BÀI SỐ XÁC ĐNNH SỐ LƯỢNG HỒNG CẦU VÀ BẠCH CẦU I LÝ THUYẾT Sinh lý máu Máu loại mô liên kết bao gồm tế bào lơ lửng khoảng gian bào dịch lỏng Chúng có chức vận chuyển chất tế bào thể mơi trường bên ngồi, đồng thời làm nhiệm vụ bảo vệ thể, điều hòa hoạt động quan, điều hòa thân nhiệt, cân nước muối khống Ngồi máu cịn tham gia vào việc trì ổn định áp suất thNm thấu độ pH dịch thể Cùng với bạch huyết dịch thể khác, máu tạo thành môi trường bên (nội môi) Môi trường có tiêu sinh lý – sinh hóa ổn định đảm bảo cho tồn phát triển hệ thống sống thể Nếu để máu vào ống nghiệm để lắng ly tâm thấy máu phân thành lớp: phía huyết tương màu vàng nhạt chiếm 55% thể tích , phía tế bào máu chiếm 45 % thể tích Trong tế bào máu hồng cầu có số lượng lớn khoảng 99% tổng số, lại phần bạch cầu tiểu cầu (xem hình 1) Hình Cáelements c tế bào 45% máu Cellular Dạng tế bào Chức Số lượng/ µL (mm3) Hng cầu 5–6 triệu Bạch cầu 5,000–10,000 Vận chuyển oxy Bảo vệ, miễn dịch Tế bào lympho Bạch cầu ưa kiềm Bạch cầu ưa acid Bạch cầu trung tính Tiểu cầu Monocyte 250,000− − 400,000 Đông máu 22 II THỰC HÀNH Xác định số lượng hồng cầu Trong thành phần máu, số lượng tế bào máu thay đổi người bình thường điều kiện bình thường Vì vậy, thay đổi số lượng hồng cầu thay đổi số lượng thành phần bạch cầu dấu hiệu cho ta biết trạng thái sinh lý thể Nguyên tắc xác định số lượng hồng cầu: Do lượng hồng cầu máu nhiều nên muốn xác định ta phải pha lỗng, sau đếm thể tích nhỏ, từ tính số lượng thể tích lớn a) Vật liệu cần thiết - Kính hiển vi - Buồng đếm hồng cầu: có nhiều loại thường dùng buồng đếm Neubauer, miếng kính dày hình chữ nhật, mặt có khu vực có kẻ đếm (Hình 2) a) Buồng đếm nhìn thẳng nhìn nghiêng, b) Buồng đếm hồng cầu Neubauer kính hiển vi: đếm hồng cầu ô lớn trung tâm, thường đếm ô trung bình (R); đếm bạch cầu ô lớn góc (W) Hình Buồng đếm hồng cầu Neubauer 23 Dưới kính hiển vi ta thấy cấu tạo buồng đếm hồng cầu sau: Buồng đếm chia thành vng lớn, có diện tích mm2 Ơ sử dụng để đếm hồng cầu, cạnh đường song song, chia thành 25 trung bình, trung bình thành 16 nhỏ Tổng cộng đếm hồng cầu có 400 nhỏ (mỗi có diện tích 1/400 mm2) Bốn góc sử dụng để đếm bạch cầu, ô chia thành 16 ô trung bình Lưu ý ô đếm bạch cầu chia đến trung bình khơng chia nhỏ - Ống trộn hồng cầu: ống thủy tinh có đường kính nhỏ, giống pipette, phần có bầu phình ra, bầu có hạt nhựa vng hạt thủy tinh màu đỏ, sử dụng để trộn hồng cầu với dung dịch pha loãng Ống trộn có khắc vạch đánh số 0,5 – – 101 Các số biểu thị thể tích bên ống trộn, theo thể tích từ đầu ống đến vạch 101 gấp 200 lần so với đoạn từ đầu ống đến vạch 0,5 gấp 100 lần vạch so với đoạn từ đầu ống đến vạch Hình Ống trộn hồng cầu (phải), bạch cầu (trái) - Lamelle - Bơng, cồn 24 - Dung dịch pha lỗng hồng cầu: Dung dịch pha loãng hồng cầu dung dịch đẳng trương chứa chất chống kết dính hồng cầu Có thể dùng dung dịch dung dịch pha loãng đây: Dung dịch Hayem: NaCl (1g), Na2SO4 (5g), HgCl2 (0,5 g), nước cất (200 ml) Dung dịch Ringer: 100 ml có 860 mg NaCl, 30 mg KCl, 35 mg CaCl2 Dung dịch nước muối sinh lý NaCl (9g) , nước cất (1000 ml) b) Cách thực i) Lấy máu: vào buổi sáng thú chưa ăn, vận động - Vị trí lấy máu: tĩnh mạch rìa tai, tĩnh mạch cổ tùy loại thú - Máu kháng đơng hay khơng kháng đơng Nếu lấy máu trực tiếp khơng cần chất kháng đông - Cắt lông chỗ định lấy máu, sát trùng chỗ lấy máu kim chích cồn, bỏ giọt máu đầu, hút giọt thứ nhì chảy Lưu ý để máu chảy tự nhiên không nặn Đặt ống hút nghiêng 300 450 với giọt máu Nếu lấy máu kháng đông ta phải chuNn bị chất kháng đông lọ đựng máu rửa sấy khô Chất kháng đông thường dùng Natri citrate 5% - Hút máu đến vạch 0,5; cột máu liên tục khơng lẫn bọt khí, dùng cồn lau đầu ống hút i) Pha loãng: cho ống hút vào lọ dung dịch pha loãng hồng cầu hút đến vạch 0,5 hút dung dịch pha loãng đến vạch 101 Như vậy, hồng cầu pha loãng 200 lần Trong trường hợp mẫu máu lồi có số lượng hồng cầu thấp hút máu đến vạch dịch pha loãng đến vạch 101 để có độ pha lỗng 100 lần ii) Trộn máu: Bịt kín đầu ống hút ngón ngón lắc ống trộn theo động tác số phút để hồng cầu trộn dung dịch Cũng dùng máy lắc pipette để trộn iii) Cho máu vào buồng đếm đếm: Buồng đếm làm sấy khô Đậy lamelle lên khu vực có kẻ đếm; Đưa buồng đếm lên kính hiển vi, dùng thị kính 10 vật kính 10 điều chỉnh để tìm đếm; Đặt buồng đếm lên mặt phẳng, lắc lại ống hút bỏ vài giọt đầu, sau nhỏ giọt vào khe buồng đếm chỗ kính đậy lên, dung dịch máu theo mao dẫn lan khắp ô đếm; Để yên buồng đếm phút để hồng cầu lắng xuống, sau đưa lên kính hiển vi đếm với vật kính 40; Trên buồng đếm Neubauer: Đếm hồng cầu 25 trung bình khu vực đếm hồng cầu (4 ô bốn góc giữa) Trong trung bình đếm 16 nhỏ Trong nhỏ, đếm tất hồng cầu nằm gọn ô hồng cầu nằm cạnh cạnh trái Như vậy, biết số hồng cầu 80 ô nhỏ (mỗi ô 1/400mm2) Những hồng cầu nằm vạch ngồi đếm tính 1, cịn hồng cầu nằm vạch vạch tính - Mỗi mẫu máu nên đếm lần để tự kiểm chứng khả Hình Quy tắc đếm hồng cầu c) Cách tính Nếu gọi A tổng số hồng cầu đếm 80 nhỏ số hồng cầu buồng đếm máu A x 4.000 x 200 Số HC 1mm3 = -= A x 10.000 x 16 Trong đó: A: số hồng cầu đếm 80 ô 4.000 = 400 x 10 ( 1/400 mm2: diện tích nhỏ; 1/10 mm: chiều cao từ mặt buồng đếm đến lamelle) 200: độ pha loãng mẫu máu d) Rửa dụng cụ - Sau làm xong phải thổi hết dung dịch máu ống trộn hồng cầu rửa nhiều lần HCl 0,1N, nước cất - Rửa buồng đếm nước cất lau nhẹ bơng gịn - Sấy lau khô buồng đếm, ống trộn 26 Xác định số lượng bạch cầu Bạch cầu tế bào có nhân, có hình dạng biến đổi di động Số lượng bạch cầu thay đổi tùy loại phụ thuộc vào điều kiện sinh lý, bệnh lý Ở người bình thường có 7000 BC/mm3 Heo: 20.000 BC/mm3; Trâu: 13.000.mm3; Gà: 30.000 BC/mm3 a) Vật liệu cần thiết Tương tự phần đếm hồng cầu - Buồng đếm Neubauer để đếm bạch cầu ô vng lớn góc có diện tích lớn mm2 Mỗi ô vuông lớn chia thành 16 ô vuông nhỏ - Ống trộn bạch cầu: bầu phình có viên đá nhựa màu trắng, ống có khắc vạch 0,5 – – 11 - Dung dịch pha loãng bạch cầu: dung dịch có tác dụng phá vỡ hồng cầu, dung dịch HCl 1N acid acetic – 3% b) Cách làm - Lấy máu: tương tự - Pha loãng: hút máu đến vạch 0,5 hút dung dịch pha loãng đến 11, bạch cầu pha loãng 20 lần - Trộn máu - ChuNn bị buồng đếm - Cho máu vào buồng đếm - Đếm máu: Trên buồng đếm Neubauer đếm vng góc với tổng số 64 trung bình Cách đếm giống đếm hồng cầu c) Cách tính tốn Nếu gọi B số bạch cầu đếm 64 ô trung bình (4 mm2) số bạch cầu mm3 là: B x 10 x 20 Số bạch cầu mm3 = - = B x 50 Trong đó: B: số bạch cầu đếm 1/10: chiều cao từ buồng đếm đến lamelle 20: độ pha loãng 4: mm3 có 16 trung bình đếm 64 27 d) Rửa dụng cụ - Sau làm xong phải thổi hết dung dịch máu ống trộn hồng cầu rửa nhiều lần HCl 0,1N, nước cất - Rửa buồng đếm nước cất lau nhẹ bơng gịn - Sấy lau khô buồng đếm, ống trộn III BÀI NỘP Mơ tả thí nghiệm kết Ý nghĩa kết phân tích số lượng hồng cầu bạch cầu: cao thấp giá trị trung bình Nêu ứng dụng phương pháp đếm tế bào buồng đếm hồng cầu đối tượng tế bào khác 28 BÀI KHẢO SÁT ENZYME CATALASE TRONG GAN I LÝ THUYẾT Gan quan trung gian tiêu hóa trao đổi chất thể Gan có chức sau đây: - Chức trao đổi chất bao gồm dị hóa đồng hóa: chuyển hóa protein, chuyển hóa carbohydrate, chuyển hóa lipid, chuyển hóa cholesterol - Chức dự trữ: vitamin tan dầu, B12, Fe, dự trữ máu - Chức tiết mật để tiêu hóa chất béo - Chức khử độc: NH3, sắc tố độc porphyrin, purine, thuốc, chất độc từ môi trường kim loại nặng, thuốc trừ sâu, alcohol Hình 1: Cấu tạo gan Quá trình trao đổi chất xảy mạnh mẽ tế bào gan dẫn đến số lượng peroxisome tế bào gan cao H2O2, dạng gốc tự (reactive oxygen species, ROS) sinh trình trao đổi chất bình thường hay bệnh lý phụ phNm độc trình trao đổi chất tế bào phân hủy nhờ catalase – enzyme chủ yếu peroxisome Catalase enzyme thuộc nhóm oxy hóa khử (oxidoreductase, EC 1.11.1.6) Đó hemoprotein, phân tử catalase chứa nguyên tử sắt Catalase xúc 29 tác phản ứng phân hủy hydrogen peroxide (H O ) thành nước oxy theo phương trình sau: 2H O → 2H O + O Catalase có tế bào, đặc biệt gan hồng cầu Đây enzyme thuộc chức giải độc gan hoạt động mạnh Ngồi việc phá hủy hydrogen peroxide, catalase cịn oxy hóa rượu phân tử methanol, ethanol II.THỰC HÀNH Nguyên tắc: Trong sinh viên tách chiết catalase từ gan bị hỗn hợp dung mơi alcohol: chloroform 1:1 kết tủa enzyme ammonium sulfate Cuối hoạt tính catalase xác định qua nồng độ chất sử dụng phản ứng enzyme Muốn vậy, nồng độ H O lại sau phản ứng xác định thời điểm “0” thời điểm “t” phản ứng phương pháp chuNn độ iod lấy hiệu số Để chuNn độ Iod, ta thêm KI vào hỗn hợp phản ứng Trong điều kiện acid, KI chuyển thành HI H O oxy hóa HI thành Iod tự theo phương trình: H+ + KI → HI + K+ H2O2 + 2HI → I2 + H2O Một mol H2O2 giải phóng mol I2 Iod tự chuNn độ sodium thiosulfate với có mặt dung dịch tinh bột làm chất thị màu Khử I thành 2I- l i làm dung dịch màu theo phương trình: 2Na2S2O3 + I2 →2NaI+Na2S4O6 Phương trình tổng quát: H2O2 + 2HI + 2Na2S2O3 → 2NaI+Na2S4O6+ H2O Qua lượng dung dịch sodium thiosulfate sử dụng để chuNn độ, ta tính lượng H2O2 cịn lại thời điểm phản ứng enzyme Vật liệu Gan bị tươi (có thể trữ động lạnh vài ngày) g cho nhóm Cân Cối, chày 30 Bình tam giác 100 ml: Cốc thủy tinh có mỏ 50 ml: Máy ly tâm Ống ly tâm 50 ml Đũa thủy tinh Biuret chuNn độ Pipette Hóa chất: Hỗn hợp dung môi ethanol: chloroform = 1:1 Dung dịch đệm phosphate 0,15 M pH = 7,2 (NH4)2SO4 H2SO4 1M Dung dịch H2O2 10mM đệm phosphate 0,15 M, pH = 7,2 Dung dịch KI 5% Dung dịch ammonium molybdate bão hòa Dung dịch 0,005 M Na2S2O3 Dung dịch tinh bột 0,1% Quy trình thí nghiệm a) Tách chiết catalase từ gan bò: - Cắt g gan bò thành miếng nhỏ, thêm 10 ml nước cất nghiền cối - Chuyển gan nghiền sang bình tam giác, thêm ml hỗn hợp ethanol-chloroform (1:1) lắc mạnh vòng phút - Ly tâm dịch nghiền gan 3000 vòng/min 10 phút - Lấy dịch chứa catalase, đo xác thể tích V Thêm vào dung dịch catalase thu ammonium sulphate (3 g cho 10 ml dung dịch enzyme) Dùng đũa thủy tinh khuấy hịa tan tồn muối - Catalase kết tủa tách ly tâm 3000 vòng/phút 15 phút Loại bỏ dịch - Thêm vào ống ly tâm thể tích đệm phosphate 0,15 M (pH=7,2) thể tích dịch vừa loại bỏ để hịa tan kết tủa Đó dung dịch catalase gốc - Pha loãng dung dịch enzyme gốc 100, 200, 400 lần xác định hoạt tính b) Xác định hoạt tính catalase 31 ChuNn bị bình tam giác 100 ml đánh dấu bình đối chứng (ĐC) bình thí nghiệm (TN) - Cho vào bình tam giác ml H2 O 10 mM pha đệm phosphate - Cho vào bình đối chứng ml H2SO4 1M - Thêm vào bình tam giác ml dung dịch catalase pha loãng (Enzyme bình đối chứng bị bất hoạt từ đầu acid) - Sau phút, thêm vào bình thí nghiệm ml H2SO4 1M để chấm dứt phản ứng enzyme - Thêm vào bình tam giác 1ml KI 5% 0,5 ml dung dịch ammonium molybdate bão hòa, lắc để yên phút - ChuNn độ I2 sinh sodium thiosulfate 0,005M đến thấy màu vàng nhạt Cho vào giọt dung dịch tinh bột 0,1 % thấy màu xanh xuất - T i ế p t ụ c c h u N n đ ộ v i sodium thiosulfate 0,005M c h o đ ế n k h i m ấ t m u hồn tồn Bảng tóm tắt phương pháp xác định hoạt tính enzyme catalase Hóa chất Đối chứng Thí nghiệm ml ml H2SO4 1M ml - Dung dịch enzyme pha ml ml Phản ứng enzyme H2O2 10 mM đệm phosphate pH = 7,2 loãng Phản ứng enzyme phút, nhiệt độ phòng H2SO4 1M - ml Xác định H2O2 lại hỗn hợp phản ứng enzyme KI 5% ml Ammonium molybdate bão giọt 1ml giọt hòa ChuNn độ Na2S2O3 Màu vàng nhạt Màu vàng nhạt 0,005 M Tinh bột 0,1% giọt giọt 32 ChuNn độ tiếp Mất màu xanh phản Mất màu xanh phản Na2S2O3 0,005 M ứng iod – tinh bột ứng iod – tinh bột Thể tích Na2S2O3 0,005 M VĐC = VTN = dùng để chuNn độ c) Tính kết Hoạt tính enzyme đo đơn vị katal (1 mol chất bị phá hủy giây) đơn vị quốc tế U (1 micromol chất bị phá hủy phút) Thí dụ tính tốn hoạt tính catalase: Thể tích Na2S2O3 0,005 M dùng để chuNn độ mẫu đối chứng thí nghiệm VĐC = 16,3 ml VTN = 12,1 ml Như vậy, thời gian phản ứng phút lượng H2O2 bị phân hủy tương ứng (VĐC –VTN) =16,3 – 12,1 = 4,2 ml dung dịch sodium thiosulfate 0,005 M Biết ml sodium thiosulfate 0,005M dùng để chuNn độ tương ứng 2,5 µmol H2O2, vậy, số micromole chất bị phân hủy tính sau: 1,0 ml Na2S2O3 0,005M 4,2 ml Na2S2O3 0,005M X - 2,5 micromol H2O2 X micromol H2O2 = 10,5 micromol H2O2 Để biểu diễn hoạt tính enzyme đơn vị quốc tế, chia số lượng micromole H2O2 bị phân hủy cho số phút thời gian phản ứng Trong trường hợp hoạt tính enzyme catalase dung dịch enzyme pha lõang X = 10,5 micromole: = 2,1 U/ml Để biểu diễn hoạt tính enzyme katal, t ( phút ) chuyển micromole thành mol phút thành giây Hoạt tính dung dịch enzyme gốc = hoạt tính enzyme thí nghiệm x hệ số pha lỗng n = X •n t ( phút ) Để hoạt tính enzyme catalase 1g gan bị, cần tính đến thể tích dung dịch chiết enzyme khối lượng gan bị dùng để tách chiết enzyme (5g) Tóm lại, hoạt tính catalase/ g gan bị A (U) = X • n •V t ( phút ) • m 33 X số micromol H2O2 n = hệ số pha lỗng (ví dụ n = 200) V = thể tích dung dịch chiết enzyme (ml) t = thời gian phản ứng (phút) m= khối lượng gan bò (g) A (U) = 10,5 • 200 • 10 5•5 A = 840 U/g A (katal) = 840 • 10 -6 A(U ) • 10 -6 = = 14 • 10-6 katal/g = 14 • 10-6 katal/(10-3 kg) = 14 • t ( giây ) 60 10-3 katal/ kg III.BÀI NỘP Mơ tả thí nghiệm cách tính tốn với kết hoạt tính theo bảng sau: Đơn vị quốc tế U Katal Hoạt tính catalase mẫu thí nghiệm (đvht/ml) Hoạt tính catalase dung dịch enzyme gốc (đvht/ml) Hoạt tính catalase g gan bị (đvht/g) So sánh họat tính enzyme với hệ số pha lõang khác 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO Evert RF Essau’s Plant Anatomy Third Edition Wiley Interscience 2006 Nguyễn Bá Hình thái học thực vật Nhà xuất giáo dục.2006 Hematology Laboratory: Manual RED Cell Counts CLS 312 The clinical laboratory sciences of the University Mississipi Medical Center cls.umc.edu/COURSES/CLS312/rbcounts.doc Dunn EE, Morgulis S Studies on the catalase and peroxidase activity of the liver cell J Biol Chem 1937 Tauber H, Petit ED Convenient Methods for preparing crystalline catalase from cow liver J Biol Chem 1951 35 PHỤ LỤC Vật liệu thí nghiệm Lá khoai lang Lá lốt Rau tần dày (húng chanh) Thân hoa hồng Cây chanh (Citrus limon) Cây cỏ voi Cây rau muống Cây dâm bụt 36 ... bột làm chất thị màu Khử I thành 2I- l i làm dung dịch màu theo phương trình: 2Na2S2O3 + I2 →2NaI+Na2S4O6 Phương trình tổng quát: H2O2 + 2HI + 2Na2S2O3 → 2NaI+Na2S4O6+ H2O Qua lượng dung dịch sodium... chuNn độ tương ứng 2, 5 µmol H2O2, vậy, số micromole chất bị phân hủy tính sau: 1,0 ml Na2S2O3 0,005M 4 ,2 ml Na2S2O3 0,005M X - 2, 5 micromol H2O2 X micromol H2O2 = 10,5 micromol H2O2 Để biểu diễn... Trong điều kiện acid, KI chuyển thành HI H O oxy hóa HI thành Iod tự theo phương trình: H+ + KI → HI + K+ H2O2 + 2HI → I2 + H2O Một mol H2O2 giải phóng mol I2 Iod tự chuNn độ sodium thiosulfate