Chương 3- Kỹ thuật điện di CHƯƠNG III – KỸ THUẬT ĐIỆN DI Phương pháp điện di phương pháp phổ biến phân tích sinh hóa, dùng phân tích nucleic acid protein Kỹ thuật điện di có nhiều ứng dụng sinh học phân tử Đây bước thiếu kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)… - Nguyên tắc điện di Kỹ thuật điện di sử dụng nhằm tách so sánh kích thước phân tử protein, nucleic acid Sự so sánh dựa tốc độ di chuyển phân tử môi trường điện di Trong điện trường, phân tử tích điện thuộc pha lỏng di chuyển phía cực Vận tốc di chuyển phân tử tùy thuộc tỷ lệ điện tích khối lượng phân tử Như phân tử có khối lượng, phân tử có điện tích lớn di chuyển cực ngược dấu nhanh p dụng nguyên lý trên, kỹ thuật sinh hóa sinh học phân tử, người ta sử dụng kỹ thuật điện di nhằm phân tích protein hay phân tích nucleic acid Điện di môi trường lỏng ý nghóa thực tế Điện di thường tiến hành giá thể bán rắn gọi gel Các gel môi trường xốp với lỗ nhỏ cho phép phân tử protein hay nucleic acid qua Kích thước phân tử lớn di chuyển phân tử qua gel chậm Có hai loại gel sử dụng chủ yếu điện di gel agarose gel polyacrylamide Việc chọn loại gel nồng độ chất tạo thành gel tuỳ thuộc kích thước phân tử cần tách - Điện di gel polyacrylamide (PAGE) + Cho hiệu suất phân giải cao cho nucleic acid protein có kích thước nhỏ trung bình (trọng lượng phân tử xấp xỉ đến 1.106 Da) + Cho phép phân tách khối lượng mẫu lớn + Giảm thiểu tương tác phân tử di chuyển với chất + Tính hợp lý chất Kích thước lỗ gel thay đổi nhờ nồng độ gel Polyacrylamide chuẩn bò polymer hóa acrylamide N, ` N -methylen-bis-acrylamide Quá trình polymer hóa kiểm soát chất xúc tác cảm ứng –N-N, N`, N` tetramethylethylendiamin (TEMED) Quá trình quang hóa polymer hóa thúc đẩy có mặt tia UV Nồng độ gel tiêu chuẩn cho phân tích protein 7.5% polyacrylamide Nó phân tích phân tử có khối lượng dao động từ 10.000-1.000.000 Da Tuy nhiên hiệu BÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI Chương 3- Kỹ thuật điện di suất phân tích tốt phân tử từ 30.000 -300.000 Da Hiệu suất phân giải khoảng khối lượng phân tử cấu tử phụ thuộc vào nồng độ acrylamide bis-acrylamide Nồng độ gel thấp cho lỗ gel lớn hơn, cho phép phân tích phân tử sinh học có khối lượng lớn Ngược lại nồng độ cao acrylamide cho lỗ gel nhỏ Điện di gel polyacrylamide dùng cho điện di cột gel hay điện di gel Hình II.1 – Điện di cột Hình II.2 – Điện di đứng Nếu điện di cột Ống thuỷ tinh (10cm6mm) nạp đầy acrylamide; N, N` -methylen-bisacrylamide, đệm xúc tác Quá trình polymer hóa xảy từ 30-40 phút Cột gel đặt vào điện trường Đầu catod đầu anod Mẫu đem phân tích nạp vào đầu cột, phía cực catod Mẫu phân tách thành lớp gel, dòng điện đặt vào Một mẫu thuốc nhuộm dùng để đánh dấu đường cấu tử nạp vào tốc độ di chuyển song song với mẫu nhanh mẫu chút Khi mẫu thuốc nhuộm di chuyển khỏi mẫu, tắt nguồn điện, gel lấy khỏi cột tiến hành nhuộâm mẫu Một kiểu điện di của gel polyacrylamide điện di gel mà phổ biến gel đứng Gel polyacrylamide chuẩn bò cho vào hai miếng kính Khoảng cách hai miếng kính phổ biến từ 0.5-2.0mm Bề mặt lớp gel có diện tích 2040cm lúc phân tích nhiều mẫu Một lượt gel đặt vào đầu gel trình polymer hóa Sau gel đông đặc, lấy lượt BÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI Chương 3- Kỹ thuật điện di ta có giếng gel dùng để nạp mẫu Một lượt tạo lúc 20 giếng Nạp dung dòch mẫu vào giếng, cắm nguồn điện bắt đầu điện di Trong sinh học phân tử PAGE dùng để phân tích DNA có kích thước nhỏ.Thường từ 1-500 bp Bảng mức nồng độ gel khác khả phân tách: Nồng độ polyacrylamide(%) Xếp thứ tự dsDNA (bp) 3.5 100-1000 75-500 7.5 50-400 10.0 35-250 15.0 20-150 20.0 5-100 Bảng II.1- Thành phầøn phối hợp với gel polyacrylamide (pha 100ml) Nồng độ Tp Acrylamide (g) Bis (g) TEMED (g) Dung dòch pha stock (ml) Nước (ml) Amomium persulphate 10% (ml) 3.5 5.0 7.5 10.0 15.0 20.0 3.24 0.26 0.1 10 4.7 0.3 0.1 10 7.13 0.37 0.1 10 9.6 0.4 0.1 10 19.55 0.45 0.1 10 19.5 0.5 0.1 10 86.4 1.0 84.9 1.0 82.4 1.0 79.9 1.0 74.9 1.0 69.4 1.0 Dung dòch pha stock 10X cho 1lít Buffer TBE: 108.0 Tris base; 55.0 g boric acid; 93.0 g EDTA, pH 8.2 TAE: 48.4 g Tris base; 11.4ml glacial acetic acid; 20ml EDTA 0.5, pH 7.6 TPE: 108.8 g Tris base, 15.5 ml phosphoric acid 85%; 40.0ml EDTA 0.5, pH 8.0 PAGE dùng nhiều phân tích + Phương pháp chuẩn bò gel polyacrylamide Chuẩn bò số lượng gel cần, tuỳ theo kích thước khay đựng gel Tính tóan số lượng phản ứng cần theo bảng Hoà số lượng Acrylamide Bis (chú ý mang găng tay hóa chất độc) vào nước buffer, thêm TEMED BÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI Chương 3- Kỹ thuật điện di Ngay tức khắc cho vào amonium persulphate Đặt lược lên khay gel 30 phút sau lấy lượt khỏi gel chuẩn bò cho chạy điện di + Phương pháp nạp mẫu Trộn mẫu vào dung dòch nạp mẫu Có thể sử dụng Bromophenol blue: 0.25 Glycerol 10% thể tích Tác dụng Bromophenol blue: có màu xanh để thấy vạch điện di Glycerol: có tỷ trọng lớn nước, để mẫu chìm xuống giếng gel - Điện di gel Sodium Dodecyl Sulfate - Polyacrylamide (SDS - PAGE) Kỹ thuật điện di trước không đo khối lượng phân tử đại phân tử sinh học phụ thuộc vào hai yếu tố điện tích kích thước phân tử Nếu có phương pháp loại bỏ ảnh hưởng điện tích protein (một đại phân tử sinh học phổ biến) điện di, tốc độ di chuyển đại phân tử phụ thuộc vào kích thước phân tử Người ta thường dùng chất tẩy mạnh để xử lý protein Trong phương pháp protein phản ứng với chất hoạt động bề mặt mang điện tích âm SDS (Sodium Dodecyl sulfate) để tạo phức hợp mang điện tích âm di chuyển phía cực dương điện trường Thêm vào chất khử mercaptoethanol dithireitol (DDT) để phá vỡ cầu nối –S-S- protein (và tiểu đơn vò chúng) Nhờ di chuyển gel phân tử protein điều kiện phụ thuộc vào kích thước, phân tử có kích thước lớn di chuyển chậm phân tử có kích thước nhỏ qua lỗ gel có kích thước đònh Trong thí nghiệm, protein chưa biết khối lượng cấu trúc tiểu đơn vò xử lý vơi 1% SDS 0.1M mercaptoethanol dung dòch điện di Một hỗn hợp protein chuẩn biết trước khối lượng phân tử cho chạy điện di với cách xử lý điều kiện Hai chuẩn điện di, ứng với phân tử protein có khối lượng phân tử thấp (từ 14.000-100.000 Da), ứng với phân tử protein có khối lượng phân tử cao (45.000-200.000 Da) SDS-PAGE hiệu xác đònh khối lượng phân tử phân tử protein đơn vò Là phương pháp điện di gel dùng phổ biến việc xác đònh kích cỡ thành phần khác phân tử protein SDS-PAGE giới hạn xác đònh khối lượng phân tử từ 10.000-200.000 Da Gel có hàm lượng acrylamide nhỏ 2.5% dùng để điện di protein có khối lượng phân tử lớn 200.000 Da Nếu protein có khối lượng phân tử trung bình người ta thường dùng hỗn hợp gel agarose polyacrylamide BÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI Chương 3- Kỹ thuật điện di Thực hành Hoá chất dụng cụ + Dụng cụ: Bộ nguồn điện di, hộp điện di, dụng cụ làm gel (tấm kính, lược, kẹp…) pipet, máy khuấy từ, máy hút chân không Cấu tạo khung gel Gel chuẩn bò khoảng hẹp tạo thành hai miếng kính, phân cách đệm chất dẻo nguyên liệu thích hợp Miếng đệm dài kính khoảng1cm chiều rộng độ dày khoảng 0.5mm Các giếng nơi mẫu cho vào tạo thành từ Hình II.3 – Phương pháp SDS -PAGE mẫu lượt chạy dài ngang đỉnh gel có chiều dày với miếng đệm Các lược dài khoảng 1cm, rộng 2-10mm Khoảng cách 3mm + Hoá chất Dung dòch Acrylamide hay dung dòch đơn hợp Acrylamide (FW 71.08) :30g Bis-acrylamide (FW 154.2) :0.8g Cho nước đến 100ml Bảo quản nhiệt độ 4oC nơi tối Dung dòch độc có khả gây ung thư phải mang găng tay làm thí nghiệm Đệm gel phân tách (stocking separating gel) hay 4X đệm gel lỏng (1.5M Tris HCl , pH 8.8) Hoà tan 3.36g Tris (FW 121.1) 15ml nước Chỉnh pH 8.8 HCl 4N Đệm stacking gel Hoà tan 1.5g Tris (FW 121.1) 20ml nước Chỉnh pH 6.8 HCl 4N Thêm nước cho đủ 25ml Bảo quản nơi tối 4oC ba tháng Dung dòch SDS 10% (có thể bảo quản tháng) Dung dòch amonium persulfate 10% (dùng ngày) TEMED Dung môi pha mẫu BÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI 10 Chương 3- Kỹ thuật điện di Đệm stacking gel 2.5ml Dung dòch SDS 10% 4ml Glycerol 2ml Bromophenol blue 2mg -mercaptoethanol 1ml Dẫn nước đến 10ml, bảo quản –20oC tháng Gel phủ lỏng (0.375M Tris –HCl, 0.1% SDS, pH 8.8) Đệm stacking gel 25ml SDS 10% 1ml Dẫn nước đến 100ml, bảo quản nhiệt độ 4oC nơi tối tháng Đệm điện di Tris (FW 121.1) 3.028g Glycine 14.413g SDS 1g Dẫn nước đến 1000ml Dung dòch không cần kiểm tra lại pH, bảo quản tháng nhiệt độ phòng 10 n-butanol bão hoà nước n-butanol 50ml Nước 5ml 11.Dung dòch nhuộm protein Coomassale blue G-250 0.6g Acetic acid 100ml Thêm nước cho đủ 1000ml Dung dòch chứa hai có màu, bảo quản nhiệt độ phòng 12.Dung dòch rửa màu Acetic acid 70ml Metanol 50ml 13.Dung dòch cố đònh màu nhanh Isopropanol 250ml Acetic acid 100ml Thêm nước cho đủ 1000ml Tiến trình thực theo bước + Bước 1: Chuẩn bò mẫu Mẫu khô dung dòch hoà tan trực tiếp dung môi pha mẫu cho có nồng độ 0.5-1.5mg protein/ml Đun sôi cách thuỷ phút Để nguội + Bước 2: Chuẩn bò gel để chạy điện di Trước hết ta cần biết chiều dài, chiều rộng hay chiều dày khung gel để tính thể tích gel cần pha chế để tránh lãng phí BÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI 11 Chương 3- Kỹ thuật điện di Giả sử cần thiết điều chế 30ml dung dòch gel để điện di, phải cần dung dòch gốc theo tỷ lệ sau Bảng II.2 - Pha chế hỗn hợp gel điện di Nồng độ (%) 7.5 10 12.5 15 Dd acrylamide (ml) 7.5 10 12.5 15 Đệm gel stacking (ml) 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5 SDS 10% (ml) 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 Nước (ml) 17.1 14.6 12 9.6 7.1 Cho vào erlen có nhánh nối với máy hút chân không Vừa hút vừa khuấy máy khuấy từ hết bọt khí Amonium persulfate (l) 150 150 150 150 150 TEMED (l) 10 10 10 10 10 Lắc nhẹ cho tan hết + Bước 3: cho gel điện di vào khuôn đúc gel Cho gel đặc vào khuôn đúc gel, cách lược khoảng 3-5mm Đổ mặt gel đặc 300 l n-butanol bão hòa để tránh tượng oxy hóa làm ngăn cản polymer hóa gel Sau 1-2 giờ, sau gel polymer hóa xong đông đặc lại, nghiêng đổ n-butanol ngoài, tráng lại dung dòch phủ gel lỏng (khoảng 0.3ml) Thêm vào 0.5ml dung dòch phủ lỏng để cố đònh gel + Bước 4: Chuẩn bò gel stacking Để có 10ml dung dòch gel stacking, tiến hành sau: Dung dòch acrylamide 1.32ml Đệm stacking 2.49ml SDS 10% 99ml Nước 6.09ml Khuấy từ hút chân không để loại bọt khí Amonium persulfate 50.1ml TEMED 4.95ml Lắc nhẹ cho tan hết + Bước 5: Điện di Cho dung dòch phủ gel điện di cho 0.5ml gel stacking vừa điều chế xong để tráng bề mặt gel Đổ bỏ Cho đầy gel stacking vào đặt lược vào để tạo thành giếng Chú ý không để tạo bọt khí Để gel cố đònh 60 phút BÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI 12 Chương 3- Kỹ thuật điện di Nhẹ nhàng lấy lược khỏi gel, tránh làm hỏng vách ngăn cách Tráng lại giếng dung dòch điện di Bơm 5-10l có nồng độ khoảng 1g/l mẫu xử lý dung dòch pha mẫu vào giếng Đóng điện tiến hành điện di + Bước 6: Nhuộm đọc kết Đặt gel dung dòch cố đònh màu nhanh 30 phút, lắc nhẹ Chuyển gel qua dung dòch nhuộm protein vài giờ, lắc nhẹ đến vạch màu lên Cuối cho gel vào dung dòch tẩy màu, dung dòch thay hai lần ngày đến gel Gel hoàn tất bảo quản acetic acid 7% nước - Điện di gel agarose Những kỹ thuật điện di nghiên cứu chủ yếu dùng để phân tích protein nucleic acid nhỏ, có khối lượng phân tử tới 350.000 Da (500bp) Tuy nhiên, lỗ nhỏ gel không phân tích cấu phần nucleic acid có khối lượng phân tử cao Phương pháp chuẩn dùng để phân tích RNA DNA có số nucleic từ 200-50.000 bp điên di với gel agarose với nồng độ trung bình Hình II.4: Cấu trúc agarose (theo Nông Văn Hải 2002) Agarose hợp chất chiết xuất từ tảo biển, loại polymer mạch thẳng galactose pyranose Gel chuẩn bò cách hòa tan agarose dung dòch điên di có nhiệt độ ấm Sau làm ấm hỗn hợp gel đến 50oC, hỗn hợp gel đổ hai kính, tương tự cách đổ gel polyacrylamide BÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI 13 Chương 3- Kỹ thuật điện di Hình II.5 Các bước tạo gel điện di agarose 1,2 Tạo khuôn-3 Đổ gel vào khuôn-4 lắp lược, tra mẫu-5 chạy điện di Mẫu đặt vào giếng gel (tạo lược gel) điện áp đặt vào hai đầu Gel agarose đỗ lên giá thể nằm ngang Điện di thực theo phương ngang Các nucleic acid gel agarose hình tia tử ngoại nhờ hóa chất có tên ethidium bromide Chất có chức gắn xen vào base nucleic acid tác dụng tia tử ngoại phát huỳnh quang Trong thao tác, ethidium bromide cho vào gel trước đổ Sau điện BÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI 14 Chương 3- Kỹ thuật điện di di gel chiếu tia tử ngoại (bước sóng 300nm) Nuleic acid hình vệt màu đỏ cam Mặt khác, để ước lượng kích thước trình tự nucleic acid gel agarose Người ta sử dụng “yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử” Đó tập hợp nhiều trình tự DNA có kích thước biết (thang DNA), thông thường người ta sử dụng thang DNA thực khuẩn thể  thuỷ giải enzyme cắt giới hạn Hind III Một hệ thống điện di Instacry, giới thiệu Eastman Kodak, gần thay cho agarose gel Instacryl H Copolymer, loại polymer có diện dithioreitol Nồng độ gel từ 3-6% dùng để phân tách DNA mạch đôi từ 10-3500bp - Điện di điện trường xung Trong lý thuyết, điện di gel agarose dùng để phân tích nucleic acid có trình tự nhỏ 50.000bp Trong thực tế, chúng phân tích tốt giới hạn 20.000-30.000bp Và DNA có kích thước lớn 50kb lớn để chui qua lỗ gel Từ lúc DNA ribosome đa số sinh vật có kích thước lên đến hàng ngàn đến hàng triệu bp DNA muốn điện di phải cắt ngắn enzyme cắt giới hạn sau phân tách điện di thông thường Trong năm đầu năm 1980, Schawarts Cantor đại học Columbia (Mỹ), phát DNA có kích thước phân tử lớn (như nhân nấm men- kích thước từ 200-3000kb) phân tách điện di điện trường xung (PFGE) Phương pháp giống điện di thông thường Trong điện di điện trường xung, hướng điện trường cố đònh phương pháp thông thường thay đổi theo chu kỳ, lực điện trường thay đổi Mỗi lần hướng điện trường thay đổi phân tử DNA phải tự đònh hướng lại Thời gian cho việc tự đònh hướng phụ thuộc kích thước phân tử Phân tử dài thời gian tự đònh hướng lớn khiến di chuyển chậm phân tử có kích thước nhỏ Mặc dù theo lý thuyết, PFGE sử dụng ít, thực tế áp dụng nhiều PFGE thay đổi lớn kỹ thuật nghiên cưú DNA Những DNA có trọng lượng phân tử trung bình, cô lập khỏi tế bào diện lysozyme, chất tẩy EDTA có kích thước phân tử khoảng 400-500kb phân tách tốt kỹ thuật điện di điện trường xung Có nhiều thiết bò phát triển để thay đổi thiết kế thí nghiệm PFGE Một vài yếu tố bò thay đổi thí nghiệm hiệu điện thế, số lượng điện cực, chu kỳ thay đổi hướng điện trường, thiết kế hộp gel, nhiệt độ, nồng độ agarose, pH dung dòch điện di, thời gian điện di BÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI 15 Chương 3- Kỹ thuật điện di Cũng giống kỹ thuật thí nghiệm khác, PFGE có số nhược điểm cần phải lưu ý ví dụ thời gian điện di lâu (trong vòng vài ngày) thường đòi hỏi phân giải tốt Sự di chuyển cấu phần phụ thuộc vào điều kiện tiến hành thí nghiệm PFGE công cụ hiệu việc phân tách phân tử có khối lượng lớn Kỹ thuật sử dụng dự án gen người - Điện di giấy Nguyên liệu, hoá chất thiết bò + Nguyên liệu: dung dòch amin chuẩn, hỗn hợp M1, dung dòch nghiên cứu + Hoá chất: dung dòch điện di: dung dòch đệm phosphate M/5 pH 6.1 + Thiết bò: giấy điện di (giấy Whatman No 1) Máy điện di gồm: hai chậu lớn, hai miếng kính thuỷ tinh hình chữ nhật kích thước, hai điện cực nối với nguốn điện chiều có hiệu điện cao (250400V), volt kế hay ampe kế cho phép đo hiệu điện cường độ dòng điện qua giấy Lys Asp Leu M1 Arg His Tyr a) Hình II.4 - Điện di giấy a) Thiết bò điện di b) Chuẩn bò giấy điện di b) + Bước 1: chuẩn bò giấy điện di Cắt băng giấy điện di theo kích thước 3512cm Vẽ đường viết chì tờ giấy theo chiều ngang Đònh vò acid amin giấy + Bước 2: chấm dung dòch acid amin Tiến hành chấm acid amin giấy phần sắc ký (xem 3.12) Bước 3: tiến hành chạy điện di BÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI 16 Chương 3- Kỹ thuật điện di Nhúng ướt giấy: kẹp đầu nhúng đầu vào chậu dung dòch đệm cho mực nước cách lằn viết chì 1cm, đem thấm khô hai tờ giấy lọc lặp lại Đem để băng giấy lên thuỷ tinh rửa khô Làm ẩm đầu phần khô mẫu giấy lọc thấm dung dòch đệm cho giấy đủ ướt để amino acid không bò lôi Chồng kính thứ hai lên Chú ý là: hai đầu giấy phải nhúng vào dung dòch bề mặt hai kính băng giấy không dính dấu vân tay Đóng mạch điện Dòng điện có hiệu điện cao nên kể từ không chạm vào phận máy Cho máy chạy 15 phút, sau ngắt mạch điện Bước 4: xác đònh acid amin thuốc thử Lấy kính phía sấy khô giấy máy sấy Quan sát vệt acid amin Nhuộm băng giấy thuốc thử ninhydrin, sau làm khô máy sấy Quan sát vệt acid amin kết luận thành phần acid amin có hỗn hợp M1 Bước 5: Đònh lượng protein Xác đònh cường độ protein cách đo cường độ màu vết Cắt vết acid amin khỏi giấy sắc ký, cắt nhỏ giấy cho hết vào ống nghiệm, cho vào dung dòch CdCl2 48% ethanol hay 48% CuSO4 ethanol, ngâm Sau đem đo mật dộ quang máy soi màu bước sóng 520nm Xác đònh đường chuẩn acid amin (để biết nồng độ) dựa vào đường chuẩn để xác đònh nồng độ acid amin có vết cắt - Phát vạch điện di Sau phân tích điện di phân tử DNA gel người ta sử dụng số phương pháp làm sau: Đối với gel agarose, người ta nhuộm ethidium bromide Chất gắn xen vào base phân tử DNA phát huỳnh quang tia tử ngoại Điều cho phép phát đoạn DNA gel Đối với gel polyacrylamide, phân tử DNA đánh dấu đồng vò phóng xạ vò trí chúng phát kỹ thuật phóng xạ tự ghi Chúng đánh dấu chất nhuộm chuyên biệt BÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI 17 Chương 3- Kỹ thuật điện di Hình II.5 – Phát vạch điện di cách quan sát tia tử ngoại Hình II.6 – Chụp ảnh gel document nhờ máy vi tính - Phương pháp chụp hình gel Giới thiệu Đối với điện di DNA, người ta thường nhuộm ethidium bromide Gel khuêùch đại thông qua UV transilluminator Với phương pháp cần phim để chụp Hiện với công nghệ thông tin đại Máy chụp qua hệ thống gel document nhờ máy vi tính điều chỉnh thông qua phần mềm chuyên dụng Với phương pháp người ta in trực tiếp lưu vào đóa Phương pháp Hệ thống chụp đặt phòng tối Để gel UV transilluminator Chú ý cẩn thận tránh tạo bọt khí Tốt lấy giấy mềm thấm nước Đặt phim vào máy chụp Điều chỉnh máy chụp hình Tập trung ảnh vào vò trí trung tâm chỉnh hình cho rõ nét Lúc dùng hệ thống đèn sáng để chỉnh hình Tắt hệ thống đèn, mở đèn UV, lúc phải mang kính bảo hộ để tránh tia UV, ảnh hưởng đến mắt da Dùng tay nhẹ nhành di chuyển ống kính để điều chỉnh hình cho sắc nét Khi hình vào tiêu điểm, chỉnh hình Bấm máy, tắt hệ thống đèn UV Cẩn thận rút phim khỏi máy Đợi 45 phút, xong bỏ giấy bao hình BÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI 18 Chương 3- Kỹ thuật điện di Chú ý máy dễ bò dơ phim chụp nhiều phim cũ, hệ thống bẩn chụp khó in hình Do cần phải tháo kính lau chùi cồn 70% Sau chụp xong bỏ gel vào thùng chứa, lau bàn Chụp ảnh gel document Trường hợp dùng hệ thống gel document, hình ảnh đặt buồng tối Đặt gel vào buồng tối, điều chỉnh máy chụp hình Có thể thông qua hệ thống vi tính điều chỉnh hình sắc nét trước chụp ảnh Thông qua hình ảnh lưu vào đóa lâu dài - Thu nhận mẫu điện di Đối với điện di gel agarose sử dụng để tinh thu nhận mẫu Nguyên tắc điều kiện giống điện di phân tích đề cập Sau điện di vạch tương ứng với DNA cần tinh phát thu nhận lại cách cách sau đây: + Phương pháp 1: Phần agarose chứa vạch cắt DNA thu nhận sau khuếch tán từ gel agarose vào dung dòch đệm thích hợp + Phương pháp 2: Một “giếng” nhỏ khoét agarose trước vạch DNA “Giếng” bơm đầy dung dòch đệm điện trường tái lập DNA di chuyển vào “giếng” chứa đầy dung dòch đệm thu nhận lại + Phương pháp 3: Điện di thực agarose gel đặc biệt có điểm nóng chảy thấp (65oC) Sau điện di vạch DNA cắt ra, ủ dung dòch đệm nhiệt độ 65oC Sau agarose hoàn toàn nóng chảy, DNA thu nhận lại sau nhiều công đoạn tách chiết tủa 10 - Phân tích kết điện di Do việc phân tách sinh hoá kết điện di dựa điện tích, kích thước cấu tạo, điện di cung cấp nhiều thông tin giá trò độ tinh khối lượng phân tử Độ tinh đánh giá thông qua số vạch băng điện di Nếu có vạch, nghóa có cấu tử diện Kết phân tích đánh gía tinh Nếu có hai hay nhiều vạch chúng tỏ mẫu có hai hay nhiều cấu tử diện, bò tạp nhiễm hay không tinh ta gọi dò hình hay không tinh Để kiểm tra độ đồng nhất, người ta thường cho chạy vệt chuẩn, từ so sánh Và thông thường để kiểm tra độ tinh người ta kết hợp sử dụng phương pháp sắc ký khí hay sắc ký lỏng cao áp BÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI 19 Chương 3- Kỹ thuật điện di Câu hỏi ôn tập Nêu nguyên tắc phương pháp điện di Những ưu điểm phương pháp điện di gel polyacrylamid? Những thành phần tạo gel polyacrylamid? Nguyên tắc phương pháp điện di gel Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide (SDS - PAGE)? Trình bày phương pháp điện di gel agarose Nguyên tắc phương pháp điện di điện trường xung? Có phương pháp phát vạch điện di? Trình bày phương pháp thu nhận mẫu điện di BÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI 20 [...]...Chương 3- Kỹ thuật điện di Cũng giống như các kỹ thuật thí nghiệm khác, PFGE cũng có một số nhược điểm cần phải được lưu ý ví dụ như thời gian điện di lâu (trong vòng vài ngày) thường đòi hỏi sự phân giải tốt Sự di chuyển của những cấu phần phụ thuộc vào điều kiện tiến hành thí nghiệm PFGE là công cụ hiệu quả trong việc phân tách những phân tử có khối lượng rất lớn Kỹ thuật này đã được sử dụng trong dự... áp BÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI 19 Chương 3- Kỹ thuật điện di Câu hỏi ôn tập 1 Nêu nguyên tắc của phương pháp điện di 2 Những ưu điểm của phương pháp điện di trên gel polyacrylamid? 3 Những thành phần tạo gel polyacrylamid? 4 Nguyên tắc của phương pháp điện di trên gel Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide (SDS - PAGE)? 5 Trình bày phương pháp điện di trên gel agarose 6 Nguyên... hiện bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi Chúng còn có thể được đánh dấu bằng chất nhuộm chuyên biệt BÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI 17 Chương 3- Kỹ thuật điện di Hình II.5 – Phát hiện vạch điện di bằng cách quan sát dưới tia tử ngoại Hình II.6 – Chụp ảnh trên gel document nhờ máy vi tính 8 - Phương pháp chụp hình gel Giới thiệu Đối với điện di DNA, người ta thường nhuộm ethidium bromide... pháp 3: Điện di được thực hiện trên một agarose gel đặc biệt có điểm nóng chảy rất thấp (65oC) Sau khi điện di vạch DNA được cắt ra, ủ trong một dung dòch đệm ở nhiệt độ 65oC Sau khi agarose đã hoàn toàn nóng chảy, DNA được thu nhận lại sau nhiều công đoạn tách chiết và tủa 10 - Phân tích kết quả điện di Do việc phân tách sinh hoá kết quả điện di dựa trên điện tích, kích thước và cấu tạo, điện di có... amin có trong vết cắt 7 - Phát hiện vạch điện di Sau khi phân tích bằng điện di các phân tử DNA trên gel người ta sử dụng một số phương pháp làm hiện hình như sau: Đối với gel agarose, người ta nhuộm bằng ethidium bromide Chất này sẽ gắn xen vào giữa các base của phân tử DNA và phát huỳnh quang dưới tia tử ngoại Điều này cho phép phát hiện các đoạn DNA trên gel Đối với gel polyacrylamide, các phân tử DNA... nguốn điện một chiều có hiệu điện thế cao (250400V), một volt kế hay một ampe kế cho phép đo hiệu điện thế và cường độ dòng điện đi qua giấy Lys Asp Leu M1 Arg His Tyr a) Hình II.4 - Điện di trên giấy a) Thiết bò điện di b) Chuẩn bò giấy điện di b) + Bước 1: chuẩn bò giấy điện di Cắt một băng giấy điện di theo kích thước 3512cm Vẽ một đường viết chì ở giữa tờ giấy theo chiều ngang Đònh vò các acid... bộ gen người 6 - Điện di trên giấy Nguyên liệu, hoá chất và thiết bò + Nguyên liệu: dung dòch amin chuẩn, hỗn hợp M1, dung dòch nghiên cứu + Hoá chất: dung dòch điện di: dung dòch đệm phosphate M/5 pH 6.1 + Thiết bò: giấy điện di (giấy Whatman No 1) Máy điện di gồm: hai chậu lớn, hai miếng kính thuỷ tinh hình chữ nhật cùng kích thước, hai điện cực nối với nguốn điện một chiều có hiệu điện thế cao (250400V),... hiện ngay khi đặt trong buồng tối Đặt gel vào trong buồng tối, điều chỉnh máy chụp hình Có thể thông qua hệ thống vi tính điều chỉnh hình sắc nét trước khi chụp ảnh Thông qua hình ảnh lưu vào đóa lâu dài 9 - Thu nhận mẫu điện di Đối với điện di trên gel agarose còn được sử dụng để tinh sạch và thu nhận mẫu Nguyên tắc và điều kiện giống như điện di phân tích đã đề cập ở trên Sau khi điện di các vạch tương... Sulfate Polyacrylamide (SDS - PAGE)? 5 Trình bày phương pháp điện di trên gel agarose 6 Nguyên tắc của phương pháp điện di trên điện trường xung? 7 Có những phương pháp nào phát hiện vạch điện di? 8 Trình bày các phương pháp thu nhận mẫu điện di BÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI 20 ... ngang Đònh vò các acid amin trên giấy + Bước 2: chấm dung dòch acid amin Tiến hành chấm acid amin trên giấy như phần sắc ký (xem 3.12) Bước 3: tiến hành chạy điện di BÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI 16 Chương 3- Kỹ thuật điện di Nhúng ướt giấy: kẹp một đầu và nhúng một đầu vào chậu dung dòch đệm sao cho mực nước còn cách lằn viết chì 1cm, đem ra thấm khô ngay giữa hai tờ giấy lọc ... phân tử sinh học phụ thuộc vào hai yếu tố điện tích kích thước phân tử Nếu có phương pháp loại bỏ ảnh hưởng điện tích protein (một đại phân tử sinh học phổ biến) điện di, tốc độ di chuyển đại phân. .. cho phép phân tích phân tử sinh học có khối lượng lớn Ngược lại nồng độ cao acrylamide cho lỗ gel nhỏ Điện di gel polyacrylamide dùng cho điện di cột gel hay điện di gel Hình II.1 – Điện di cột... huỳnh quang Trong thao tác, ethidium bromide cho vào gel trước đổ Sau điện BÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI 14 Chương 3- Kỹ thuật điện di di gel chiếu tia tử ngoại (bước