BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH VIỆN CƠNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM ĐỀ TÀI: PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN, TÁCH CHIẾT, XÁC ĐỊNH HOẠT HÓA VẢ ỨNG DỤNG ENZYME AMYLASE TRONG NGÀNH CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM NHĨM SINH VIÊN THỰC HIỆN: NHĨM 1 NGUYỄN THANH DIỆU 14085431 TRẦN NGỌC DUYÊN 14071141 TRẦN VĂN HOAN 14027061 LÊ THỊ BẢO NGÂN 14087681 GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN : NGUYỄN THỊ TRANG MÃ HP: 210543202 Thu nhận, tách chiết, xác định hoạt hóa Enzyme Amylase Page LỜI CẢM ƠN Chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến toàn thể Quý thầy cô Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm - Trường Đại học Công nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh thư viện trường tạo điều kiện, giúp đỡ chúng em trình học tập nghiên cứu Đặc biệt, chúng em xin chân thành cảm ơn Nguyễn Thị Trang, người nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ, giải đáp thắc mắc cho chúng em suốt trình học tập nghiên cứu hồn thành tiểu luận Tập thể nhóm Thu nhận, tách chiết, xác định hoạt hóa Enzyme Amylase Page MỤC LỤC GIỚI THIỆU, TỔNG QUAN VỀ ENZYME AMYLASE: 1.1 ENZYME: 1.2 ENZYME AMYLASE: 1.2.1 Khái niệm: 1.2.2 Đặc tính: 1.3 LỊCH SỬ ENZYME AMYLASE: PHÂN LOẠI: 2.1 ENDOAMYLASE (Nội bào): 2.1.1 α-Amylase (α-1,4-glucanohydrolase) (EC 3.2.1.1) 2.1.2 Nhóm Enzyme khử nhánh 2.2 EXOAMYLASE( Ngoại bào): 2.2.1 β-Amylase (EC 3.2.1.2): 2.2.2 γ-Amylase (EC 3.2.1.3): NGUỒN THU NHẬN ENZYME AMYLASE: 3.1 Thu nhận enzyme amylase từ nguồn thực vật: 3.1.1 Malt đại mạch 3.1.2 Lúa 3.2 Thu nhận enzym từ nguồn động vật: 3.2.1 Thu nhận enzyme amylase từ tuyến tụy gà: 3.3 Thu nhận enzym từ nguồn vi sinh vật: 3.3.1 Vai trò giống vi sinh vật công nghệ enzyme 3.3.2 Sản xuất amylase từ Aspergillus oryzae: 3.3.3 Sản xuất amylase từ Bacillus subtilis: TÁCH CHIẾT, TINH CHẾ ENZYME AMYLASE: Thu nhận, tách chiết, xác định hoạt hóa Enzyme Amylase Page 4.1 Tinh Enzyme Amylase phương pháp sắc ký 4.2 Tinh Enzyme Amylase phương pháp điện di gel polyacrylamide (polyacrylamide Gel Electrophoresis – PAGE) XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME AMYLASE: 5.1 Đơn vị đo hoạt độ: 5.2 Xác định hoạt độ Enzyme α-Amylase theo Rukhliadeva: 5.3 Xác định hoạt độ Enzyme glucoamylase ( γ-Amylase) 5.3.1 Phương pháp vi lượng V.Y.Rodzevich, O.P.Korenbiakina 5.3.2 Phương pháp sử dụng Enzyme glucosidase: 5.4 Điều kiện cần đủ để thu nhận chế phẩm Amylase có hoạt lực cao 5.4.1 Chủng giống vi sinh vật: 5.4.2 Môi trường dinh dưỡng: 5.4.3 Điều kiện nuôi cấy ỨNG DỤNG ENZYME AMYLASE: 6.1 Ứng dụng Enzyme amylase y học dược phẩm : 6.2 Ứng dụng Enzyme amylase công nghiệp : 6.2.1 Ứng dụng công nghiệp dệt 6.2.2 Ứng dụng công nghiệp tẩy trắng giấy 6.2.3 Ứng dụng sản xuất cồn 6.3 Ứng dụng công nghiệp thực phẩm: 6.3.1.Ứng dụng Enzyme amylase sản xuất siro sản phẩm chứa đường 6.3.2 Ứng dụng enzyme cơng nghệ sản xuất bánh mì 6.3.3 Ứng dụng enzyme công nghệ sản xuất bánh kẹo 6.3.4 Ứng dụng enzyme công nghệ sản xuất bột 6.3.5 Ứng dụng enzyme công nghệ sản xuất bia TÀI LIỆU THAM KHẢO: Thu nhận, tách chiết, xác định hoạt hóa Enzyme Amylase Page Thu nhận, tách chiết, xác định hoạt hóa Enzyme Amylase Page GIỚI THIỆU, TỔNG QUAN VỀ ENZYME AMYLASE: 1.1 ENZYME: Enzyme hay gọi men chất xúc tác sinh học có thành phần protein, khơng có ý nghĩa cho trình sinh trưởng, sinh sản sinh vật mà cịn đóng vai trị quan trọng công nghệ chế biến thực phẩm, y học, kỹ thuật phân tích, cơng nghệ gen bảo vệ môi trường Trong sống sinh vật xảy nhiều phản ứng hóa học, với hiệu suất cao, điều kiện bình thường nhiệt độ, áp suất, pH Sở dĩ có diện chất xúc tác sinh học gọi chung enzym Như vậy, enzym protein xúc tác phản ứng hóa học Trong phản ứng này, phân tử lúc bắt đầu trình gọi chất, enzym biến đổi chúng thành phân tử khác Tất trình tế bào cần enzym Enzym có tính chọn lọc cao chất 1.2 ENZYME AMYLASE: 1.2.1 Khái niệm: Amylase hệ enzyme phổ biến giới sinh vật Các enzyme thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử nhóm polysaccharide với tham gia nước: RR’ + H-OH RH + R’OH Amylase thủy phân tinh bột, glycogen dextrin thành glucose, maltose,… 1.2.2 Đặc tính: - Thủy phân tinh bột, glycogen dextrin thành glucose,mantose dextrin hạn chế - Enzyme Amylase có nước bọt, dịch tiêu hóa người động vật, hạt nảy mầm,nấm sợi, xạ khuẩn, nấm men vi khuẩn - Dễ tan nước, dung dịch muối rượu loãng 1.3 LỊCH SỬ ENZYME AMYLASE: 1814: Kirchoff, Saint Petercburg chứng minh hạt lúa mạch nảy mầm có tác dụng chuyển hóa tinh bột thành đường nhiệt độ từ 4000C – 6000C 1833: Payen Perso (Pháp) thêm cồn vào dịch chiết này, thu kết tủa có khả phân giải tinh bột thành đường, đặt tên Diastase (xuất phát từ tiếng Hy Lạp, diastatics, có nghĩa phân giải, Amylase) Sau theo đề nghị Duclo, Enzyme phân giải tinh bột gọi Amylase 1851: Leuchs phát nước bọt có khả phân giải tinh bột thành đường Sau đó, Enzyme Amylase nước bọt, dịch tiêu hóa người động vật, hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men vi khuẩn bắt đầu quan tâm nghiên cứu 1862: Danilevxki tách Amylase tuyến tụy phương pháp hấp thụ chọn lọc 1949: Schwimmer xác định số chu chuyển α-Amylase 19000 1950: Englard Singer cho biết số chu chuyển b-Amylase 250000 1952: người ta thu 72 Enzyme trạng thái kết tinh có Enzyme α-Amylase 1971: Uxtinilov cộng phương pháp điện di gel poliacrylamid xác định có mặt lượng lớn α-Amylase glucoamylase canh trường nấm mốc lượng nhỏ phân đoạn có hoạt lực dextrinase transglucosilase PHÂN LOẠI: Hiện nay, có sáu loại Enzyme Amylase xếp vào nhóm: • • Endoamylase ( Enzyme nội bào ) Exoamylase ( Enzyme ngoại bào ) 2.1 ENDOAMYLASE (Nội bào): Gồm có - α-Amylase (EC 3.2.1.1) + Nhóm Enzyme khử nhánh Nhóm chia thành hai loại: • • Khử trực tiếp pullulanase ( hay α-dextrin 6-glucanohydrolase ) (EC 3.2.1.41); Khử gián tiếp transglucosylase (hay oligo-1,6-glucosidase) (EC 3.2.1.20) amylo-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.10) Các Enzyme thủy phân liên kết bên chuỗi polysaccharide 2.1.1 α-Amylase (α-1,4-glucanohydrolase) (EC 3.2.1.1) Amylase có khả phân cắt liên kết 1,4-glucoside chất cách ngẫu nhiên α-amylase khơng có khả phân hủy hồ tinh bột mà cịn có khả phân hủy hạt tinh bột nguyên vẹn 2.1.1.1 Cấu tạo Enzyme α-Amylase: Enzyme α-Amylase protein có phân tử lượng thấp, thường nằm khoảng 50.000 đến 60.000 Dal Có số trường hợp đặc biệt α-Amylase từ loài vi khuẩn Bacillus macerans có phân tử lượng lên đến 130.000 Dal Đến người ta biết rõ chuỗi acid amin 18 loại α-Amylase có loại α-Amylase takaAmylase từ Apergillus orysee α-Amylase tụy lợn nghiên cứu kỹ hình thể khơng gian cấu trúc bậc Mới nghiên cứu tính đồng chuỗi mạch acid amin vùng kị nước cho thấy chuỗi mạch acid amin tất Enzyme αAmylase có cấu trúc bậc tương tự 2.1.1.2 Các giai đoạn trình thủy phân tinh bột α-Amylase: + Giai đoạn dextrin hóa: Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp + Giai đoạn đường hóa: Dextrin tetra trimaltose di & monosaccharide Amylase oligosacharide poliglucose Maltose maltotriose maltotetrose 2.1.1.3 Đặc tính α-Amylase: α-Amylase từ nguồn khác có thành phần amino acid khác nhau, loại α-Amylase có tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng α-Amylase protein giàu tyrosine, tryptophan, acid glutamic aspartic Các glutamic acid aspartic acid chiếm khoảng ¼ tổng lượng amino acid cấu thành nên phân tử Enzyme: • • α-Amylase có methionine có khoảng 7-10 gốc cysteine Trọng lượng phân tử α-Amylase nấm mốc: 45.000-50.000 Da ( Knir 1956; • • Fisher, Stein, 1960 ) Amylase dễ tan nước, dung dịch muối rượu lỗng Protein α-Amylase có tính acid yếu có tính chất globuline Malt: tên gọi ngũ cốc nảy mầm ( Đại mạch, tiểu mạch, thóc gạo, lúa mì đen, thóc nếp…) Trong sản xuất bia, người ta dùng chủ yếu đại mạch nảy mầm Hạt đại mạch nguồn cung cấp nguyên liệu cho đường hóa , tạo đường cho lên men sau Trong q trình nảy mầm hạt tích tụ nhiều men mới, tăng hoạt tính hàng loạt men Amylase tăng hoạt tính đáng kể, cần thiết cho q trình đường hóa Hoạt lực α-Amylase ghi nhận vào thời điểm q trình ươm mầm, cịn đến ngày thứ ba ngày thứ tư hoạt lực chúng tăng cách đáng kể Thời gian để α-Amylase đạt hoạt lực cực đại phụ thuộc vào nhiệt độ ươm mầm Ví dụ nhiệt độ 12 – 140C hoạt lực đạt cực đại sau 11 – 12 ngày đêm, nhiệt độ 18 – 200C hoạt lực đạt cực đại sau – ngày đêm Còn nhiệt độ 25 – 280C cần sau ngày Enzyme đạt hoạt độ tối đa Ngoài Amylase hoạt độ protease, sitase, maltase, phosphatase tăng lên Q trình oxy hóa – khử lượng men tạo thành tập trung phần lớn gần phôi nội nhũ Phần nội nhũ chứa 25% lượng men có malt Trong q trình nảy mầm có số q trình sinh hóa xảy sau: Thủy phân phần tinh bột ( 20 – 25% ) đường đơn giản Đường oligo - polysaccharide có bị phân giải phần thành monosaccharide trisaccharide Lipase thủy phân phần lipid thành acid béo glycerine.Do việc tạo thành acid hữu vô nên độ chua hạt mầm tăng cao , pH 5,6 – 5,9 B Đường hóa: Đường hóa cơng đoạn sản xuất bia quan trọng, lượng đường tạo thành định khả lên men chất lượng bia sau Chính thế, nhiều nhà máy bia giới cho thêm Enzyme với số lượng lớn giai đoạn Các Enzyme vào giai đoạn Enzyme vi khuẩn chịu nhiệt Biến đổi sinh hóa trình đường hóa thủy phân tinh bột thành dextrin đường đơn giản (maltose, glucose…) dễ tan lên men tác dụng Amylase malt, nhiệt độ pH tối ưu Có q trình thủy phân protid – peptid, peptone, acid amin hòa tan dung dịch nhờ Enzyme protease, peptidase có malt Cellulose, peptin bị thủy phân, tạo thành sản phẩm hòa tan dung dịch, tamin bị oxy hóa tạo Flobafel tạo thêm màu cho bia Malt xay nhỏ trộn với nước thành dịch hồ, nâng nhiệt độ lên 60 – 700C giữ 30 đến 40 phút, sau nâng lên nhiệt độ 750C giữ nhiệt độ đường hóa xong (PH 4,6 - 5,8 ) Hiện có nhiều phương pháp đường hóa, nâng nhiệt độ nhiều đợt - lần nâng nhiều đợt phần riêng pha trộn lẫn Với nguyên liệu fi-malt giàu bột (ngũ cốc) trước đường hóa trộn malt cần xay nhỏ trộn nước nấu sơ bột thành hồ cháo loãng, dung dịch đường hóa gọi dịch đường maltose, lọc xong ta có nước “mout” Nước “mout” đun sơi với hoa houblon ( 18 -26g/10 lít bia Việt Nam) Trong nước “mout”, sau đường hóa có chứa 90% chất Carbohydrate, số có đến 75% đường có khả lên men Phần cịn lại 25% loại dextrin mạch thẳng mạch nhánh Trong nhiều trường hợp, lượng đường tạo thành không đạt mức độ nhiều nguyên nhân Trong ngun nhân chất lượng malt Có ba cách để làm tăng lượng đường nước “mout”: • • • Kéo dài thời gian đường hóa Sử dụng thêm đường Sử dụng Enzyme để đường hóa hết lượng tinh bột Trước người ta thường áp dụng hai cách Sau này, việc sử dụng Enzyme thường sử dụng Người ta thường sử dụng loại chế phẩm Enzyme sau: Loại Enzyme vi sinh sản xuất Điều kiện sử dụng pH C Kiểu tác động sản phẩm tạo Amylase vi khuẩn a) B.subtillis 6,5 85 Endo, nối α-1,4 b) B.licheniformis 6,5 105/95 Dextrin α-Amylase nấm Endo, nối α-1,4 mốc 5,0 55 Maltoz Asp.orysee Amylglucosidase 4,3 6,0 Exo, nối α-1,4; αAsp.niger 1,6 Glucoz Pullulnase 4,3 60 Endo, nối α-1,6 Loài Bacillus Dextrin Glucose isomerase 8,0 60 Endo, nối α-1,4 B.coaglucanz Glucoz + Fructoz Bảng : Các loại Enzyme thủy phân tinh bột sử dụng sản xuất bia Các loại Enzyme cho thêm vào sản xuất bia thường nhằm vào mục đích sau: • Nâng cao chất lượng dịch đường hóa • • • Nâng cao khả lên men bia Nâng cao chất lượng ổn định chất lượng bia Giảm giá thành sản phẩm tiến hành thay malt nguyên liệu phi malt Những ưu điểm Enzyme từ nguồn VSV sử dụng sản xuất bia sau: • Các chế phẩm Enzyme từ VSV thường có hoạt tính xúc tác mạnh chứa đầy đủ loại Enzyme cần thiết cho chuyển hóa tinh bột thành loại đường, đặc biệt tạo • loại đường có khả lên men với số lượng lớn Các chế phẩm Enzyme từ VSV thường có khả hoạt động nhiệt độ cao Điều thuận lợi cho việc vận hành q trình dịch hóa đường hóa C Lên men bia Là giai đoạn quan trọng định cho chất lượng bia hiệu suất sản xuất Cơ sở sinh hóa ( Saccharomyces cerevisiae ) C6H12O6 C2H5OH + CO2 Quá trình tạo acid hữu tạo rượu cao tác dụng với tạo ester ảnh hưởng đến mùi vị bia.Trong trình lên men PH giảm dần , lúc đầu dịch lên men 5,3 -5,6 sau lên men cịn 4,2 – 4,4 Quá trình sinh lý đặc trưng giai đoạn đầu thời kỳ lên men sinh trưởng , tăng sinh khối TÀI LIỆU THAM KHẢO: Công nghệ Enzyme – Nguyễn Đức Lượng –NXB Đại học Quốc gia TP.HCM - 2004 Công nghệ sản xuất Malt Bia – Hồng Đình Hồi Nhà xuất Khoa Học – Kỹ Thuật – 2005 http://www.hoahocngaynay.com/vi/nghien-cuu-giang-day/quy-trinh-hoa-hoc/50620112010.pdf Công nghệ lên men ứng dụng Công Nghệ Thực Phẩm – Bùi Ái Nhà xuất Đại Học Quốc Gia Tp.HCM – 2008 Công nghệ vi sinh-Tập 2: Vi sinh vật Công Nghiệp – Nguyễn Đức Lượng Nhà xuất Đại Học Quốc Gia Tp.HCM – 2008 Hóa học Thực Phẩm – Hoàng Kim Anh Nhà xuất Khoa Học – Kỹ Thuật – 2007 Hóa sinh học - Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng Nhà xuất Giáo dục Việt Nam Enzyme xúc tác sinh học – Nguyễn Hữu Chấn Nhà xuất Y học – 1983 ... cơng nghệ sản xuất bánh kẹo 6.3.4 Ứng dụng enzyme công nghệ sản xuất bột 6.3.5 Ứng dụng enzyme công nghệ sản xuất bia TÀI LIỆU THAM KHẢO: Thu nhận, tách chiết, xác định hoạt hóa Enzyme Amylase. .. Điều kiện nuôi cấy ỨNG DỤNG ENZYME AMYLASE: 6.1 Ứng dụng Enzyme amylase y học dược phẩm : 6.2 Ứng dụng Enzyme amylase công nghiệp : 6.2.1 Ứng dụng công nghiệp dệt 6.2.2 Ứng dụng công nghiệp tẩy... 6.2.3 Ứng dụng sản xuất cồn 6.3 Ứng dụng công nghiệp thực phẩm: 6.3.1 .Ứng dụng Enzyme amylase sản xuất siro sản phẩm chứa đường 6.3.2 Ứng dụng enzyme công nghệ sản xuất bánh mì 6.3.3 Ứng dụng enzyme