BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÌNH DƯƠNG KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN CNSH ĐỀ TÀI: KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY NẤM MEN RHODOTOR ULA SP TRÊN MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN GVHD: Th.S NGUYỄN MINH KHANG Th.S TRƯƠNG HUỲNH HUY SVTH: NGUYỄN THANH TRÚC BÌNH DƯƠNG – 2009 TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÌNH DƯƠNG KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THANH TRÚC KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY NẤM MEN ROHODOTO RULA SP TRÊN MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC: CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC PHẨM NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC Th.S Nguyễn Minh Khang Th.S Trương Huỳnh Huy Bình Dương – 2009 Chương MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Xã hội ngày phát triển kéo theo phát triển ngành khoa học kỹ thuật Công nghệ sinh học trở thành ngành quan tâm hàng đầu giới nói chung Việt Nam nói riêng Công nghệ sinh học phát triển nhanh chóng tạo cách mạng sinh học ngành nông nghiệp công nghiệp thực phẩm, làm thay đổi phương thức sản xuất ngành y dược, lượng khai khoáng bảo vệ môi trường Đối với Việt Nam, đất nước nông nghiệp việc ứng dụng xử lý tái chế nguồn phế phụ phẩm từ động vật thực vật ngành sản xuất nông nghiệp công nghệ thực phẩm, biến đổi nguồn nguyên liệu rẻ tiền để tạo sản phẩm có chất lượng cao, giảm nguy ô nhiễm môi trường mang lại hiệu kinh tế cho xã hội Vitamin A có vai trò quan trọng đời sống người vật nuôi Nguồn nguyên liệu thực vật vi sinh vật xem nguồn cung cấp dồi sắc tố carotenoid nói chung tiền vitamin A nói riêng Và giống nấm men có khả tổng hợp sắc tố carotenoid chủ yếu beta-caroten Rhodotorula sp Beta-caroten hợp chất có hoạt tính sinh học cao có vai trò quan trọng người động vật Các nhà khoa học chứng minh tỷ lệ beta-caroten thức ăn gắn liền với việc giảm nguy nhiều bệnh ung thư, trẻ hóa da, giảm tỷ lệ tử vong bệnh tim mạch,… Với lợi ích vậy, ứng dụng trình lên men bán rắn từ phụ phẩm dồi rẻ tiền ngành công nghiệp thực phẩm, nông nghiệp,… Đây mục tiêu đề tài “Khảo sát điều kiện nuôi cấy nấm men Rhodotorula sp môi trường bán rắn” 1.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Lựa chọn môi trường bán rắn thích hợp cho việc nuôi cấy nấm men đỏ Rhodotorula sp - Tối ưu hóa thành phần môi trường nuôi cấy - Thử nghiệm sản xuất kiểm tra hàm lượng beta-caroten chế phẩm từ nấm men đỏ Rhodotorula sp môi trường tối ưu 1.3 MỤC ĐÍCH ĐỀ TÀI Khảo sát điều kiện tối ưu cho phát triển nấm men đỏ Rhodotorula sp môi trường bán rắn thông qua việc tận dụng nguồn nguyên vật liệu phụ phẩm rẻ tiền từ ngành nông nghiệp, công nghiệp, công nghiệp thực phẩm,… để thu lượng sinh khối cao Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ NẤM MEN 2.1.1 Tổng quan nấm men [2], [6], [7], [12] Nấm men tên chung để nhóm nấm thường có cấu tạo đơn bào thường sinh sản vô tính theo lối nảy chồi Nấm men không thuộc nhóm phân loại định, chúng thuộc ngành Nấm túi (Ascomycota) ngành Nấm đảm (Basidiomycota) Nấm men phân bố rộng rãi tự nhiên: đất, nước, lương thực thực phẩm, rau quả,… Đặc biệt chúng diện nhiều môi trường chứa đường, pH thấp: đất trồng nho ăn Nấm men có khả sinh sản nhanh chóng, sinh khối giàu protein, vitamin lipid Vì chúng sử dụng rộng rãi công nghệ chế biến rượu trắng, rượu vang, bia, cồn, thức ăn bổ sung cho người gia súc, làm nở bột mì, gây hương nước chấm, làm dược phẩm, sản xuất enzym, sản xuất acid citric từ khí thiên nhiên, sản xuất riboflavin (vitamin B2), Bên cạnh nhiều nấm men có ích có loại nấm men gây bệnh (Candida, Mycoderma) 2.1.2 Hình dạng kích thước tế bào nấm men [3], [7] · Hình dạng nấm men [7] Nấm men thường có cấu tạo đơn bào Hình dạng tế bào nấm men thường thay đổi tùy theo loài, phần phụ thuộc vào tuổi giống điều kiện ngoại cảnh, điều kiện nuôi cấy Nói chung nấm men thường có hình trứng, bầu dục (Saccharomyces serevisiae), hình cầu (Candida utilis), hình oval elip, hình ống (Pychia), hình trụ, hình chanh, hình tam giác,…và số hình dạng đặc biệt Hình dạng nấm men không ổn định, phụ thuộc vào tuổi nấm men điều kiện nuôi cấy Ngoài số loài nấm men có tế bào hình que nối với thành sợi gọi khuẩn ty khuẩn ty giả, thường gặp giống Endomycopsis, Candida, Trichosporon · Kích thước tế bào nấm men [7] Kích thước tế bào nấm men thay đổi nhiều, theo giống, loài, hay tuổi sinh lý Nói chung thường to tế bào vi khuẩn từ ÷ 10 lần Kích thước trung bình tế bào nấm men · Chiều dài: ÷ 10 μm · Chiều rộng: ÷ μm Các loài nấm men đơn bào công nghiệp thường có kích thước – μm x 5- 10 μm 2.1.3 Dinh dưỡng nấm men · Thành phần hóa học tế bào nấm men [12] Thành phần chủ yếu nước (nước liên kết nước tự do) - khoảng 75% khối lượng chung Thành phần sinh khối khô nấm men sau (%): - Chất hữu cơ: – 10 - Cacbon: 25 – 50 - Nitơ: 4.8 – 12 - Protein ( N x 6.25): 30 – 75 - Lipid: 2– Chất khô tế bào nấm men gồm có 23 – 28 % chất hữu – % chất tro Chất hữu gồm có (%): Protein 13 -14 %, glucogen – %, xenluloza 1,8 -2 %, chất béo 0,5 – % · Dinh dưỡng nấm men [12] Dinh dưỡng nấm men thường chia làm hai nguồn dinh dưỡng Đó dinh dưỡng ngoại bào dinh dưỡng nội bào Chất dinh dưỡng ngoại bào thấm qua màng vào tế bào từ chất môi trường nuôi cấy bên Khi tế bào trạng thái môi trường bên nghèo cạn chất dinh dưỡng chất dự trữ nội bào glycogen, tregeloza, lipit, hợp chất chứa N sử dụng – dinh dưỡng nội bào Các chất dinh dưỡng sử dụng vào thành phần tế bào phục vụ cho sinh trưởng cung cấp lượng cần thiết cho đời sống tế bào · Dinh dưỡng cacbon [12], [4] Nguồn dinh dưỡng carbon nấm men bao gồm loại hợp chất hữu khác đường, rượu, acid hữu cơ, acid amin,… Hầu hết loài nấm men enzyme polyhydrolase có amylase cellulase Vì vậy, nấm men không sử dụng trực tiếp tinh bột cellulose hemicellulose Đường nguồn carbon quan trọng cho nấm men sử dụng đặc biệt đường glucose thuộc loại đường (hexose) thông dụng cho tất loài nấm men Glucose coi nguồn carbon vạn vi sinh vật Tỷ số đường sử dụng đặc điểm riêng loài nấm men Đối với nguồn carbon khác rượu acid hữu đặc điểm giống tất loài nấm men Các loài Saccharomyces lên men rượu vang sử dụng glucose, fructose, maltose, saccharose galactose, với rafinose sử dụng phần Với lactose, melibiose, dextrin, pentose tinh bột lại hoàn toàn không sử dụng Trong môi trường có hỗn hợp nguồn carbon dinh dưỡng nguồn cung cấp cho nấm men sinh trưởng tốt ưu tiên sử dụng trước, tính sử dụng nguồn carbon canh trường gọi tính đa dưỡng nấm men Trong trình nuôi cấy glucose fructose sử dụng trước hết Những loài nấm men giống đồng hóa vật chất Các loài khác (dù giống) đồng hóa nguồn dinh dưỡng khác Những disaccharide (maltose saccharose) trước nấm men sử dụng phải qua thủy phân sơ thành đường đơn nhờ enzyme tương ứng nấm men Các acid hữu chiếm vị trí quan trọng trao đổi chất nấm men Chúng kích thích ức chế sinh trưởng nấm men Chúng nguồn dinh dưỡng carbon lượng Các acid béo có mạch carbon tương đối dài (từ ÷ 10) nấm men sử dụng nồng độ môi trường thấp (0,02 ÷ 0,05 %) Ở nồng độ cao ức chế nấm men phát triển Acid béo có từ C12 ÷ C17 carbon phân tử sử dụng tùy thuộc vào chủng loại nấm men · Dinh dưỡng nitơ [12], [4] Nguồn nitơ cần thiết cho tế bào nấm men thường hợp chất hữu vô có sẵn môi trường Thông thường, nitơ tế bào nấm men thường vào khoảng ÷ 10 %, lên tới 12% vật chất khô Để tạo thành 10 tỷ tế bào nấm men chi phí nitơ điều kiện kị khí 66 ÷ 67 mgN, điều kiện hiếu khí 37 ÷ 53 mgN Tuy nhiên hàm lượng nitơ nấm men phụ thuộc vào thành phần môi trường, điều kiện hiếu khí số lượng chất dinh dưỡng bổ sung vào môi trường chủng nấm men Các hợp chất hữu chứa nitơ tế bào acid amin, nucleotic purin pyrimidin, protein số vitamin Nguồn nitơ vô nấm men sử dụng tốt muối amoni acid vô hữu Đó muối amoni sunfat, amoni phosphat đến muối amoni acetat, amoni lactat, amoni maltat amoni sucxinat Trong môi trường có muối amoni đặc biệt sunfat nấm men sử dụng gốc amoni trước, gốc acid lại sử dụng sau sử dụng làm môi trường acid hóa, giảm pH Các nguồn nitơ hữu thường hỗn hợp acid amin, peptid, nucleic, Trong thực tế người ta hay dùng cao ngô, cao nấm men, dịch thủy phân protein tự nhiên (đậu tương, khô lạc, ) làm nguồn nitơ hữu Xếp theo thứ tự nấm men tiêu hóa tốt muối amon, acid amin, sử dụng pepton hoàn toàn không sử dụng protein Trong trình nuôi cấy nấm men acid amin vừa nguồn nitơ vừa nguồn carbon dinh dưỡng Chúng đồng thời tham gia vào phản ứng cetoacid để tạo thành acid amin chất cho nhóm amin (NH2-) · Dinh dưỡng nguyên tố vô [12], [4] Các nguyên tố vô nuôi cấy vi sinh vật nói chung, có nấm men phospho quan tâm trước hết, sau kali, magiê lưu huỳnh,… Phospho: tham gia vào thành phần quan trọng tế bào, nucleoproteic, acid nucleic, polyphosphate, phospholipid,… Các hợp chất phospho đóng vai trò xác định biến đổi hóa sinh khác nhau, đặc biệt trao đổi chất hydrocacbon vận chuyển lượng Nấm men sử dụng tốt nguồn phospho vô orthophosphate Hợp chất chuyển thành polyphosphate sau hoạt hóa dùng vào trình tổng hợp Khi không đủ phospho môi trường trao đổi chất nấm men bị thay đổi đáng kể liên quan tới phá vỡ nhu cầu sử dụng hydratcacbon nitơ Nhu cầu sinh lý phospho 10 tỷ tế bào nấm men vào khoảng 10 ÷ 13 mgP Người ta thường dùng KH2PO4, K2HPO4 dung dịch chiết từ supephosphat làm nguồn P K Trong dịch đường hóa từ tinh bột thường đủ P đáp ứng nhu cầu nấm men, rỉ đường củ cải rỉ đường mía thường thiếu P, cần phải bổ sung vào môi trường acid orthophosphoric supephosphat Lưu huỳnh thành phần số acid amin phân tử protein nhóm phụ (-SH) số enzyme CoA Bởi vậy, mặt lưu huỳnh môi trường trao đổi chất không tổng hợp protein Những chất chứa lưu huỳnh acid amin (cystine, cysteine, metionine), vitamin (tiamin, biotin) số hợp chất khác đóng vai trò quan trọng hoạt động sống nấm men Trong môi trường nuôi cấy nấm men thường có (NH4)2SO4 làm nguồn amon nguồn lưu huỳnh Trong môi trường với hàm lượng lưu huỳnh nhỏ làm tăng nảy chồi nấm men Nhưng nồng độ 1mg/l lưu huỳnh kìm hãm trình Do vậy, sử dụng nguồn lưu huỳnh dinh dưỡng cho vi sinh vật nói chung, có nấm men, cần phải thận trọng · Các ion K+, Ca2+, Mg2+ cần có môi trường nuôi cấy lên men Thông thường ion K+ bổ sung với muối phosphat sunfat, ion Ca2+, Mg2+ thường có mặt nước sinh hoạt, nhiên hàm lượng ion Ca2+, Mg2+ cao (nước cứng), cần phải loại bớt hai ion (làm mềm nước) Giúp cho trình nuôi cấy vi sinh vật hiệu · Dinh dưỡng chất sinh trưởng [12], [4] Những chất kích thích sinh trưởng vitamin, base purin pyrimidin Những nhân tố sinh trưởng nấm men sắc tố vitamin nhóm B: inozit (B8), biotin (B7 hay H), acid pantotenic (B3), tiamin (B1), pyridoxine (B6), acid nicotinic (B5 hay PP) Đối với nấm men có sắc tố đỏ cần chất sinh trưởng tiamin, có acid paraaminobenzic Trong công nghiệp thường dùng nguồn vitamin cao ngô, cao nấm men (có thể dùng dịch men tự phân hay nước chiết nấm men), nước chiết cám (cám gạo cám mì), dịch thủy phân đậu tương enzyme đặc biệt rỉ đường (cung cấp bionin) Trong thí nghiệm nuôi cấy phòng thí nghiệm vi sinh vật quy mô nhỏ dùng dịch chiết từ giá đậu, từ rau cải, bắp cải, cà chua, cà rốt, khoai tây,…làm nguồn vitamin bổ sung vào môi trường NẤM MEN RHODOTORULA SP 2.2.1 Phân loại [20] Theo phân loại Harison (1927) nấm men Rhodotorula sp thuộc: · Giới: Nấm (fungi) · Ngành: Basidiomycota · Lớp: Urediniomycetes · Bộ: Sporidiales · Họ: Sporidiobolaceae · Giống: Rhodotorula Hình 2.1 Nấm men Rhodotorula sp [20], [21] Hình 2.2 Tế bào nấm Nấm tố men Rhodotorula glutinis [19] men Rhodotorula sp gọi nấm men sinh sắc carotenoid (carotengensis), chi nấm men có khả tổng hợp tích luỹ lượng lớn sắc tố carotenoid chủ yếu β-carotene, torulene, torularhodin Năm 1921, A Harden người phân lập loài Rhodotorula mucilaginose, tiếp sau năm 1928 Harison nhiều nhà khoa học khác phân lập 34 loài, phổ biến loài Rhodotorula glutinus, Rh Mucilaginosa Rhodotorula gracilis Năm 2000, Krutzman Fell cho giống nấm men Rhodotorula sp gồm 45 loài, theo mô tả tác giả cho loài Rh mucilaginosa trước có tên gọi Rh rubra, loài tạo enzyme urease, không đồng hoá nitrate, không phát triển cycloheximide nhiệt độ 40oC loài Rh rubra thực dạng riêng loài Rh glutinis, tên gọi Rh ruba số tài liệu không thay tên Rh mucilaginosa [10] [11] Riêng tác giả người Nhật Hasegawa lại dựa vào quang phổ hấp thụ sắc tố carotenoide để chia giống nấm men Rhodotorula sp thành hai giống phụ là: Rhodotorula (hấp thụ tối đa bước sóng 610nm) Flavotorrula (hấp thụ tối đa bước sóng 450nm) Theo Lodder (1971), Koneman E.W Robert (1983), Rhodotorula sp thuộc thể đơn bào, nhóm nấm men không sinh bào tử, sợi khuẩn ty hay sợi khuẩn ty giả nhóm vi sinh vật ưa ấm, khoảng nhiệt độ hoạt động từ 20 - 400C.Chúng phân bố rộng rãi khắp nơi: đất, không khí, vỏ cây: táo, dưa hấu, dâu tây, dâm bụt,… Khi quan sát kính hiển vi tế bào nấm men Rhodotorula sp có dạng hình tròn, oval, elip đến dạng thon dài gậy Kích thước tế bào dao động khoảng ÷ μm chiều rộng, 2,5 – 10 μm chiều dài tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy độ tuổi Khuẩn lạc phát triển nhanh, bề mặt trơn nhẵn, bóng sáng mờ đục, ghồ ghề, mịn nhớt Mép khuẩn lạc cưa Khuẩn lạc có màu từ kem, hồng đến đỏ san hô có có màu vàng đỏ cam Kích thước khuẩn lạc tuỳ môi trường, đạt từ – 10 mm Quan sát kính hiển vi không hình thành sợi nấm, số có sinh sợi nấm giả phát triển, không hình thành bào tử túi.[4] 2.2.2 Hình dạng kích thước [3], [4], [12] Rhodotorula sp có nhiều hình dạng khác tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy loài khác Gồm hình trứng, hình dài, hình elip, hình cầu, tròn hình gậy Rhodotorula sp có khuẩn lạc trơn, không nhăn, có màu từ kem đến vàng đỏ Sinh trưởng sinh dưỡng: khuẩn lạc màu cam đến màu đỏ, vàng, dạng bơ nhầy Tế bào hình cầu, gần cầu, elip, trứng trứng kéo dài, thường nảy chồi đỉnh Có thể xuất sợi giả sợi thật Bảng 2.1 Hình thái tế bào số loài Rhodotorula sp nuôi cấy môi trường thạch malt từ nguồn phân lập khác [4] STT Loài Màu khuẩn lạc Hình dạng Nguồn phân lập Rh Acheniorum Hồng Dài Quả dâu, lê Rh Araucariae Hồng Tròn cầu Gỗ bách tán Rh Aurantiaca Hồng đỏ Dài Không khí, bia, đất Rh Bogoriensis Kem hồng Gậy Rh Diffluens Kem Tròn cầu, elip Rh Fujisanense Kem hồng Gậy Cây nho dại Rh Glutinis Hồng đỏ Tròn cầu Rh Graminis Hồng Tròn cầu Rh Ingeniosa Kem Tròn cầu 10 Rh Javanica Kem Dài 11 Rh Lactosa Vàng, hồng Tròn cầu Không khí đỏ 12 Rh Marina Hồng đỏ Tròn cầu Con tôm 13 Rh Minuta Hồng đỏ Tròn cầu Không khí, biển 14 Rh Mucilaginosa Kem, hồng Dài Nước, không khí, 15 (rubra) đỏ Rh Muscorum Kem nâu … Gậy nhạt 16 Rh Pallida Kem hồng Tròn cầu Nước biển, dưa leo ngâm 17 Rh Pilatii Kem Tròn cầu Cây tùng bách 18 Rh Pilimanae Hồng đỏ Tròn cầu Nước, đất 2.2.3 Cấu tạo sinh sản nấm men Rhodotorula sp [11] 2.2.3.1 Cấu tạo Các nghiên cứu cho thấy, nấm men Rhodotorula sp có hình thái cấu tạo tế bào giống loài nấm men khác, cấu tạo từ thành phần a Thành tế bào Được cấu tạo từ thành phần khác nhau, đáng kể là: glucan, manan, protein, lipit số thành phần nhỏ kitin · Glucan: hợp chất cao phân tử D-glucoza Đó polysacharit phân nhánh có liên kết β-1,3 β-1,6 Cả hai thành phần phân bố thành tế bào · Manan: hợp chất cao phân tử D-manoza, phân tử thường chứa 200 - 400 thành phần manoza Thường manan liên kết với protit theo tỷ lệ 2:1 Manan thường có mối liên kết α-1,6; α-1,3; β-1,3 Phân tử lượng chúng khoảng 5.104 · Protein: thường protein liên kết với thành phần khác manan Trong thành phần chúng chứa nhiều axit amin Phân bố màng tế bào, gần sát bào tương · Kitin: nằm phần nẩy chồi Chúng chiếm số lượng nhỏ khoảng 3% Đầu chất bền vững không bị enzym phá hủy, chúng có tác dụng bảo vệ chồi non · Ngoài thấy thành tế bào có lipit dạng phospholipit, khoảng 1% - 10 % b Màng nguyên chất Màng nguyên sinh gồm hợp chất phức tạp protein, phospholipit, enzym permerase Trong thời kì non màng nguyên sinh chất bám sát lấy thành tế bào làm cho khả trao đổi chất nấm men gặp khó khăn Ngược lại thời kì tế bào già màng nguyên sinh chất co lại, tạo thành khoảng trống tế bào chất nguyên sinh mà khả trao đổi chất nấm men gặp khó khăn Hai tượng gọi co nguyên sinh trương nguyên sinh chất