên men sản xuất phytase nấm men Pichia pastoris GS115 theo phương pháp nuôi cấy máy lắc bình lên men có cánh khuấy Giống nấm men sau nhân giống ly tâm thu sinh khối, bổ sung giống vào môi trường BSM với tỉ lệ giống 5% Quá trình lên men sản xuất phytase tiến hành máy lắc (250 vòng/phút) bình lên men có cánh khuấy (tốc độ cánh khuấy 1143 vòng/phút) Các điều kiện lên men sau: to = 27-30oC, pH = 5-6, thời gian lên men 96 Sau 12 bổ sung 1% methanol Thu nhận mẫu enzyme (5 ml) sau 24 đem xác định hoạt tính phytase Tiến hành khảo sát 24-48-72-96 47 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kiểm tra khả sinh tổng hợp phytase tái tổ hợp nấm men Pichia pastoris GS115-phyAI 4.1.1 Dựa khả phân giải canxi phytate Nấm men Pichia pastoris nuôi cấy môi trường MM-canxi phytate có bổ sung methanol, ủ 37oC Sau ngày, môi trường MM-canxi phytate xuất vòng phân giải suốt xung quanh khuẩn lạc Kết thu trình bày Hình 4.1 A B Hình 4.1 Khả phân giải canxi phytate nấm men Pichia pastoris GS115-phyAI đó: A Môi trường MM-Canxi phytate B GS115/phyAI Nhận xét Kết cho thấy chủng Pichia pastoris GS115 tái tổ hợp có mang gen phyAI mã hóa cho enzyme phytase Aspergillus ficuum giữ khả sinh tổng hợp phytase 4.1.2 Kiểm tra biểu enzyme phytase điện di SDS-PAGE Dịch enzyme thô thu nhận sau trình lên men tiến hành chạy điện di để xác định diện phytase Nấm men Pichia pastoris sinh lượng nhỏ protein nó, nên dịch môi trường thu chứa chủ yếu thành phần protein mục tiêu Kết điện di thu trình bày Hình 4.2 48 KDa 97,4 66,2 45,0 Phytase tái tổ hợp /phyAI 31,0 21,5 14,4 Hình 4.2 Kết kiểm tra biểu enzyme phytase điện di gel SDS-PAGE Giếng 1: Thang chuẩn protein Giếng 2: Phytase tái tổ hợp dạng thương mại Giếng 3: Dịch enzyme thô Giếng 4: Dịch enzyme thô Giếng 5: Dịch enzyme thô Giếng 6: Enzyme sau tủa cồn Giếng 7: Enzyme sau tủa cồn Tiến hành tính Rf LgM protein chuẩn, thu kết sau: Bảng 4.1 Kết Rf tương ứng với LgM protein chuẩn M (kDa) 97,40 66,20 45,00 31,00 21,50 14,40 LgM 1,99 1,82 1,65 1,49 1,33 1,16 Rf (cm) 0,09 0,18 0,27 0,40 0,64 0,89 49 y = -0.9887x + 1.9807 R = 0.9463 LgM protein chuẩn(KDa) 2.50 2.00 1.50 1.00 0.50 0.00 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 Rf (cm) Hình 4.3 Đường chuẩn trọng lượng phân tử protein chuẩn  Tính trọng lượng phân tử phytase tái tổ hợp thu Từ đường chuẩn trọng lượng phân tử protein chuẩn, tính trọng lượng phân tử phytase mẫu thu Bảng 4.2 Trọng lượng phân tử phytase tái tổ hợp thu Mẫu Phytase-PAI R (cm) 1,20 Rf (cm) 0,27 Log10 1,72 M (kDa) 52,13 Nhận xét Dựa vào kết thu có số nhận xét sau:  Vạch protein phytase-PAI tái tổ hợp thu tương ứng với phytase tái tổ hợp thương mại  Trọng lượng phân tử phytase-PAI 52,13 kDa thấp so với trọng lượng phân tử phytase từ gen phyAI (theo Ullah 1996) Theo tài liệu trọng lượng phân tử phytase từ gen phyAI 85-100 kDa Còn theo nghiên cứu tác giả Ullah, Mullaney Dischinger, Jr, 1994, phytase thu từ Aspergillus 50 ficuum NRRL 3135 có trọng lượng phân tử 64,245 kDa Chúng cho rằng, có chênh lệch trọng lượng phân tử do:  Do glycosyl hóa tế bào nấm men Pichia pastoris GS115 tái tổ hợp  Do sai số trình chạy điện di Vì điều kiện để khảo sát nồng độ Acrylamide dùng trình điện di Để có đường chuẩn trọng lượng phân tử protein chuẩn phải chạy điện di theo Acrylamide có nồng độ khác nhau, sau tính giá trị Rf trung bình protein vẽ đường chuẩn tương ứng Rf LgM trọng lượng phân tử protein chuẩn 4.2 Tối ưu hóa điều kiện lên men cho trình sản xuất phytase tái tổ hợp nấm men Pichia pastoris GS115 4.2.1 Khảo sát môi trường sản xuất phytase thích hợp cho Pichia pastoris GS115-phyAI Ở môi trường mBMMHY, hoạt tính phytase thu thấp, nên tiến hành khảo sát môi trường phytase thích hợp cho nấm men Pichia pastoris GS115-phyAI với mục đích thu hoạt tính phytase cao Quá trình lên men tiến hành môi trường mBMMHY BSM Kết thu trình bày Bảng 4.3 Bảng 4.3 Hoạt tính phytase thu hai môi trường mBMMHY BSM Môi trường san xuất Hoạt tính phytase Hàm lượng protein (UI/ml) (mg/ml) mBMMHY 1,32 41,96 BSM 2,57 101,44 Nhận xét Khi cảm ứng biểu môi trường BSM, hoạt tính phytase tăng mạnh so với cảm ứng môi trưởng mBMMHY Qua kết khảo sát môi trường BSM môi trường thích hợp để sản xuất phytase tái tổ hợp chọn làm môi trường sản xuất phytase cho khảo sát 51 4.2.2 Khảo sát tỉ lệ giống thời gian sản xuất tối ưu cho trình sản xuất phytase Tỉ lệ giống bổ sung vào môi trường sản xuất thời gian lên men yếu tố quan trọng trình lên men Thí nghiệm tiến hành với tỉ lệ giống nấm men chuyển từ môi trường hoạt hóa YBD sang môi trường nhân giống BMGY 1%, 2%, 3%, 4%, 5% Sau 24 nhân giống thu sinh khối, bổ sung giống vào môi trường sản xuất BSM Thu nhận mẫu enzyme sau 24, xác định hoạt tính phytase Kết thu trình bày Hình 4.4 Bảng 4.4 Mật độ tế bào nấm men Pichia pastoris sau nhân giống 24 môi trường BMGY Tỉ lệ giống Số lượng tế bào nấm men (CFU/ml) 1% 2% 3% 4% 5% 102,10 184,10 286,108 398,108 490,10 Hoạt tính (UI/ml) 3.00 2.50 2.00 1.50 1.00 0.50 0.00 24 48 72 96 120 Thời gian lên men (giờ) Tỉ lệ giống 1% Tỉ lệ giống 2% Tỉ lệ giống 4% Tỉ lệ giống 5% Tỉ lệ giống 3% Hình 4.4 Khảo sát tỉ lệ giống thời gian thích hợp sản xuất phytase Nhận xét Từ Hình 4.4 cho thấy hoạt tính phytase biến thiên tăng dần theo thời gian lên men đạt giá trị cao 96 giờ, sau 96 hoạt tính phytase giảm Hoạt tính phytase thu cao tỉ lệ giống 5% thời gian lên men 96 52 4.2.3 Khảo sát ảnh hưởng việc bổ sung khoáng vào môi trường sản xuất phytase Khoáng có vai trò quan trọng sinh sản hoạt động sống nấm men Dó đó, tiến hành khảo sát ảnh hưởng việc bổ sung khoáng vào môi trường sản xuất phytase tái tổ hợp Kết thu trình bày Hình 4.5 3.50 2.92 Hoạt tính (UI/ml) 3.00 2.50 2.00 1.34 1.50 0.82 1.00 0.50 0.03 0.00 M1 M2 M3 M4 Thí nghiệm bổ sung khoáng M1: Môi trường BSM không bổ sung khoáng M2: Môi trường BSM có bổ sung khoáng sau bổ sung giống vào môi trường M3: Môi trường BSM bổ sung khoáng (sau 12 bổ sung khoáng lần) M4: Môi trường BSM bổ sung khoáng (sau 24 bổ sung khoáng lần) Hình 4.5 Khảo sát ảnh hưởng việc bổ sung khoáng vào môi trường sản xuất phytase Nhận xét Kết khảo sát cho thấy bổ sung khoáng vào môi trường sản xuất có ảnh hưởng đến trình sản xuất phytase chủng nấm men Pichia pastoris GS115 So với môi trường BSM không bổ sung khoáng (M1) môi trường lại có bổ sung khoáng cho hoạt tính phytase cao hẳn hoạt tính phytase thu môi trường BSM bổ sung khoáng sau 24 (M4) cao 53 So sánh hoạt tính phytase thu từ môi trường M2, M3, M4 chứng tỏ nguồn khoáng bổ sung có ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp phytase chủng Pichia pastoris GS115 Nhưng bổ sung lượng khoáng nhiều làm giảm khả sản xuất phytase nấm men này, hoạt tính phytase môi trường M4 cao môi trường M3 Vậy sau 24 bổ sung khoáng vào môi trường sản xuất thích hợp cho lên men sản xuất phytase 4.2.4 Khảo sát nguồn cacbon nồng độ glucose thích hợp 4.2.4.1 Khảo sát nguồn cacbon thích hợp Tiến hành lên men môi trường BSM có nguồn cacbon khác glucose glycerol Kết thu trình bày Bảng 4.5 Bảng 4.5 Khảo sát nguồn cacbon thích hợp sản xuất phytase Hoạt tính phytase Nguồn cacbon (UI/ml) Hàm lượng protein (mg/ml) Glycerol 1,76 43,22 Glucose 3,14 93,15 Nhận xét Từ kết khảo sát lên men môi trường BSM với nguồn cacbon glucose cho hoạt tính cao môi trường BSM có glycerol làm nguồn cacbon Glucose nguồn cacbon thích hợp cho đa số nấm men sử dung glucose nguồn cacbon dễ hấp thu chuyển hóa 4.2.4.2 Khảo sát nồng độ glucose thích hợp Trong môi trường BSM, khảo sát nguồn cacbon glucose nồng độ: 20g/l 45 g/l Kết thu trình bày Bảng 4.6 Bảng 4.6 Khảo sát nồng độ glucose thích hợp Nồng độ glucose Hoạt tính phytase Hàm lượng protein (g/l) (UI/ml) (mg/ml) 20 2,39 89,58 45 3,20 93,15 Nhận xét 54 Kết cho thấy nồng độ glucose 45 (g/l) cho hoạt tính cao nồng độ glucose 20 (g/l) Kết giống với kết mà nhà nghiên cứu khảo sát (Hang cs, 2008) 4.2.5 Khảo sát nguồn nitơ thích hợp Nấm men Pichia pastoris cảm ứng biểu môi trường BSM có nguồn nitơ thay đổi Kết thu trình bày Hình 4.6 3.50 3.33 3.00 2.66 2.45 Hoạt tính (UI/ml) 2.50 2.21 2.00 1.72 1.52 1.50 1.02 1.00 0.64 0.46 0.50 0.21 0.00 (N H4 SO )2 O aN N N H 4H O 2P CH O O 3C N H4 e be fe ct xt m al xt e t ct on pt e p try n to ur ê as ye ct tra x te Nguồn nitơ Hình 4.6 Khảo sát nguồn nitơ thích hợp sản xuất phytase Nhận xét Kết thí nghiệm cho thấy nuôi cấy nấm men môi trường BSM với nguồn nitơ ammonium acetate (CH3COONH4) hoạt tính phytase cao nguồn nitơ khác Ammonium acetate muối amoni axit hữu nguồn nitơ dễ cho nấm men sử dụng Với nguồn nitơ natri nitrate (NaNO3) cho hoạt tính phytase tương đối cao (2,45 UI/ml) Theo nhiều nghiên cứu nhận định đa số nấm men không đồng hóa nitrat Nhưng có giống Brettanomyses, Hasenula giống Pichia có khả đồng hóa nitrat Theo kết khảo sát nấm men Pichia pastoris đồng hóa tốt nitrat 55 Qua kết trên, ammonium acetate xác định nguồn nitơ thích hợp cho trình lên men sản xuất phytase 4.2.6 So sánh khả lên men sản xuất phytase nấm men Pichia pastoris GS115 theo phương pháp nuôi cấy máy lắc bình lên men có cánh khuấy Thí nghiệm tiến hành dựa điều kiện lên men tối ưu Nấm men nuôi cấy máy lắc (tốc tộ 250 vòng/phút) thiết bị có cánh khuấy (tốc độ cánh khuấy 1143 vòng/phút) Enzyme phytase thu nhận sau 24 Kết thu trình bày Hình 4.7 Hoạt tính (UI/ml) 3.5 2.5 1.5 0.5 124 48 372 Thời gian lê n me n (giờ) Máy lắc 96 Cánh khuấy Hình 4.7 So sánh lên men sản xuất phytase nấm men Pichia pastoris GS115 theo phương pháp nuôi cấy máy lắc bình lên men có cánh khuấy Nhận xét Từ kết thu cho thấy hoạt tính phytase thu từ thiết bị có cánh khuấy trộn cao so với nuôi cấy máy lắc Kết giải thích sau:  Cánh khuấy đảo trộn máy lắc làm tăng khả tiếp xúc chất dinh dưỡng tế bào vi sinh vật Khả tiếp xúc nhiều, khả trao đổi chất mạnh Đồng thời làm tăng khả hòa tan oxy vào môi trường, khí lại lâu dòng chuyển động môi trường, vậy, khả hòa tan oxy từ bọt khí cao 56  Cánh khuấy làm tăng nhanh trình sinh sản nấm men tác động học mà tế bào dễ dàng tách sống độc lập Vì nuôi cấy nấm men Pichia pastoris GS115 bình lên men có cánh khuấy thu hoạt tính phytase cao so với nuôi cấy máy lắc 4.3 Thảo luận chung Qua kết khảo sát so sánh với báo cáo Hang cộng (2008) hoạt tính thu thấp tăng cao so với môi trường (mBMMHY) Vì sản xuất phytase tái tổ hợp từ nấm men Pichia pastoris GS115, có kết luận sau đây:  Môi trường BSM thích hợp cho trình sản xuất phytase  Tỉ lệ giống 5% thời gian lên men ngày thích hợp cho trình sản xuất phytase  Thời gian bổ sung khoáng thích hợp sau 24 bổ sung lần  Glucose, ammonium acetate nguồn cacbon, nguồn nitơ thích hợp 57 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Dựa khả phân giải canxi phytate môi trường MM phương pháp điện di gel SDS-PAGE, nấm men Pichia pastoris GS115-phyAI giữ khả sinh tổng hợp enzyme phytase Khảo sát điều kiện tối ưu cho trình lên men sản xuất phytase chủng Pichia pastoris GS115-phyAI:  Môi trường BSM môi trường sản xuất thích hợp cho sinh tổng hợp phytase tái tổ hợp cho hoạt tính phytase (2,57 UI/ml) cao gấp 2,5 lần so với môi trường mBMMHY  Điều kiện lên men sản xuất phytase tái tổ hợp chủng nấm men Pichia pastoris GS115-phyAI: tỉ lệ giống 5%, pH = 5-6, nhiệt độ 27-30 oC, thời gian lên men 96  Khoáng có ảnh hưởng đến sinh tổng hợp phytase Pichia pastoris GS115-phyAI Khoáng bổ sung vào môi trường sản xuất sau 24 thích hợp  So với glycerol glucose nguồn cacbon thích hợp sử dụng môi trường BSM để cảm ứng sinh tổng hợp phytase (3,14 UI/ml)  Ammonium acetate (CH3COONH4) nguồn nitơ thích hợp chọn cho trình lên men sản xuất phytase tái tổ hợp cho hoạt tính phytase cao (3,33 UI/ml)  Nuôi cấy nấm men bình lên men có cánh khuấy cho hoạt tính phytase (3,71 UI/ml) cao so với nuôi cấy nấm men máy lắc 5.2 Đề nghị Do giới hạn thời gian nên đề tài khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp phytase tái tổ hợp nấm men Quá trình lên men sản xuất phytase tái tổ hợp chủng nấm men Pichia pastoris GS115-phyAI cần cải thiện nhiều để tăng hoạt tính phytase lên gấp nhiều lần để ứng dụng sản xuất công nghiệp thương mại Do đó, số đề nghị đưa sau : 58  Khảo sát tốc độ khuấy trộn cánh khuấy nhiều tốc độ khác  Tiếp tục nghiên cứu điều kiện tối ưu môi trường cảm ứng BSM như: nhiệt độ, pH, …  Khảo sát thêm môi trường cảm ứng biểu phytase cao  Nghiên cứu thử nghiệm tác dụng chế phẩm enzyme phytase thu nhận bổ sung vào thành phần thức ăn cho vật nuôi gia cầm, cá, heo,… từ ứng dụng vào sản xuất quy mô công nghiệp, thương mại hóa sản phẩm  Nghiên cứu quy trình tinh phytase từ môi trường cảm ứng 59 [...]... nấm men Pichia pastoris GS115 được kiểm tra khả năng sinh tổng hợp phytase dựa trên khả năng phân giải canxi phytate Sau khi lên men sản xuất phytase tái tổ hợp, thu dịch enzyme, tiến hành chạy điện di trên gel SDS-PAGE Dựa trên kết quả điện di xác định được sự hiện diện và trọng lượng phytase tái tổ hợp 3.3.2.2 Tối ưu hóa các điều kiện lên men cho quá trình sản xuất phytase tái tổ hợp của Pichia pastoris. .. khoáng bổ sung lên sự sinh tổng hợp phytase  Khảo sát nguồn cacbon và nồng độ glucose thích hợp  Khảo sát nguồn nitơ thích hợp  So sánh khả năng lên men sản xuất phytase của nấm men Pichia pastoris GS115 theo phương pháp nuôi cấy trên máy lắc và trong bình lên men có cánh khuấy 35 3.3.3 Qui trình sản xuất phytase tái tổ hợp của chủng nấm men Pichia pastoris GS115 Giống Pichia pastoris Hoạt hóa giống... nghiên cứu Chủng nấm men Pichia pastoris GS115 tái tổ hợp mang gen phyAI mã hóa cho enzyme phytase của Aspergillus ficuum (enzyme thu nhận được gọi là phytase- PAI) Nấm men được cung cấp bởi phòng Vi sinh Ứng dụng, Viện sinh Học nhiệt đới, có kiểu hình Mut+ 33 3.3 Sơ đồ nghiên cứu và qui trình sản xuất phytase tái tổ hợp 3.3.1 Sơ đồ nghiên cứu Kiểm tra khả năng sinh tồng hợp phytase tái tổ hợp của Tối ưu... nấm men Pichia pastoris: men cho quá trình sản xuất Dựa trên khả năng phân giải phytase tái tổ hợp của Pichia canxi phytate và phương pastoris GS115-phyAI pháp điện di trên gel SDSPAGE  Khảo sát môi trường sản xuất phytase thích hợp cho Pichia pastoris  Khảo sát tỉ lệ giống và thời gian sản xuất tối ưu cho quá trình sản xuất phytase  Khảo sát ảnh hưởng của nguồn khoáng bổ sung lên sự sinh tổng hợp. .. tổng hợp phytase  Khảo sát nguồn cacbon và nồng độ glucose thích hợp  Khảo sát nguồn nitơ thích hợp  So sánh khả năng lên men sản xuất phytase của nấm men Pichia pastoris GS115 theo phương pháp nuôi cấy trên máy lắc và trong bình lên men có cánh khuấy Hình 3.1 Sơ đồ nghiên cứu 34 3.3.2 Thuyết minh sơ đồ nghiên cứu 3.3.2.1 Kiểm tra khả năng sinh tồng hợp phytase trong nấm men Pichia pastoris GS115-phyAI. .. không có khả năng sử dụng methanol (Mut-) Ở đề tài này, chúng ta sẽ sinh tổng hợp phytase từ nấm men Pichia pastoris GS115 tái tổ hợp Đây là chủng đã được tạo dòng và biểu hiện thành công mang gen phAI mã hoá cho enzyme phytase của Aspergillus ficuum 11, 14 27 CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện 3.1.1 Địa điểm thực hiện Phòng Vi sinh Ứng dụng, Viện Sinh học... pastoris GS115-phyAI Tiến hành so sánh hoạt tính phytase thu được từ môi trường cơ bản mBMMHY và môi trường BSM để chọn lọc môi trường sản xuất tối ưu cho sự sinh tổng hợp phytase của nấm men Pichia pastoris Dựa trên môi trường sản xuất được chọn lọc, một số thí nghiệm khảo sát được tiến hành:  Khảo sát tỉ lệ giống và thời gian sản xuất tối ưu cho quá trình sản xuất phytase  Khảo sát ảnh hưởng của nguồn... lên men acid lactic sẽ làm giảm hoạt tính của enzyme phytase 2 2.2.8.2 Biểu hiện gen mã hóa phytase trong nấm mốc Gen phyA mã hóa phytase ngoại bào từ nấm mốc chịu nhiệt Thermomyces lanuginosus được gắn chèn và biểu hiện trong vector dưới sự điều khiển phiên mã của promoter gen mã hóa trypsin của Fusarium oxysporum và sử dụng để biến nạp vào chủng tái tổ hợp Fusarium venenatum Phytase tái tổ hợp của. .. 2.6 So sánh khả năng tạo sinh khối giữa Pichia pastoris và Saccharomyces cerevisiae 14  Hệ thống biểu hiện bằng Pichia pastoris cũng được xem là nhanh, dễ thực hiện, có mức độ biểu hiện cao và không quá tốn kém như các hệ thống biểu hiện bằng nuôi cấy tế bào côn trùng và động vật có vú  Pichia pastoris bình thường tổng hợp ít loại protein của bản thân nó Do đó, nếu đưa gen lạ tổng hợp protein mới... cho sự phiên mã với mức độ cao 11, 12, 14 Hinh 2.7 Cơ chế cảm ứng bằng methanol trong nấm men Pichia pastoris. 11 2.3.4 Sự tiết các protein tái tổ hợp Protein tái tổ hợp được sản xuất bởi Pichia pastoris có thể tồn tại nội bào hoặc tiết ra ngoài môi trường Pichia pastoris chỉ tiết một lượng ít protein nội sinh của chính nó, môi trường nuôi cấy không chứa thêm protein nào khác Đây là một thuận lợi ... phytase nấm men Pichia pastoris GS115-phyAI Giống nấm men Pichia pastoris GS115 kiểm tra khả sinh tổng hợp phytase dựa khả phân giải canxi phytate Sau lên men sản xuất phytase tái tổ hợp, thu... xuất phytase tái tổ hợp 3.3.1 Sơ đồ nghiên cứu Kiểm tra khả sinh tồng hợp phytase tái tổ hợp Tối ưu hóa điều kiện lên nấm men Pichia pastoris: men cho trình sản xuất Dựa khả phân giải phytase tái. . .tổng hợp phytase từ chủng nấm men Pichia pastoris GS115 tái tổ hợp mang gen phyAI mã hóa cho enzyme phytase Aspergillus ficuum Nội dung nghiên cứu đề tài:  Kiểm tra khả sinh tổng hợp phytase