Giải trình tự gen hệ ứng dụng chuẩn đoán bệnh TH.S NGUYỄN THÁI QUỲNH ANH 04/2014 Giải mã gen người 2001: Giải mã gen người 2.7G$, 11năm Log10(price) 10 2007: 454 1M$, tháng 2008: ABI SOLiD 60K$, tuần 2001: Celera 100M$, năm 2009: Illumina, Helicos 40-50K$ 2000 2010: 5K$, vài ngày? 2012: 100$, 106 đầu đọc/array) 454 sequensing/Roche Tiến trình: Chuẩn bị thư viện DNA Emulsion PCR Pyrosequencing Emulsion PCR Biến tính mảnh DNA Biến tính: mạch ngược “gốc” biến tính từ hạt bead; mạch xuôi nối với bead khung phosphate đường DNA Bám dính: mạch ngược Bám dính: MỘT bám lên bead, primer bám mảnh DNA (ngược) với lên mạch xuôi adaptor bead Kéo dài: Polymerase khếch đại mạch xuôi từ bead đến vị trí primer Kéo dài: polymerase khuếch đại mạch xuôi từ hạt bead đến primersite; mạch ngược từ primer đến bead Lặp lại 4-5-6 (30 -60 chu kì) Technology Summary 32 Read length Sequencing Technology Throughput (per run) Cost (1mbp)* Sanger ~800bp Sanger 400kbp 500$ 454 ~400bp Polony 500Mbp 60$ Solexa 75bp Polony 20Gbp 2$ SOLiD 75bp Polony 60Gbp 2$ Helicos 30-35bp Single molecule 25Gbp 1$ *Source: Shendure & Ji, Nat Biotech, 2008 Giải trình tự gene hay gen cho nghiên cứu có liên quan Phát đột biến gene (liên quan đến ung thư, kháng thuốc), SNP (trong cá nhân hóa liệu pháp điều trị), kiểu gene (genotype virus gây bệnh)… Định danh vi khuẩn hay vi nấm dựa giải trình tự DNA gene qui định RNA ribosome (16S vi khuẩn 28S vi nấm) đặc biệt tác nhân khó định danh hay thất bại nuôi cấy từ mẫu thử Phân tích đoạn xét nghiệm dấu vân tay DNA (DNA finger printing) để nhận dạng cá nhân mối quan hệ cá nhân (pháp y), chẩn đoán tiền sanh, phát đa dạng loài… Qui trình chuẩn đoán gen IX factor gây bệnh hemophilia B  Bệnh di truyền lặn liên kết nhiễm sắc thể giới tính X, gây đột biến gen yếu tố IX  Đột biến điểm nằm rải rác khắp chiều dài gen, chủ yếu nam có NST X  Chuẩn đoán đột biến gen yếu tố IX bệnh nhân tảng để phát kiểu gen dị hợp tử người nữ => chuẩn đoán tiền sinh, phát thai nhi mắc bệnh  Gen FIX (8 exon, intron) thiết kế primer cho vùng promoter, exon, vùng polyA gen FIX  DNA máu ngoại vi  PCR=> giải trình tự đoạn Đột biến T thành C => thay đổi acid amin 23 Leucin thành Prolin Xác định khả gây bệnh bất thường T >C gen FIX làm thay Leucin > Prolin phần mền polyphene2 Khả gây bệnh bất thường cao 0.98/1, độ nhạy 0.74, độ đặc hiệu 0.96 Xuất đỉnh vị trí c68 tương ứng với T C => mang kiểu gen dị hợp, allen bình thường nucleotide T allen đột biến nucleotide C Xuất đỉnh vị trí c68 tương ứng với T => mang kiểu gen allen bình thường nucleotide T  Chuẩn đoán, xác định genotype HCV: vùng 5’NC => xác định nguồn gốc nhiễm trùng  Phát đột biến kháng thuốc HBV (lamivudine): đoạn 550 bp gen preS => 204, 204 + 207, 204+180, 204+207+180  Giải trình tự phát đột biến promoter Định danh vi khuẩn E.Coli 16S T thermophilus 16S Synechococsucs sp 16S Nuôi cấy vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm Thu nhận dich đun sôi vi khuẩn Primer 16-F 16-R chứa trình tự đặt hiệu loài vi khuẩn (527bp) PCR – điện di – tinh => giải trình tự NCBI Định danh vi nấm Vi nấm viêm xoang Mẫu bệnh phẩm DNA toàn phần Primer 28-F 28-R chứa trình tự đặt hiệu loài vi nấm gen 26s rDNA (200 bp) PCR – điện di – tinh => giải trình tự NCBI  Tình trạng phân hủy mẫu mitDNA sequencing  Mẫu DNA cổ đại: gấu hang động, mamut, Neanderthal (106 bp ) Trở ngại: nhiễm DNA người đại bacteria Ưu điểm  Giải trình tự gene, chí 24h cho gene người  Lôi ánh sáng trình tự nucleic acid tác nhân có mặt mẫu thử lấy từ vật chủ hay bệnh nhân  Công cụ nhạy cảm để phát đột biến cho dù tỷ lệ đột biến diện mẫu thử thấp  Chẩn đoán tiền sanh phát dị bội thai nhi phân tích DNA bào thai diện máu mẹ dựa ưu điểm độ nhạy cao kỹ thuật THANK-YOU! Photo by Douglas Macdonald Jeju Olle Trail -Korea [...]... và mối quan hệ cá nhân (pháp y), trong chẩn đoán tiền sanh, trong phát hiện đa dạng loài… Qui trình chuẩn đoán gen IX factor gây bệnh hemophilia B  Bệnh di truyền lặn liên kết nhiễm sắc thể giới tính X, gây ra do đột biến gen yếu tố IX  Đột biến điểm nằm rải rác khắp chiều dài của gen, chủ yếu ở nam do có 1 NST X  Chuẩn đoán được đột biến gen yếu tố IX ở bệnh nhân là nền tảng để phát hiện kiểu gen. .. sequencing Tiến trình: Chuẩn bị thư viện DNA (reversible termination) Khuếch đại bắt cầu Giải trình tự đầu ngược Khuếch đại bắt cầu và giải trình tự bằng sinh tổng hợp Khuếch đại bắt cầu x 35 chu kì Kéo dài bởi Phusion DNA Polymerase Terminal transferase bổ sung ddNTP blocker Cắt periodate của một của những oligo Giải trình tự bằng sinh tổng hợp Polony PCR Solid sequencing Tiến trình: Chuẩn bị thư viện... trình tự gene hay bộ gen cho các nghiên cứu có liên quan Phát hiện các đột biến gene (liên quan đến ung thư, kháng thuốc), các SNP (trong cá nhân hóa các liệu pháp điều trị), các kiểu gene (genotype của virus gây bệnh) … Định danh vi khuẩn hay vi nấm dựa trên giải trình tự DNA của gene qui định RNA của ribosome (16S của vi khuẩn và 28S của vi nấm) đặc biệt là các tác nhân khó định danh hay thất bại nuôi... Chuẩn đoán được đột biến gen yếu tố IX ở bệnh nhân là nền tảng để phát hiện kiểu gen dị hợp tử của người nữ => chuẩn đoán tiền sinh, phát hiện thai nhi mắc bệnh  Gen FIX (8 exon, 7 intron) thiết kế primer cho các vùng promoter, exon, vùng polyA của gen FIX  DNA máu ngoại vi  PCR=> giải trình tự từng đoạn Đột biến T thành C => thay đổi acid amin 23 Leucin thành Prolin ... Helicos sequecing Next next generation sequencing Technology Summary 32 Read length Sequencing Technology Throughput (per run) Cost (1mbp)* Sanger ~800bp Sanger 400kbp 500$ 454 ~400bp Polony 500Mbp 60$ Solexa 75bp Polony 20Gbp 2$ SOLiD 75bp Polony 60Gbp 2$ Helicos 30-35bp Single molecule 25Gbp 1$ *Source: Shendure & Ji, Nat Biotech, 2008 1 2 3 4 Giải trình tự gene hay bộ gen cho các nghiên cứu có liên... = 6*109 photons at 560nm pyrophospate Từ đom đóm, oxi hóa luciferin và tạo ra ánh sáng Khuyết điểm Ưu điểm  Chiều dài đọc 400 base (độ chính xác 99% tại base thứ 400 và cao hơn ở các base phía trước)  Công nghệ cao so với Sanger sequencing  Không cần lặp lại cloning  Thư viện DNA có thể được mã hóa và tách riêng trong suốt quá trình phâ tích kết quả  Khó phân tích các homopolymer  Chi phí cao... trình: Chuẩn bị thư viện DNA Emulsion/Wildfire PCR Giải trình tự ligation Wildfire PCR Sequencing: Fluorescently Labeled Nucleotides (ABI SOLiD) 26 Complementary strand elongation: DNA Ligase Sequencing: Fluorescently Labeled Nucleotides (ABI SOLiD) 27 5 reading frames, each position is read twice Helicos single molecule sequencer 2009 2011 Ion Torrent next generation Sequencer Pacific Bioscience single ... 5K$, vài ngày? 2012: 100$, chuẩn đoán tiền sinh, phát thai nhi mắc bệnh  Gen FIX (8 exon,... quan hệ cá nhân (pháp y), chẩn đoán tiền sanh, phát đa dạng loài… Qui trình chuẩn đoán gen IX factor gây bệnh hemophilia B  Bệnh di truyền lặn liên kết nhiễm sắc thể giới tính X, gây đột biến gen