BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRẦN H U T M Nghiên cứu xây dựng quy trình pilot sản xuất sinh khối Bacillus spp làm nguyên liệu probiotic cung cấp carotenoid U N ÁN TIẾN S DƯỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – năm 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRẦN H U T M Nghiên cứu xây dựng quy trình pilot sản xuất sinh khối Bacillus spp làm nguyên liệu probiotic cung cấp carotenoid CHUY N NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM M SỐ: 62 73 01 01 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS TRẦN CÁT ĐÔNG GS.TS NGUY N V N TH NH Thành phố Hồ Chí Minh – năm 2014 i ời cam oan Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết trình bày Luận án trung thực chưa công bố công trình khác Người viết cam đoan Trần Hữu Tâm ii Mục lục Lời cam đoan anh m c chữ viết t t Danh m c bảng Danh m c hình anh m c s đ ĐẶT VẤN ĐỀ Chư ng T NG QU N T I LI U 1.1 Vi khuẩn Bacillus 1.2 Carotenoid 1.3 Các vi sinh vật sinh carotenoid 1.4 Nghiên cứu vi khuẩn sinh carotenoid gi i t i Việt Nam 1.5 Thực phẩm chức n ng 1.6 Probiotic 1.7 Thực phẩm chức n ng probiotic đối v i sức khỏe 1.8 Lên men sản xuất sinh khối Chư ng Đ I T NG, V T LI U, THI T V PH NG PH P NGHI N CỨU 2.1 Đối tượng 2.2 Vật liệu 2.3 Trang thiết b 2.4 Phư ng pháp nghiên cứu Chư ng K T QUẢ NGHI N CỨU 3.1 Phân lập, sàng l c s b đ nh danh vi khuẩn 3.2 Khảo sát đặc điểm probiotic 3.3 Khảo sát điều kiện nuôi cấy đường cong t ng trưởng 3.4 Khảo sát đặc điểm sinh carotenoid 3.5 Khảo sát môi trường thay 3.6 Khảo sát thông số lên men thu bào tử môi trường lỏng 3.7 Lên men thu bào tử 3.8 S b xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu sinh khối 3.9 Thử nghiệm đ c tính 3.10 Khả n ng hấp thu, tích lũy carotenoid từ T14 1.1 gan chu t 3.11 Khả n ng tr tiêu chảy kháng sinh DD1.1, AT14 3.12 Khả n ng ứng d ng T14 1.1 m t số d ng chế phẩm i iv vi ix x 3 16 19 21 22 23 25 28 28 28 29 30 49 49 55 63 65 70 81 86 99 105 111 111 115 iii Chư ng N LU N 4.1 Vi khuẩn sinh carotenoid 4.2 Môi trường thay 4.3 Lên men thu bào tử tiêu chuẩn nguyên liệu sinh khối 4.4 Đ c tính hai chủng T14 DD1.1 4.5 Hấp thu, tích lũy carotenoid từ T14 1.1 gan chu t 4.6 Khả n ng điều tr tiêu chảy liên quan đến kháng sinh 4.7 Khả n ng ứng d ng bào tử T14 1.1 sinh carotenoid m t số d ng chế phẩm K T LU N KI N NGH NH M C C C C NG TR NH Đ C NG T I LI U TH M KHẢO PH L C 120 120 124 127 129 130 131 132 134 136 PL-1 iv Danh mục ch vi t t t 2SG 2xSchaeffer's sporulation agar ADN Acid Deoxyribonucleic BHT Butylated Hydroxyl Toluene BLAST Basic Local Alignment Search Tool CDSM Chemically Defined Sporulation Medium CFU Colony Forming Unit CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute CMC Carboxymethyl cellulose DNS 3,5-dinitrosalicylic acid DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl DSM Difco Sporulation Medium EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid EtOH Ethanol FAO Food and Agriculture Organization Hb Hemoglobin HCT Hematocrit HDL High Density Lipoprotein HPLC High Performance Liquid Chromatography I Intermediate IBS Irritable Bowel Syndrome IL Interleukin LDL Low Density Lipoprotein MHA Muller Hilton Agar MIC Minimal Inhibitory Concentration NA Nutrient Agar Na CMC Sodium Carboxy Methyl Cellulose NAFLD Nonalcoholic Fatty Liver Disease NB Nutrient Both v NCBI National Center for Biotechnology Information NK Natural Killer NMR Nuclear Magnetic Resonance OD Optical Density PCI Phenol Chloroform Isoamin Alcohol PCR Polymerase Chain Reaction PCV Packed cell volume PDA Photodiode Array Detector PVP Polyvinylpyrrolidone R Resistant rADN Ribosom Acid Desoxynucleic RBC Red Blood Cell RSM Response Surface Methodology S Susceptible SD Standard Deviation SDS Sodium Dodecyl Sulphat SGOT Serum Glutamic Oxaloacetic Transaminase SGPT Serum Glutamic Pyruvic Transaminase TCA Tricloacetic acid TSA Trypticase Soy Agar TSB Trypticase Soy Broth UV-Vis Ultra violet – Visible WBC White Blood Cell vi Danh mục bảng ảng 1.1 Chế phẩm chứa carotenoid lưu hành t i VN 14 ảng 1.2 Các vi sinh vật sinh carotenoid carotenoid đặc trưng 17 ảng 2.1 C chất cảm ứng cách đ c kết thử nghiệm khả n ng sinh enzym 34 ảng 2.2 Pha dung môi khảo sát tính tuyến tính 37 ảng 2.3 Môi trường từ d ch chiết tự nhiên 38 ảng 2.4 Tỉ lệ nguyên liệu d ch chiết 39 ảng 2.5 Đ n v mã hóa theo CC 40 ảng 2.6 ấu hiệu sức khỏe chu t 43 ảng 2.7 Lô chu t thử nghiệm 46 ảng 2.8 ố trí thí nghiệm 46 ảng 3.1 Kết phân lập vi sinh vật từ n i lấy mẫu 49 ảng 3.2 Các chủng có khả n ng t o bào tử màu s c môi trường SM 50 ảng 3.3 Ho t tính chống oxy hóa mẫu đối chứng 51 ảng 3.4 Ho t tính b t giữ gốc tự PPH mẫu 52 ảng 3.5 Đỉnh hấp thu m t số carotenoid đối chứng cloroform 53 ảng 3.6 Đỉnh hấp thu mẫu thử 53 ảng 3.7 Kết đ nh danh 54 ảng 3.8 Khả n ng sinh enzym chủng vi khuẩn phân lập 55 ảng 3.9 Số lượng phần tr m bào tử vi khuẩn sống sót môi trường acid 57 ảng 3.10 Số lượng phần tr m bào tử vi khuẩn sống sót muối mật 59 ảng 3.11 MIC chủng chuẩn v i kháng sinh 61 ảng 3.12 Thống kê số lo i kháng sinh b đề kháng chủng khảo sát 62 ảng 3.13 Điều kiện phát triển thích hợp chủng 64 ảng 3.14 Thời gian hệ đặc tính phát triển chủng 64 ảng 3.15 Kết khảo sát tính tuyến tính 65 ảng 3.16 Kết đ lặp l i phư ng pháp 66 ảng 3.17 Đỉnh s c k đ d ch chiết carotenoid chủng Bacillus 68 ảng 3.18 Thời gian carotenoid đ t cao chủng khảo sát 70 ảng 3.19 Hàm lượng carotenoid môi trường thay chủng Bacillus 70 ảng 3.20 Ảnh hưởng hàm lượng nguyên liệu d ch chiết 74 vii ảng 3.21 Kết khảo sát khả n ng t o bào tử lo i môi trường lỏng 75 ảng 3.22 Kết khảo sát khả n ng t o bào tử lo i môi trường r n 76 ảng 3.23 Ảnh hưởng khoáng đến sinh khối, hàm lượng carotenoid 77 ảng 3.24 Hệ số tư ng quan R2 mô hình môi trường lỏng r n 79 ảng 3.25 Giá tr p mô hình môi trường lỏng r n 79 ảng 3.26 Phư ng trình đáp ứng mô hình môi trường lỏng r n 79 ảng 3.27 N ng đ khoáng cho lượng bào tử tối ưu carotenoid theo dự đoán 80 ảng 3.28 Kết khảo sát tỷ lệ truyền chủng T14 81 ảng 3.29 Kết khảo sát tốc đ khuấy T14 82 ảng 3.30 Kết khảo sát lưu lượng oxy T14 83 ảng 3.31 Kết khảo sát lượng chủng đầu vào ảng 3.32 ảng kết khảo sát tốc đ khuấy ảng 3.33 Kết khảo sát pO2 1.1 84 1.1 84 1.1 85 ảng 3.34 Ứng d ng quy trình lên men thu bào tử T14 ĐK15K mẻ L 95 ảng 3.35 Ứng d ng quy trình lên men thu bào tử 1.1 Đ5K mẻ L 95 ảng 3.36 Giá thành môi trường thay r n so v i th ch SM 97 ảng 3.37 Ứng d ng quy trình lên men thu bào tử T14 môi trường lỏng 97 ảng 3.38 Ứng d ng quy trình lên men thu bào tử 1.1 môi trường lỏng 97 ảng 3.39 Giá thành môi trường thay lỏng so v i môi trường SM 98 ảng 3.40 Chi phí cho mẻ giá 109 bào tử/liều vi khuẩn sinh carotenoid 98 ảng 3.41 Tiêu chuẩn nguyên liệu sinh khối bào tử T14 99 ảng 3.42 Tiêu chuẩn nguyên liệu sinh khối bào tử DD1.1 100 ảng 3.43 Kiểm tra đ lặp l i phư ng pháp đếm 103 ảng 3.44 Khảo sát đ ổn đ nh nguyên liệu chứa bào tử T14 1.1 104 ảng 3.45 Cân nặng c thể chu t liều thử nghiệm cao 105 ảng 3.46 Thể tr ng chu t dùng theo thời gian thử nghiệm 107 ảng 3.47 Cân nặng c quan lô sau 60 ngày thử nghiệm 108 ảng 3.48 Các thông số huyết h c chu t sau 60 ngày thử nghiệm 109 ảng 3.49 Thông số b ch cầu chu t sau 60 ngày thử nghiệm 109 ảng 3.50 Thông số tiểu cầu chu t sau 60 ngày thử nghiệm 109 ảng 3.51 Các số sinh hóa máu chu t sau 60 ngày thử nghiệm 110 ảng 3.52 Hàm lượng carotenoid gan chu t sau tháng thử nghiệm 111 viii ảng 3.53 Tỷ lệ chu t chết sau bốn ngày thử nghiệm 112 ảng 3.54 Tỷ lệ chu t khỏi tiêu chảy sau bốn ngày thử nghiệm 112 ảng 3.55 T ng cân trung bình lô chu t sử d ng liều từ 10 bào tử trở lên 114 ảng 3.56 T ng cân trung bình lô chu t sử d ng liều 2x10 bào tử 114 ảng 3.57 Đánh giá cảm quan sữa chua bổ sung bào tử B marisflavi DD1.1 116 ảng 3.58 Đánh giá cảm quan sữa chua bổ sung bào tử B infantis AT14 116 ảng 3.59 Đ ổn đ nh bào tử vi khuẩn sinh carotenoid sữa chua 117 ảng 3.60 Đ ổn đ nh chế phẩm cốm 118 ảng 3.61 Kết theo dõi mật đ bào tử 12 tháng đối v i hỗn d ch 119 PL-49 iải h tích trì h tự: Giải trình tự gen 16S r N Bacillus infantis T14 theo phư ng pháp Sanger Kết quả: trình tự 16S r N Bacillus infantis T14 sau: AAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAATGCATAACCTCTCATGAG GTTATGCTGAAAGATGGTTTCGGCTATCACTTACAGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGT TGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCA CACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAA TGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACT CTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGGAGTAACTGCCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAG AAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCG GAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTCTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGC TCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAAtTC CACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCT GGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGT AGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAgGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAG CAAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAaGGCTGaAACTCaAAGGAATTG ACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTA CCAGGTCTTGACATCTCCTGACAACCCTAGAGATAGGGCGTTCCCCTTCGGGGGACAGGAT GACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAAC GAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGT GACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTAC ACACGTGCTACAATGGATGGTACAAAGGGCTGCAAGACCGCGAGGTTAAGCGAATCCCATA AAACCATTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCTGGAATCGCTAGT AATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGG Mất khối lượng làm khô Không 6% Thử theo ĐVN IV, ph l c 9.6, phư ng pháp (d) sử d ng tủ sấy Sấy 1,0 g mẫu nguyên liệu áp suất ≤ mm Hg, nhiệt đ 110 C Hàm lượng bào tử 6.1 Nguyên t c Nguyên liệu bào tử Bacillus infantis xử l đảm bảo đ khiết Các bào tử có khả n ng ch u nhiệt đ cao thay đổi đ t ng t áp suất thẩm thấu Trư c tiến PL-50 hành xác đ nh mật đ bào tử, mẫu thử cần xử l nhiệt để tiêu diệt tế bào sinh dưỡng Thử theo ĐVN IV chuyên luận iosubtyl 6.2 Môi trường Môi trường th ch TS 6.3 Cách thử nghiệm Chuẩn b mẫu Cân 10 g b t nguyên liệu cho vào bình tam giác chứa sẵn 90 ml NaCl 0,85% vô khuẩn, l c v i bi thủy tinh (được đ pha 10-1) Đặt hỗn d ch bể ổn nhiệt 65oC 30 ph t Pha loãng bậc 10 NaCl 0,85% để có đ pha loãng 10-2 đến 10-9 Lấy xác 0,2 ml dung d ch có n ng đ từ 10 -6 đến 10-9 cho vào đĩa th ch chuẩn b trư c, n ng đ đĩa, trải ủ 37oC 24 Sau 24 giờ, đếm số khuẩn l c vi khuẩn m c đĩa th ch (từ đ pha loãng cao đến đ pha loãng thấp nhất) Tính giá tr trung bình ( X ) đ pha Tí h độ số g Đ sống = X x Số lần pha loãng x Tiêu chu chấp thuậ : Nguyên liệu đ t yêu cầu hàm lượng bào tử 1,0 g nguyên liệu có ≥ 1010 bào tử vi khuẩn Bacillus infantis AT14 Gi i h n nhiễm khuẩn Thử gi i h n nhiễm khuẩn theo ĐVN IV, ph l c 13.6 7.1 Lấy mẫu Sử d ng 10 g nguyên liệu 7.2 Cách thử nghiệm M t mẫu chế phẩm cần xác đ nh gi i h n vi khuẩn phải thực đầy đủ thử nghiệm sau: Thử nghiệm tìm vi khuẩn gây bệnh sau: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella, Escherichia coli; c lượng số Enterobacteria đếm tổng số nấm men nấm mốc quy 1,0 g nguyên liệu Nguyên liệu phải đ t yêu cầu nêu Tính an toàn Thử theo ĐVN IV, chuyên luận iosubtyl PL-51 Cân xác 5,0 g b t nguyên liệu, thêm dung d ch NaCl 0,85% vừa đủ 10 ml, l c đến phân tán hoàn toàn Ch n mười chu t nh t tr ng Swiss tr ng lượng 20 g ± g (5 mẫu chứng mẫu thử), đánh dấu ghi tr ng lượng P o ùng b m tiêm kim cong chuyên d ng đưa hỗn d ch bào tử vào d dày chu t v i liều 0,5 g/ ml/con Chu t chứng cho uống dung d ch NaCl 0,85% vô khuẩn v i liều ml/con Theo dõi cân tr ng lượng chu t hàng ngày ngày Tiêu chu chấp hậ : Nguyên liệu đ t yêu cầu chu t t ng cân bình thường triệu chứng bất thường ảng tóm t t tiêu chuẩn nguyên liệu Thử nghiệm Hình thức Tiêu chuẩn t màu cam nh t, dễ phân tán nư c Tài liệu áp d ng TCCS Đ nh tính vi sinh vật Phải chứa bào tử Bacillus infantis AT14 TCCS Đ nh tính carotenoid Có carotenoid TCCS Đ nh danh vi sinh vật Là Bacillus infantis AT14 TCCS Mất khối lượng làm khô Không 6% ĐVN Công hiệu Phải chứa 1010 bào tử/ g nguyên liệu ĐVN Gi i h n nhiễm khuẩn Mẫu nguyên liệu Salmonella, Esherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus Mật đ nấm men nấm mốc < 100 CFU/g Mật đ Enterobacteria µm - V trí hình d ng bào tử giữa, hình oval Tế bào chứa bào tử ph ng lên - Sinh trưởng 50oC - Sinh trưởng dung d ch NaCl 10% - ONPG + ADH + LDC + ODC + CIT - H2S - Urease + IND - VP + Thủy phân gelatin + Thủy phân tinh b t - Glucose + yếu Mannitol + Inositol - Sorbitol - Rhamnose + yếu Saccarose + Melibiose - Amydaglin + yếu PL-55 + yếu Aarabinose 4.2 Đ nh danh vi khuẩn giải trình tự 16S rADN Chiết tách ADN vi hu : Môi trườ g hóa chất: Môi trường TS Môi trường TS Đệm ly giải Bacillus: 50mM EDTA, 0,1M NaCl, pH 7,5 Lysozym 20 μg/ml Phenol/chloroform/iso-amyl alcohol: 25/24/1 N-laurylsarcosin 20% RNAse 10mg/ml Natri acetat 3M, pH 4,8 Ethanol tuyệt đối l nh Ethanol 70% (tt/tt) TE0,1 Cách tiế hà h - Cấy ria Bacillus marisflavi DD1.1 lên môi trường TS , ủ 37oC 24 - Lấy khuẩn l c đ n cấy vào ml môi trường TS , ủ qua đêm 37 oC - H t 1,5 ml d ch vi khuẩn cho vào eppendorf 1,5 ml Ly tâm 8000 rpm 10 ph t, g n bỏ phần nư c Hòa cặn tế bào vào 400 μl dung d ch đệm ly giải Bacillus - Thêm 50 μl (20 mg/ml) lysozym, vortex nhanh, ủ 37 oC 10 ph t - Thêm μl N-laurylsarcosin 20%, lật tube p ngửa nhẹ nhàng nhiều lần Ủ 37 oC ph t - Thêm 300 μl PCI (phenol:chloroform:isoamin alcohol), vortex 30 giây - Ly tâm 8000 rpm 10 ph t - H t phần nư c sang eppendorf 1,5 ml m i, bổ sung thêm 1/10 thể tích natri acetat 3M (pH= 4,8) khoảng 50 μl - Thêm ml etanol tuyệt đối l nh, lật tube p ngửa 10 lần, N tủa etanol - Ly tâm 8000 rpm ph t, g n bỏ phần nư c - Rửa v i etanol 70% Ly tâm 8000 rpm ph t, g n bỏ phần nư c nổi, để khô không khí - Thêm 100 μl TE0,1, vortex, ủ 65 oC để N tan hết PL-56 - N oC thời gian ng n -20 oC thời gian dài ảo quản Khuếch đại ti h trì h tự 16S rADN: óa chất: - N nhiễm s c thể B marisflavi DD1.1 ung d ch đệm PCR 10X (KCl 500 mM, Tris-Cl 100 mM pH 8,8, DTT 30 mM, BSA 1mg/ml) - dNTP 10 mM - MgCl2 25 mM - M i xuôi (P1) 100 mM (5’-GCGGCGTGCCTAATACATGC-3’) - M i ngược (P2) 100 mM (5’-CACCTTCCGATACGGCTACC-3’) - Taq ADN polymerase - Nư c khử ion tiệt trùng - Eppendorf 0,2 ml có thành mỏng ch u nhiệt Ti n hành - Thành phần phản ứng PCR sau: µl N Bacillus marisflavi DD1.1, 5μl đệm PCR 10 X, μl dNTP 10mM, 0,5 μl m i xuôi P1 0,5 μl m i ngược P2, 0,2 μl Taq N polymerase U/ μl nư c khử khoáng vừa đủ 50µl - Chu trình phản ứng chu kỳ: 95oC ph t; 30 chu kỳ: 95 oC ph t, 54 oC 45 giây, 72oC ph t cuối chu kỳ 72 oC ph t Sản phẩm PCR có kích thư c khoảng 1473 bp - Sản phẩm 16S r N đánh giá điện di gel agarose 1% - Sản phẩm PCR sau tinh s ch sản phẩm PCR, theo hư ng dẫn nhà sản xuất iải h tích trì h tự: Giải trình tự gen 16S r N Bacillus marisflavi 1.1 theo phư ng pháp Sanger Kết quả: trình tự 16S r N Bacillus marisflavi 1.1 sau: CGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAA CCGGGGCTAATACCGGATAACACCTACCCCCGCATGGGGGAAGGTTGAAAGGTGGCTTCGG CTATCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAG GCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCA GACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAA PL-57 CGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTG CCGTTCGAATAGGGCGGCGCCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGC CAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCG CGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAgCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGA AACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCAAGTGTAGCGGTGAAAaTGCG TAGAGATGTGGAGGgAACTCCAGTGGCGAAGCGACTTTtCTGGTCTATAACTGACGTTGAG GCGGGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGGATACCCTGGTAGTCCCGCCATCAACGATG AGTAATAAGTGTTAGAGGGTTCCACCTCTAGGCAACAGCAAACGCATTAAGCACTGCGCCT GGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTAGA GCATTGGTTTAATTAGAAGCAAAGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGAAATCTCCTGCAACC CTAGAGATGAGGCTTTCCCCTTCGGGGGACAGGATGACAGGTAGTGCATGGTTGTCGTCAG TTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCACCGAGCGCACCCCTAGATCTTAGTAGCC AGCAATAAGTTGGGCACTATAAGGGGACTGCGGGTGCCAAACCGGAGGAAGGTGGGGAGGA CGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAAA GGGCGGCAAGACCGCGAGGTTAAGCGAATCCAATAAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGCAGG CTGCAACTCGCCTCCATGAAGCGGGAGGCGGTAGTAATTCCGGAGCACCTGCCGCGGGGAG AGGGTCCCCGGCCTTTCCCCCCCTCCGCCCCCCCCCTCTTTTGTACCCCCGATTCGTCAC Mất khối lượng làm khô Không 6% Thử theo ĐVN IV, ph l c 9.6, phư ng pháp (d) sử d ng tủ sấy Sấy 1,0 g mẫu nguyên liệu áp suất ≤ mm Hg, nhiệt đ 110 C Hàm lượng bào tử 6.1 Nguyên t c Nguyên liệu bào tử Bacillus marisflavi xử l đảm bảo đ khiết Các bào tử có khả n ng ch u nhiệt đ cao thay đổi đ t ng t áp suất thẩm thấu Trư c tiến hành xác đ nh mật đ bào tử, mẫu thử cần xử l nhiệt để tiêu diệt tế bào sinh dưõng Thử theo ĐVN IV chuyên luận iosubtyl 6.2 Môi trường Môi trường th ch TS 6.3 Cách thử nghiệm Chuẩn b mẫu PL-58 Cân 10 g b t nguyên liệu cho vào bình tam giác chứa sẵn 90 ml NaCl 0,85% vô khuẩn, l c v i bi thủy tinh (ta có đ pha 10 -1) Đặt hỗn d ch bể ổn nhiệt 65oC 30 ph t Pha loãng bậc 10 NaCl 0,85% để có đ pha loãng 10-2 đến 10-9 Lấy xác 0,2 ml dung d ch có n ng đ từ 10 -6 đến 10-9 cho vào đĩa th ch chuẩn b trư c, n ng đ đĩa, trải ủ 37oC 24 Sau 24 giờ, đếm số khuẩn l c chủng vi khuẩn m c đĩa th ch (từ đ pha loãng cao đến đ pha loãng thấp nhất) Tính giá tr trung bình X đ pha Tí h độ số g Đ sống = X x Số lần pha loãng x Tiêu chu chấp thuậ : Nguyên liệu đ t yêu cầu hàm lượng bào tử 1,0 g nguyên liệu có ≥ 1010 bào tử vi khuẩn Bacillus marisflavi DD1.1 Gi i h n nhiễm khuẩn Thử gi i h n nhiễm khuẩn theo ĐVN IV, ph l c 13.6 7.1 Lấy mẫu Sử d ng 10 g nguyên liệu 7.2.Cách thử nghiệm M t mẫu chế phẩm cần xác đ nh gi i h n vi khuẩn phải thực đầy đủ thử nghiệm sau: Thử nghiệm tìm vi khuẩn gây bệnh sau: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella, Escherichia coli; c lượng số Enterobacteria đếm tổng số nấm men nấm mốc quy g nguyên liệu Nguyên liệu phải đ t yêu cầu nêu Tính an toàn Thử theo ĐVN IV, chuyên luận iosubtyl Cân xác 5,0 g b t nguyên liệu, thêm dung d ch NaCl 0,85% vừa đủ 10 ml, l c đến phân tán hoàn toàn Ch n mười chu t nh t tr ng Swiss tr ng lượng 20 g ± g (5 mẫu chứng mẫu thử), đánh dấu ghi tr ng lượng P o ùng b m tiêm kim cong chuyên d ng đưa hỗn d ch bào tử vào d dày chu t v i liều 0,5 g/ ml/con Chu t chứng cho uống dung d ch NaCl 0,85% vô khuẩn v i liều ml/con Theo dõi cân tr ng lượng chu t hàng ngày ngày PL-59 Tiêu chu chấp hậ : Nguyên liệu đ t yêu cầu chu t t ng cân bình thường triệu chứng bất thường ảng tóm t t tiêu chuẩn nguyên liệu Thử nghiệm Tiêu chuẩn Hình thức t màu vàng nh t, dễ phân tán TCCS nư c Đ nh tính vi sinh vật Phải chứa bào tử Bacillus marisflavi TCCS DD1.1 Đ nh tính carotenoid Có carotenoid TCCS Đ nh danh vi sinh vật Là Bacillus marisflavi DD1.1 TCCS Mất khối lượng làm khô Không 6% ĐVN Công hiệu Phải chứa 1010 bào tử/ g nguyên liệu ĐVN Gi i h n nhiễm khuẩn Mẫu nguyên liệu Salmonella, Esherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus Mật đ nấm men nấm mốc < 100 CFU/g Mật đ Enterobacteria [...]... khảo sát đặc điểm probiotic 2 Khảo sát khả n ng sinh carotenoid từ các chủng vi khuẩn phân lập được 3 Khảo sát môi trường thay thế và điều kiện nuôi cấy để xây dựng quy trình lên men 4 Xây dựng quy trình lên men ở quy mô pilot để sản xuất sinh khối Bacillus làm nguyên liệu probiotic cung cấp carotenoid 5 Xây dựng tiêu chuẩn c sở của nguyên liệu 6 Nghiên cứu khả n ng ứng d ng sinh khối thu được 3 Chư... khai o đó đề tài Nghiên cứu xây dựng quy trình pilot sản xuất sinh khối Bacillus spp làm nguyên liệu probiotic cung cấp carotenoid , là m t hư ng tiếp cận m i, không những có nghĩa khoa h c mà còn có nghĩa thực tiễn, làm c sở để đưa ra những chế phẩm sử d ng vi khuẩn Bacillus làm ngu n cung cấp carotenoid Đề tài được triển khai v i các m c tiêu sau: 1 Phân lập vi khuẩn Bacillus sinh carotenoid và khảo... cũng có m t số nghiên cứu về việc thu nhận carotenoid từ vi sinh vật như nghiên cứu về quá trình sinh tổng hợp βcaroten từ nấm sợi Blakeslea trispora ứng d ng làm chất màu thực phẩm; nghiên cứu về quá trình t o sinh khối Rhodotorula giàu protein và carotenoid [1], [111] N m 2008, nhóm nghiên cứu của Trần Cát Đông đã tham gia vào dự án Colorspore sàng l c các chủng vi khuẩn có khả n ng sinh carotenoid từ... sàng l c được m t số chủng vi khuẩn Bacillus có khả n ng sinh carotenoid như: Bacillus indicus, Bacillus firmus, Bacillus alcalophilus, Bacillus catenulatus, Bacllus aquimaris,… có khả n ng t o bào tử ứng d ng làm thực phẩm chức n ng, mở ra nhiều triển v ng cho việc nghiên cứu vi khuẩn 2 Bacillus để cung cấp carotenoid Tuy nhiên, các nghiên cứu này mặc dù đã thu được m t số kết quả có giá tr và nghĩa,... của carotenoid [64],[79],[91] Bhosale (2004), cách đ n giản và hiệu quả để t ng hàm lượng carotenoid tích t trong tế bào vi sinh vật là nghiên cứu về môi trường nuôi cấy và các yếu tố kích thích cho việc sản xuất carotenoid Nghiên cứu cho thấy các yếu tố có ảnh hưởng đến việc sinh tổng hợp 20 carotenoid là ánh sáng, nhiệt đ , hóa chất, các ion và muối của kim lo i, các sản phẩm trung gian của chu trình. .. vi sinh v t sinh carotenoid Các ngu n cung cấp carotenoid hiện nay chủ yếu từ thực vật như gấc, cà chua, cà rốt, đu đủ… Gần đây vi sinh vật sinh carotenoid được quan tâm vì những ưu điểm như t o được nhiều lo i carotenoid và r t ng n được thời gian thu nhận so v i thực vật (vì vi sinh vật có thời gian phát triển nhanh h n); và không ph thu c vào điều kiện đất đai, thời tiết như thực vật Vi sinh vật sinh. .. nhóm chứa nhiều lo i carotenoid như lycopen, leporoten và dẫn xuất hydroxy, -caroten, 4-keto--caroten, có ở Actinomycetes spp. , Micrococci spp. , Corynebacteria spp. ,… trong đó loài Mycobacteria spp có khả n ng ứng d ng sản xuất carotenoid trong công nghiệp - Nh m vi khuẩn Gram dư ng c hàm lượng GC thấp bao g m Bacillus spp. , Staphylococcus spp. , Enterobacter faecium chứa β-caroten, carotenoid C50,…trong... nhiều nghiên cứu sâu và toàn diện về vi khuẩn Bacillus sinh carotenoid để cung cấp carotenoid, riêng t i Việt Nam, từ n m 2008 trở l i đây, nhóm nghiên cứu của Trần Cát Đông đã tham gia vào dự án Colorspore sàng l c các chủng vi khuẩn có khả n ng sinh carotenoid từ vùng biển và h ở Việt Nam, từ đó đến nay đã có khoảng 7 công bố dư i d ng bài báo khoa h c, dự án đã sàng l c được m t số chủng vi khuẩn Bacillus. .. và phổ UV-Vis 31 S đ 2.2 Thu d ch chiết từ sinh khối vi khuẩn 31 S đ 2.3 Quy trình chiết carotenoid từ gan chu t 45 S đ 3.1 Quy trình nuôi cấy thu bào tử T14 trên môi trường r n 87 S đ 3.2 Quy trình nuôi cấy thu bào tử 1.1 trên môi trường r n 89 S đ 3.3 Quy trình nuôi cấy thu bào tử T14 trong môi trường lỏng 91 S đ 3.4 Quy trình nuôi cấy thu bào tử 1.1 trong môi trường... khuẩn sinh carotenoid làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức n ng có nhiều ưu điểm như dễ nuôi cấy ở qui mô l n, t ng trưởng nhanh, sử d ng c chất rẻ tiền, ngoài ra còn có những giá tr c ng thêm như có thể bổ sung thêm các men trợ tiêu hóa, ổn đ nh trong bảo quản Trong số các vi khuẩn sinh carotenoid, Bacillus có nhiều ưu điểm vì ch ng có khả n ng t o bào tử bền v i nhiệt nên dễ bảo quản và sản xuất [25],[96] ... dng quy trỡnh lờn men Xõy dng quy trỡnh lờn men quy mụ pilot sn xut sinh Bacillus lm nguyờn liu probiotic cung cp carotenoid Xõy dng tiờu chun c s ca nguyờn liu Nghiờn cu kh n ng ng d ng sinh. .. khun Bacillus 1.2 Carotenoid 1.3 Cỏc vi sinh vt sinh carotenoid 1.4 Nghiờn cu v vi khun sinh carotenoid trờn th gi i v t i Vit Nam 1.5 Thc phm chc n ng 1.6 Probiotic 1.7 Thc phm chc n ng v probiotic. .. 1.3 Cỏc vi sinh v t sinh carotenoid Cỏc ngu n cung cp carotenoid hin ch yu t thc vt nh gc, c chua, c rt, u Gn õy vi sinh vt sinh carotenoid c quan tõm vỡ nhng u im nh t o c nhiu lo i carotenoid