Đang tải... (xem toàn văn)
Enterobacter sakazakii mối hiểm họa đối với trẻ sơ sinh
Enterobacter sakazakii Enterobacter sakazakii MỐI HIỂM HỌA ĐỐI VỚI TRẺ SƠ SINH MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BPW = Buffer Pepton Water EE broth = Enterobacteriaceae Enrichment broth FDA = Food and Drug Administration IFM = Infant Fomula Milks IAC = Internal Amplification Control MRS = DeMann Rogosa Sharpe Agar ompA = outer membrane protein A PCA = Plate Count Agar PCR = Polymerase Chain Reaction Nhóm 23- 08DSH2 Enterobacter sakazakii TSA = Trypticase Soya Agar VRBGA = Violet Red Bile Glucose Agar CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ TÁC NHÂN GÂY NGỘ ĐỘC 1.1 Lịch sử phát hiện: Theo ước tính Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) năm có hàng triệu trường hợp bệnh thực phẩm xảy toàn giới Năm 1958 Enterobacter sakazakii lần liên quan đến trường hợp viêm màng não trẻ sơ sinh Kể từ đó, khoảng 70 trường hợp nhiễm E sakazakii báo cáo, số trường hợp đáng kể báo cáo tất nước tỷ lệ cao Lúc giờ, sinh vật gọi “sắc tố màu vàng - Enterobacter cloacae” đến năm 1980 đổi tên Enterobacter sakazakii (bởi Farmer cộng sự) Một điều tra quy mô sản phẩm sữa bột thức ăn khô cho trẻ diễn phạm vi quốc gia châu Âu, Mỹ, Hàn Quốc Nam Phi Hơn 200 mẫu từ 110 sản phẩm khác phân tích cẩn thận để truy lùng dấu vết loại khuẩn gây hại Kết hoàn toàn bất ngờ, số 82 mẫu sữa bột dành cho trẻ sơ sinh có chứa Nhóm 23- 08DSH2 Enterobacter sakazakii loại vi khuẩn gây bệnh đường ruột 12 49 thực phẩm khô tình trạng tương tự Trong số loại khuẩn phát hiện, người ta nhận dạng 13 dòng vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh viêm dày - ruột, có Enterobacter sakazakii gây viêm màng não Vào năm 2001, thảm cảnh diễn khu chăm sóc đặc biệt cho trẻ sơ sinh bang Tennessee (Mỹ), - hàng chục bé bị viêm màng não Sau này, người ta phát nguyên nhân từ lô sữa bột dành cho trẻ Năm 2004, chuyên gia Tổ chức Lương thực Nông nghiệp Liên hợp quốc (FAO) Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) họp phát triển hướng dẫn quốc tế qua thông điệp giáo dục Enterobacter sakazakii 1.2 Vị trí phân loại: -Kingdom (giới): Bacteria -Phylum (ngành): Proteobacteria -Class (lớp): Gamma Proteobacteria -Order (bộ): Enterobacteriales -Family (họ): Enterobacteriaceae -Genus (chi): Enterobacter -Species (loài): Enterobacter sakazakii 1.3 Đặc điểm: 1.3.1 Đặc điểm chung: Enterobacter sakazakii trực khuẩn hình que, gram âm, có kích thước chiều dài micromet chiều rộng micromet, kị khí tuỳ nghi, hình thành bào tử, có sắc tố vàng, chịu áp suất thẩm thấu cao, di động, cung cấp viên nang có vành lông rung Ngoài thuộc loại vi khuẩn ưa nhiệt ôn hòa - Nhiệt độ tối đa phát triển: 41-45oC - Nhiệt độ tối thiểu phát triển: 5.5-8.0oC Nhóm 23- 08DSH2 Enterobacter sakazakii - Không phát triển nhiệt độ: 4oC 1.3.2 Đặc điểm sinh hóa: Các chủng Enterobacter có hoạt động α-glucosidase phosphoamidase Enterobacter sakazakii sau phân lập thấy có lên men đường sucrose, raffinose, α-methyl-D-glucozit, D-sorbitol, dulcitol, adonitol, Daeabinol 1.4 Cấu trúc: - Enterobacter sakazakii có cấu trúc gen ompA với trình tự ATCC 51329 1.5 Yếu tố độc lực: E.sakazakii tiết độc tố enterotoxin (độc tố đường ruột) Đây độc tố protein có trọng lượng phân tử thấp, thường có nhiệt độ ổn định tan nước Độc tố thường xuyên gây độc tế bào giết chết tế bào cách thay đổi tính thấm màng tế bào đỉnh (biểu mô) tế bào niêm mạc thành ruột 1.6 Cơ chế gây bệnh: Trong tế bào mô động vật có vú, Enterobacter sakazakii gắn vào đường ruột tế bào tồn bên đại thực bào Tuy nhiên, chế mà adhesions Enterobacter sakazakii có khả thụ thể tế bào chủ trình chưa xác định rõ ràng Chủng Enterobacter sakazakii sinh viên nang, nhờ công vào thể tế bào vật chủ mà tránh tượng đại thực bào ruột Hơn nữa, viên nang giúp bảo vệ tế bào trực khuẩn Enterobacter sakazakii, tạo điều kiện thuận lợi giúp tồn môi trường khô Sau xâm nhập vào tế bào chủ (nhất trẻ sơ sinh) sinh vật gắn vào bề mặt màng plastics lớp silicon, phát triển lớp màng biofim Việc nhiễm E sakazakii trẻ sơ sinh dễ xảy trình pha chế sữa cho trẻ, trực khuẩn tồn với số lượng lớn núm vú bình sữa Trong tế bào chủ, bao bọc màng biofim tránh thay đổi bên tế bào chủ làm ảnh hưởng đến sinh vật này, từ khả kháng sinh phát triển 1.7 Bệnh triệu chứng bệnh: Nhóm 23- 08DSH2 Enterobacter sakazakii 1.7.1 Bệnh: Enterobacter sakazakii trực khuẩn hình que Gram âm gây bệnh cho người lớn Nó chủ yếu gây bệnh cho trẻ nhỏ Các nghiên cứu trẻ sơ sinh, trẻ vị thành niên khác có mức độ kháng bệnh khác Hầu hết báo cáo cho trường hợp nhiễm khuẩn gây bệnh viêm ruột, nhiễm trùng nhiễm khuẩn đường huyết, viêm màng não.Việc tổn hại hệ thần kinh tỉ lệ tử vong theo báo cáo lên đến 40-80% 1.7.2 Các triệu chứng bệnh: Triệu chứng thông thường trẻ: • Ăn uống • Khó chịu • Vàng da • Khó thở • Nhiệt độ không ổn định Dấu hiệu bệnh viêm màng não trẻ sơ sinh bao gồm: • Sốt cao • Quá buồn ngủ khó chịu • Tình trạng trì trệ • Biếng ăn • Một lồi chỗ mềm đỉnh đầu • Độ cứng thể cổ • Động kinh 1.8 Các biện pháp phòng xử lý bệnh: - Đối với trẻ sơ sinh tuổi biện pháp tốt cho bé bú sữa mẹ Việc xem điều lý tưởng để chăm sóc trẻ sơ sinh - Trong trường hợp người mẹ lý không trực tiếp cho dùng sữa thân họ phải trang bị đầy đủ kiến thức cách cho trẻ sử dụng sữa để chuẩn bị sử dụng công thức sữa rời khỏi bệnh viện, cần thiết Nhóm 23- 08DSH2 Enterobacter sakazakii - Như báo cáo gần quan phủ Mỹ FDA cho Enterobacter sakazakii không chịu nhiệt dễ dàng giết chết nhiệt độ 60 , áp dụng trình công nghiệp, ví dụ phương pháp tiệt trùng Pasteur Vì trước cho trẻ dùng sữa cần tiến hành khử trùng dụng cụ pha chế, đun sôi nước dùng (nhiệt độ 70oC) pha chế sữa đun hoàn nguyên để đảm bảo điều kiện an toàn - Những chuyên gia y tế cần đào tạo với chất lượng cao hướng dẫn quản lý rủi ro hiệu quả, đảm bảo điều kiện vệ sinh tối ưu cho việc lưu trữ, xử lý, sản xuất chuẩn bị công thức sữa bột với mục đích ngăn chặn diện phát triển số loài vi khuẩn gây bệnh có công thức sữa đặc biệt Enterobacter sakazakii -Các trung tâm chuẩn đoán, phòng trừ chữa trị bệnh bệnh viện,… phải đảm bảo vệ sinh tốt khu vực đảm bảo họ, bao gồm việc điều trị chống vi khuẩn trước chuẩn bị công thức phối hợp nỗ lực để giảm thiểu thời gian chuẩn bị tiêu dùng - Về phía nhà sản xuất thực phẩm cho trẻ sơ sinh cần có biện pháp mở rộng cấp dộ nhà máy để đảm bảo mức độ cao chất lượng sản phẩm độ an toàn Để thực yêu cầu nhà sản xuất phải: +Có quy trình kiểm soát nghiêm ngặt nhằm ngăn ngừa ô nhiễm từ khâu sản xuất đến điểm mua hàng người tiêu dùng + Giám sát chặt chẽ thành phần, đặc biệt gia tăng sau bước cuối giai đoạn chế biến nhiệt +Có biện pháp phát hiện, loại bỏ hay xử lý tốt để giảm thiểu có mặt Enterobacteriaceae coliform môi trường sản xuất +Đào tạo, bồi dưỡng tổ chức cán để đảm bảo tuân thủ tiêu chuẩn an toàn quy trình công nghệ sản xuất +Kiểm tra tiêu chuẩn vi sinh thành phẩm nhằm đảm bảo chất lượng an toàn sản phẩm Nếu đạt yêu cầu, đủ tiêu chuẩn phân phối đưa thị trường, xử lý hủy bỏ tránh ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng Nhóm 23- 08DSH2 Enterobacter sakazakii CHƯƠNG II : CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH 2.1 Phương pháp truyền thống: Nhóm sử dụng phương pháp: nuôi cấy đếm khuẩn lạc Phương pháp nuôi cấy: 2.1.1 Nguyên tắc: Chỉ sử dụng thuốc thử thuộc loại phân tích, nước sử dụng phải nước cất, nước loại khoáng có chất lượng tương đương Nước sử dụng không chứa chất gây ức chế phát triển vi sinh vật điều kiện thử nghiệm Để tăng độ tái lập kết quả, nên sử dụng thành phần khô môi trường hoàn chỉnh khô để chuẩn bị môi trường nuôi cấy Các giá trị pH quy 25 C Dùng acid clohydric [c(HCL)= 1mol/l] dung dịch natri hydroxit [c(NaOH)= 1mol/l] để chỉnh pH cần Môi trường nuôi cấy thuốc thử chuẩn bị chua sử dụng phải bảo quản điều kiện không làm thay đổi thành phần chúng, nơi tối, nhiệt độ từ 0 C đến C không tháng , trừ có quy định khác Nhóm 23- 08DSH2 Enterobacter sakazakii 2.1.2 Môi trường nuôi cấy thuốc thử: 2.1.2.1 Môi trường nuôi cấy: -Môi trường pha loãng mẫu nước đệm pepton Buffer Pepton Water (BPW) -Môi trường thạch đậu tương trypton (TSA) -Canh thang tryptoza lauryl sunfat cải biến (mLST)/môi trường vancomyxin -Môi trường thạch phân lập Enterobacter sakazakii(ESIA TM ) -Môi trường vi sinh Brilliance Enterobacter sakazakii Agar (DFI) 2.1.2.2 Môi trường thuốc thử đặc tính sinh hóa: -Thuốc thử phát oxidaza -Môi trường L-lysin tách nhóm carboxyl (decarboxylation) -Môi trường L-Ornithin tách nhóm carboxyl (decarboxylation) -Môi trường L-Arginin cộng hai hydro (dihydrolation) -Môi trường để lên men hydrat carbon (nước pepton có đệm phenol, D-sorbitol, L-sobitol, L-rhamnoza, D-sucroza, D-melibioza amygdalin) -Môi trường Simmons xitrat 2.1.3 Thiết bị, dụng cụ: -Thiết bị khử trùng khô (tủ sấy) thiết bị khử trùng ướt (Autoclave) -Pipet 1ml -Nồi cách thủy, trì nhiệt độ 44 C ± 0.5 C -Đĩa Petri, đường kính từ 90mm đến 100mm -Ống nghiệm, đường kính 18mm dài 160mm -Tủ ấm, trì nhiệt độ 25 C ± C, 30 C ± C 44 C± C tương ứng -Vòng cấy, đường kính 3mm hay vòng cấy sử dụng lần -Máy đo pH, đo xác đến 0.1 pH nhiệt độ 25 C ± C 2.1.4 Quy trình phân tích: Nhóm 23- 08DSH2 Enterobacter sakazakii Chuẩn bị mẫu thử/tiền tăng sinh: Cân 25g mẫu cho vào 225ml môi trường BPW Ủ 37C 18h ± 2h Tăng sinh chọn lọc môi trường vancomyxin/mLST: Chuyển 0.1ml từ BPW cấy vào 10ml môi trường vancomyxin/mLST Ủ 44C 24h ± 2h Phân lập thạch sinh màu chọn lọc: Cấy vạch vòng đầy dịch cấy từ môi trường vancomyxin/mLST lên thạch sinh màu đĩa Petri Ủ 44C 24h ± 2h Khẳng định: Sinh màu vàng Chọn năm khuẩn lạc điển hình cấy vạch lên đĩa TSA Ủ 25C 48h ± 4h Khẳng định: Sinh hóa Chọn khuẩn lac màu vàng từ đĩa TSA để thử sinh hóa Nhóm 23- 08DSH2 Diễn giải kết Enterobacter sakazakii 2.1.5 Thuyết minh quy trình: 2.1.5.1 Chuẩn bị mẫu: Cân 9g mẫu thử cho vào 225ml môi trường BPW Để yên cho mẫu khô tan dịch lỏng mà không khuấy trộn sau 30 phút mà mẫu không hết trộn nhẹ nhàng mẫu với môi trường 2.1.5.2 Tiền tăng sinh: Ủ mẫu cấy môi trường tiền tăng sinh 37 C ± C 18h ± 2h 2.1.5.3 Tăng sinh chọn lọc: Sau ủ mẫu thử cấy môi trường tiền tăng sinh, chuyển 0,1ml dịch cấy thu 10ml môi trường vancomyxin/mLST Ủ 44 C ± 0,5 C 24h ± 2h Nên sử dụng nồi cách thủy tủ ấm khí cưỡng để đảm bảo nhiệt độ tối đa không vượt 2.1.5.4 Phân lập Enterobacter sakazakiigiả định: Sau ủ môi trường vancomyxin/mLST cấy, ria cấy vòng đầy (khoảng 10µl) lên bề mặt đĩa thạch phân lập Ủ đĩa 44 C ± C 24h ± 2h Sau ủ, kiểm tra đĩa thạch sinh màu có mặt hay mặt khuẩn lạc điển hình Enterobacter sakazakii giả định Các khuẩn lạc điển hình có màu xanh Nhóm 23- 08DSH2 10 Enterobacter sakazakii đến màu xanh lục, cỡ nhỏ đến trung bình (1mm-3mm) Các khuẩn lạc không điển hình thường hoi suốt có màu tím 2.1.5.5 Khẳng định: a Sinh sắc tố vàng Chọn từ đến năm khuẩn lạc Enterobacter sakazakii giả định điển hình kiểm tra đĩa thạch sinh màu ủ Cấy vạch khuẩn chọn lên bề mặt đĩa thạch TSA, cho sau ủ quan sát khuẩn lạc tách biệt Ủ đĩa 25 C ± C 48h ± 4h Sau ủ, kiểm tra đĩa TSA có mặt khuẩn lạc màu vàng (Hình 1) Hình Khuẩn lạc màu vàng phát triển môi trường TSA b Khẳng định sinh hóa: Có thể sử dụng kit thử nhỏ có bán sẵn thị trường để nhận dạng sinh hóa để nhận dạng Enterobacter sakazakii Chọn khuẩn lạc màu vàng từ đĩa thạch đậu tương trypton để nhận dạng sinh hóa theo phép thử sau đây: Nhóm 23- 08DSH2 11 Enterobacter sakazakii • Phép thử oxidaza: Dùng kim cấy sử dụng lần que cấy thủy tinh, lấy phần khuẩn lạc đặc trưng chọn Ria cấy lên giấy lọc làm ẩm thuốc thử oxidaza Không sử dụng vòng cấy que cấy niken crom Nếu màu giấy lọc không đổi sang màu tím hoa cà, màu tím màu xanh đậm 10s phản ứng xem âm tính.(Hình 2) Hình Kết phép thử oxidaza • Phép thử decarboxylaza L-Lysin: Dùng vòng cấy, que cấy đĩa thủy tinh lấy khuẩn lạc chọn cấy vào bề mặt môi trường lỏng L-Lysin decarboxylation Ủ ống 30 C ± C từ 24h ± 2h Sau ủ có màu tím chứng tỏ phản ứng dương tính Màu vàng chứng tỏ âm tính • Phép thử decarboxylaza L-Ornithin: Dùng vòng cấy, que cấy đĩa thủy tinh lấy khuẩn lạc chọn cấy vào bề mặt môi trường lỏng L-Ornithin decarboxylation Ủ ống 30 C ± C từ 24h ± 2h Sau ủ có màu tím chứng tỏ phản ứng dương tính Màu vàng chứng tỏ âm tính • Phép thử dihydrolaza L-Arginin: Dùng vòng cấy, que cấy đĩa thủy tinh lấy khuẩn lạc chọn cấy vào bề mặt môi trường lỏng dihydrolaza L-Arginin Ủ ống 30 C ± C từ 24h ± 2h Nhóm 23- 08DSH2 12 Enterobacter sakazakii Sau ủ có màu tím chứng tỏ phản ứng dương tính Màu vàng chứng tỏ âm tính (Hình 3) Hình Kết phép thử decarboxylaza L-Lysin, L-Ornithing, L-Ariginin • Phép thử lên men loại đường khác nhau: Dùng vòng cấy, que cấy đĩa thủy tinh lấy khuẩn lạc chọn cấy vào bề mặt môi trường lỏng lên men hydrat carbon Ủ ống 30 C ± C từ 24h ± 2h Sau ủ có màu vàng chứng tỏ phản ứng dương tính Màu đỏ chứng tỏ âm tính • Phép thử sử dụng xitrat: Dùng vòng cấy, que cấy đĩa thủy tinh lấy khuẩn lạc chọn cấy vào bề mặt môi trường Simmons xitrat Ủ ống 30 C ± C từ 24h ± 2h Sau ủ môi trường chuyển sang màu xanh chứng tỏ phản ứng dương tính.(Hình 4) Nhóm 23- 08DSH2 13 Enterobacter sakazakii Đối chứng trắng Nhóm 23- 08DSH2 Phản ứng âm tính Phản ứng dương tính 14 Enterobacter sakazakii Phản ứng âm tính Đối chứng trắng Phản ứng dương tính Hình Kết thử nghiệm xitrat 2.1.5.6 Diễn giải kết quả: Nhóm 23- 08DSH2 15 Enterobacter sakazakii Phép thử khẳng định Phản ứng dương tính âm tính Phần trăm chủng Enterobacter sakazakii Sinh màu vàng + cho phản ứng >99 Oxidaza - >99 Decarboxylaza L-lysin - >99 Decarboxylaza L-Ornithin + ±90 Dihydrolaza L-Arginin + >99 -lên men D-sorbitol - ±95 -lên men L-rhamnoza + >99 -lên men D-sucroza + >99 -lên men D-melibioza + >99 -lên men amygdalin + >99 + >95 Axit sinh từ việc -thủy phân xitrat Phương pháp đếm khuẩn lạc: 2.1.1 Nguyên tắc: Nhóm 23- 08DSH2 16 Enterobacter sakazakii Brilliance™ Enterobacter sakazakii Agar (công thức chuẩn Chromogenic Enterobacter sakazakii Agar) môi trường sử dụng cho việc phân lập đếm Enterobacter sakazakii từ mẫu thực phẩm Công thức * Tryptone Soya peptone Sodium chloride Ferric ammonium citrate Sodium desoxycholate Sodium thiosulphate Chromogen Agar pH 7.3 ± 0.2 @ 25°C gm/lít 15.0 5.0 5.0 1.0 1.0 1.0 0.1 15.0 2.1.2 Cách tiến hành: Cân 43.1g Brilliance Enterobacter sakazakii Agar đổ vào lít nước cất Lắc đun sôi đến hòa tan hoàn toàn Thanh trùng nồi hấp 121°C vòng 15 phút làm nguội đến 50°C Trộn đổ vào đĩa Petri 2.1.3 Mô tả thí nghiệm: Brilliance Enterobacter sakazakii Agar (DFI formulation1) dựa phản ứng α glucosidase , phản ứng dựa kết hợp chặt chẽ chất chromogenic 5bromo-4-chloro-3-indolyl- α -D-glucopyranoside có mặt môi trường Enzyme α glucosidase, diện Enterobacter sakazakii, chất hydrolyses sinh khuẩn lạc màu xanh đĩa môi trường màu vàng xám Proteus vulgaris có hoạt tính α -glucosidase dương tính yếu phát triển để sinh khuẩn lạc có màu tương tự E sakazakii Tuy nhiên, môi trường này, Proteus spp mọc lên khuẩn lạc màu xám: chúng sản sinh hydrogen sulphide diện ferric ions hình thành nên ferrous sulphide Desoxycholate có tác dụng làm ẩn phát triển hầu hết vi sinh vật Gram dương Nhóm 23- 08DSH2 17 Enterobacter sakazakii Phương pháp FDA cho phép phát Enterobacter sakazakii dựa việc sản sinh đốm màu vàng theo nghiên cứu Muytjens et al.4 Các mẫu giữ ấm nước qua đêm, sau làm giàu môi trường EE broth (CM0317), bước sử dụng môi trường VBRGA (CM0485) để đồng hóa Enterobacteriaceae khuẩn lạc chọn lọc xếp dãy môi trường Tryptone Soya Agar (CM0131), giữ ấm ngày quan sát màu vàng khuẩn lạc, đặc trưng cho Enterobacter sakazakii (Hình 5).Tuy nhiên , phương pháp không cho phép phân lập Enterobacter sakazakii việc kết hợp EE broth với VRBGA cho phép dòng khác Enterobacteria phát triển vượt trội Enterobacter sakazakii đồng thời cho kết âm tính sai Điều chứng tỏ chọn lọc khuẩn lạc Enterobacter sakazakii từ thạch VRBGA Hình Khuẩn lạc E.sakazakii 2.2 Phương pháp đại(PCR): 2.2.1 Chuẩn bị mẫu thử: - Có tổng cộng 22 mẫu thực phẩm bao gồm mẫu sữa sản phẩm thức ăn khác cho trẻ sơ sinh lấy từ siêu thị địa phương miền nam Châu Phi - Đối với mẫu thực phẩm: Đặt 100g sản phẩm vào bình chứa vô trùng thêm 900ml nước cất vô trùng nhiệt độ 45oC Hỗn hợp ủ qua đêm 37 oC, sau có thứ ba lấy 2ml mẫu để tách chiết DNA - Đối với sản phẩm sữa tiệt trùng, bình chứa ủ trực tiếp qua đêm 37 oC Sau 10ml mẫu ủ chuyển vào canh trường EE ủ qua đêm 37 oC mẫu nhân lên ba lần lấy để chiết xuất DNA 2.2.2 Tách chiết DNA: Nhóm 23- 08DSH2 18 Enterobacter sakazakii Tách DNA thực theo phương pháp sửa đổi Van Elsas Trước chiết xuất DNA, 2ml mẫu ly tâm mức 5900 x g 10 phút Sau ly tâm ta loại bỏ phần lỏng, lấy phần cặn bỏ thêm thành phần sau: + hạt thủy tinh tiệt trùng (0.6g) (có đường kính 0.2-0.3 mm) + 800 µl đệm phosphat (1 phần 120 mM NaH2PO4 phần 120 mM Na2HPO4) + 700 µl phenol + 100 µl sodium dodecyl sulfate (SDS) 20%(m/v) Sau hỗn hợp ly tâm phút ủ nhiệt độ 60 oC 20 phút lặp lại bước tiến hành lần Sau ủ, mẫu ly tâm phút mức độ 1500 x g Dịch thu lại protein tách chiết với 600 μl phenol Tiếp theo ta cho 600 µl hỗn hợp phenol: chloroform: isoamylalcohol (25:24:1) kỳ trung gian DNA kết tủa 0,1g sodium acetate 3M (NaOAc) (pH 5.5) 0,6 g isopropanol Các mẫu lưu giữ tủ lạnh khoảng sau ly tâm 10 phút 15000 x g 2.2.3 Khuếch đại PCR: 2.2.3.1 Thiết kế mồi: Các cặp mồi Esak2 (5 'CCC GCA TCT CTG CAG TCT GAT C 3') Esak3 (5 'CTA ATA CCG CAT AAC GTC TAC G 3') phát triển cho khuếch đại đặc trưng E sakazakii 2.2.3.2 Phản ứng PCR: a) Chuẩn bị mẫu phản ứng: - Phản ứng phát PCR thực tổng thể tích phản ứng 25 µl có chứa 1U (0,35 µl ) Taq ADN polymerase, 2,5 µl đệm magie tự cung cấp với enzyme, mM (1,5 ml)MgCl2, µl dimethyl sulfoxide (DMSO), mM (1 µl ) dNTPs, 0.5 μM (0,5 ml) mồi 750 μg / ml (1 µl ) mẫu DNA - Đối với mẫu đối chứng dương ta lấy µl chiết xuất DNA từ môi trường tinh E sakazakii mẫu đối chứng âm ta thay DNA mẫu µl nước cất vô trùng b) Cách tiến hành PCR: Nhóm 23- 08DSH2 19 Enterobacter sakazakii Phản ứng khuếch đại PCR thực cách sử dụng Mastercycler (Eppendorf, Đức) điều kiện khuếch đại sau: - Hỗn hợp phản ứng giữ 95 ° C phút cho biến tính ban đầu, 35 chu kỳ 35 giây 95 ° C cho biến tính thêm - phút 61 ° C cho mồi ủ - phút 72 ° C để kéo dài chuỗi chuỗi cuối kéo dài 10 phút 72 ° C c) Kết cấu IAC (internal amplification control): Một phản ứng PCR sử dụng cặp mồi Esak2 Esak3 thực DNA lấy từ tế bào tinh E sakazakii phát triển môi trường TSA 10 µl 850 bp PCR amplicon phân giải với U (1 µl ) enzym AluI endonuclease cắt hạn chế, với diện đệm hạn chế (1,5 µl ) 2,5 µl nước cất vô trùng Sau hỗn hợp phản ứng ủ qua đêm 37 ° C Các sản phẩm tiêu hóa điện di 3% (m / v) agarose gel có chứa Ethidium bromide biểu diễn tia UV Hai kết phân đoạn chứa vị trí liên kết mồi tương ứng cắt từ gel agarose làm cách sử dụng sản phẩm làm PCR tinh cao theo đặc điểm kỹ thuật nhà sản xuất (Hình 1) Nhóm 23- 08DSH2 20 Enterobacter sakazakii Sau làm sạch, 10 µl đoạn nối lại sử dụng U (1 ml) T4 DNA ligase Một phản ứng khuếch đại PCR thực đoạn nối cách sử dụng PCR mồi Esak2 Esak3 mô tả Các kết Sản phẩm PCR nhân vô tính cách sử dụng Inst / AcloneTM sản phẩm PCR nhân Các tế bào biến đổi sàng lọc chèn kích thước mồi T7 (5'-GTA ATA ATA CGA CTC ACT GGG-3 ') SP6 (5'-TAC GAT TTA GGT GAC ACT ATA G-3 ') PCR thực tổng thể tích phản ứng 50 μl có chứa 0,5 μM (2μl) mồi, 0.5 mM (2μl) dNTPs,1 U (1,5 ml) Taq ADN polymerase, đệm chứa MgCl2 (5 ml) cung cấp với enzyme tế bào chuyển đổi Plasmid DNA phân lập từ chủng tái tổ hợp cách sử dụng Qiagen Midi plasmid kit Các DNA plasmid sử dụng IAC tất PCR phản ứng để phát E sakazakii Nam Phi sữa thức ăn cho trẻ Việc xây dựng IAC lập trình tự với Esak3 mồi cách sử dụng chuỗi DNA ABI PRISM 377 sở trình tự DNA Đại học Stellenbosch Điều thực để xác nhận diện vị trí kết nối hai mồi kích thước xác IAC Nhóm 23- 08DSH2 21 Enterobacter sakazakii Sau xác định nồng độ DNA DNA plasmid bị cô lập, nồng độ tối ưu tạo tín hiệu dương tính cho hai E sakazakii DNA IAC xác định Phần phân ước ml IAC thêm vào tất phản ứng PCR thực hiện, không bao gồm mẫu đối chứng dương mẫu đối chứng âm 2.2.4 Kết PCR: Sau cắt cặp base có kích thước 850 (bp) từ sản phẩm PCR E sakazakii, hai đoạn chứa vị trí liên kết cặp mồi (79 161 bp kích thước) gắn với IAC kích thước 240 bp IAC phát triển để ngăn ngừa kết âm tính giả (Hoorfar et al., 2004) đoạn dương tính cho hai DNA mục tiêu (850 bp) IAC (240 bp) với nồng độ tối thiểu 0,72 pg.ml-1 IAC thêm vào hỗn hợp phản ứng PCR IAC có giá trị để ngăn chặn kết âm tính giả thị phản ứng PCR thất bại Trong kết thí nghiệm này, diện 850 bp sản phẩm khuếch đại PCR cho thấy có mặt E sakazakii, đoạn 240 bp cho thấy khuếch đại PCR thành công Nhóm 23- 08DSH2 22 Enterobacter sakazakii Kết luận: Enterobacter sakazakii phát mẫu tổng số 22 mẫu ( chiếm 18% sản phẩm thử nghiệm)(Bảng 1) Điều chứng minh sử dụng phương pháp PCR có hiệu sau mẫu tăng sinh canh trường EE Như tương lai phương pháp PCR kết hợp với IAC dùng phương pháp nhanh chóng xác để phát E sakazakii sản phẩm từ IFM phương pháp xác định truyền thống Nhóm 23- 08DSH2 23 Enterobacter sakazakii CHƯƠNG III KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 3.1 Kết luận: Sự diện Enterobacter sakazakii IFM nên coi nguy nghiêm trọng tiềm vi sinh vật nhân lên trình chuẩn bị bảo quản sữa trước tiêu thụ sản phẩm sữa hoàn nguyên (Anon., 2004) Enterobacter sakazakii vi sinh vật môi trường phải khuyến cáo tất nguyên liệu thô sản phẩm cuối phải kiểm tra đánh giá cao diện trực khuẩn để ngăn chặn lây nhiễm có sản phẩm sữa bột phân phối Thậm chí việc nhiễm E sakazakii với tỷ lệ thấp gây rủi ro cho trẻ sơ sinh, đó, điều quan trọng phải giáo dục người bậc cha mẹ cách chăm sóc trẻ sơ sinh nguy tiềm ẩn liên quan đến việc sử dụng không phù hợp IFM 3.2 Đề nghị: Đối với báo cáo nhóm gặp khó khăn việc tìm kiếm nguồn thông tin để xác định cấu trúc chế gây bệnh loài chưa xác định cụ thể Chúng hy vọng cung cấp thêm tài liệu để hoàn thành tốt báo cáo Hiện giới việc nhiễm trùng IFM Enterobacter sakazakii báo cáo Việt Nam số chưa thống kê rõ ràng Chính thế, nước ta nên có số cụ thể số lượng trẻ sơ sinh bị nhiễm E sakazakii nhằm mục đích khuyến cáo đến người tiêu dùng việc lựa chọn sản phẩm IFM nước Việc sản xuất sữa quan tâm đến hàm lượng tiêu chất dinh dưỡng DHA, sắt, loại vitamin, protein, lipit… mà không trọng đến tiêu vi sinh (sự diện loài vi khuẩn có hại, đặc biệt Enterobacter sakazakii) phần làm ảnh hưởng đến chất lượng sữa đe dọa sức khỏe trẻ sơ sinh CHƯƠNG IV TÀI LIỆU THAM KHẢO Nhóm 23- 08DSH2 24 Enterobacter sakazakii 1- Lê Văn Mẫn(chủ biên), Lại Mai Hương - Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm- NXB ĐH Quốc Gia TPHCM 2- Sữa sản phẩm sữa- Phát Enterobacter sakazakii – TCVN 7850:2008 3- Các trang web tham khảo: http://scholar.sun.ac.za/bitstream/handle/10019.1/3097/Kemp,%20F.pdf?sequence=1 http://www.iss.it/binary/publ/cont/275%20-%20ANN_08_39%20Fiore.1224498732.pdf http://www.pjbs.org/pjnonline/fin1712.pdf http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1563671/ http://journals.uzpi.cz/publicFiles/13828.pdf http://nguyenanhvn.com/san-pham/moi-truong-vi-sinh-brilliance-enterobactersakazakii-agar-cong-thuc-dfi 1847.html Nhóm 23- 08DSH2 25 [...]... tiêu vi sinh (sự hiện diện của các loài vi khuẩn có hại, đặc biệt là Enterobacter sakazakii) đã phần nào làm ảnh hưởng đến chất lượng sữa đe dọa sức khỏe đối với trẻ sơ sinh CHƯƠNG IV TÀI LIỆU THAM KHẢO Nhóm 23- 08DSH2 24 Enterobacter sakazakii 1- Lê Văn Mẫn(chủ biên), Lại Mai Hương - Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm- NXB ĐH Quốc Gia TPHCM 2- Sữa và sản phẩm sữa- Phát hiện Enterobacter sakazakii. .. trưng cho Enterobacter sakazakii (Hình 5).Tuy nhiên , phương pháp này không cho phép phân lập Enterobacter sakazakii và việc kết hợp EE broth với VRBGA có thể cho phép các dòng khác ngoài Enterobacteria phát triển vượt trội hơn Enterobacter sakazakii đồng thời cho kết quả âm tính sai Điều này chứng tỏ rằng không thể chọn lọc khuẩn lạc Enterobacter sakazakii từ thạch VRBGA Hình 5 Khuẩn lạc của E .sakazakii. .. Nhóm 23- 08DSH2 13 Enterobacter sakazakii Đối chứng trắng Nhóm 23- 08DSH2 Phản ứng âm tính Phản ứng dương tính 14 Enterobacter sakazakii Phản ứng âm tính Đối chứng trắng Phản ứng dương tính Hình 4 Kết quả của thử nghiệm xitrat 2.1.5.6 Diễn giải kết quả: Nhóm 23- 08DSH2 15 Enterobacter sakazakii Phép thử khẳng định Phản ứng dương tính hoặc âm tính Phần trăm chủng Enterobacter sakazakii Sinh màu vàng +... -lên men D-melibioza + >99 -lên men amygdalin + >99 + >95 Axit sinh ra từ việc -thủy phân xitrat Phương pháp đếm khuẩn lạc: 2.1.1 Nguyên tắc: Nhóm 23- 08DSH2 16 Enterobacter sakazakii Brilliance™ Enterobacter sakazakii Agar (công thức chuẩn Chromogenic Enterobacter sakazakii Agar) là môi trường sử dụng cho việc phân lập và đếm Enterobacter sakazakii từ mẫu thực phẩm Công thức * Tryptone Soya peptone... hoàn nguyên (Anon., 2004) Enterobacter sakazakii là một vi sinh vật môi trường và do đó phải khuyến cáo rằng tất cả các nguyên liệu thô và các sản phẩm cuối cùng phải được kiểm tra và đánh giá cao về sự hiện diện của trực khuẩn này để ngăn chặn sự lây nhiễm có trong các sản phẩm sữa bột được phân phối Thậm chí việc nhiễm E sakazakii với tỷ lệ thấp vẫn có thể gây rủi ro cho trẻ sơ sinh, do đó, điều quan... phẩm bao gồm các mẫu sữa và các sản phẩm thức ăn khác nhau cho trẻ sơ sinh lấy từ các siêu thị địa phương ở miền nam Châu Phi - Đối với mẫu thực phẩm: Đặt 100g sản phẩm vào bình chứa vô trùng và thêm 900ml nước cất vô trùng ở nhiệt độ 45oC Hỗn hợp này được ủ qua đêm ở 37 oC, sau khi có bản sao thứ ba thì lấy 2ml mẫu để tách chiết DNA - Đối với sản phẩm sữa tiệt trùng, các bình chứa được ủ trực tiếp qua... của E sakazakii, trong khi một đoạn 240 bp cho thấy sự khuếch đại PCR đã thành công Nhóm 23- 08DSH2 22 Enterobacter sakazakii Kết luận: Enterobacter sakazakii được phát hiện trong 4 mẫu trên tổng số 22 mẫu ( chiếm 18% sản phẩm thử nghiệm)(Bảng 1) Điều này chứng minh sử dụng phương pháp PCR có hiệu quả sau khi mẫu tăng sinh trong canh trường EE Như vậy trong tương lai phương pháp PCR kết hợp với IAC... triển của hầu hết vi sinh vật Gram dương Nhóm 23- 08DSH2 17 Enterobacter sakazakii Phương pháp FDA hiện nay cho phép phát hiện Enterobacter sakazakii dựa trên việc sản sinh ra đốm màu vàng theo nghiên cứu của Muytjens et al.4 Các mẫu được giữ ấm trong nước qua đêm, sau đó được làm giàu trong môi trường EE broth (CM0317), bước tiếp theo sử dụng môi trường VBRGA (CM0485) để đồng hóa Enterobacteriaceae... với tỷ lệ thấp vẫn có thể gây rủi ro cho trẻ sơ sinh, do đó, điều quan trọng là phải giáo dục mọi người nhất là những bậc cha mẹ về cách chăm sóc đối với trẻ sơ sinh và các nguy cơ tiềm ẩn liên quan đến việc sử dụng không phù hợp của IFM 3.2 Đề nghị: Đối với bài báo cáo này nhóm chúng tôi đã gặp một ít khó khăn về việc tìm kiếm nguồn thông tin để xác định cấu trúc và cơ chế gây bệnh của loài này chưa... lạc màu vàng phát triển trên môi trường TSA b Khẳng định bằng sinh hóa: Có thể sử dụng các bộ kit thử nhỏ có bán sẵn trên thị trường để nhận dạng bằng sinh hóa để nhận dạng Enterobacter sakazakii Chọn một khuẩn lạc màu vàng từ mỗi đĩa thạch đậu tương trypton để nhận dạng bằng sinh hóa theo các phép thử sau đây: Nhóm 23- 08DSH2 11 Enterobacter sakazakii • Phép thử oxidaza: Dùng kim cấy sử dụng một lần ... chủ (nhất trẻ sơ sinh) sinh vật gắn vào bề mặt màng plastics lớp silicon, phát triển lớp màng biofim Việc nhiễm E sakazakii trẻ sơ sinh dễ xảy trình pha chế sữa cho trẻ, trực khuẩn tồn với số lượng... Động kinh 1.8 Các biện pháp phòng xử lý bệnh: - Đối với trẻ sơ sinh tuổi biện pháp tốt cho bé bú sữa mẹ Việc xem điều lý tưởng để chăm sóc trẻ sơ sinh - Trong trường hợp người mẹ lý không trực... bột phân phối Thậm chí việc nhiễm E sakazakii với tỷ lệ thấp gây rủi ro cho trẻ sơ sinh, đó, điều quan trọng phải giáo dục người bậc cha mẹ cách chăm sóc trẻ sơ sinh nguy tiềm ẩn liên quan đến việc