Đang tải... (xem toàn văn)
Sản xuất protein g CSF
SẢN XUẤT PROTEIN G-CSF Granulocyte-colony stimulating factor Nhóm Nội dung I Giới thiệu GCSF đặc điểm II III IV Tạo dòng vi sinh vật biểu GCSF tái tổ hợp Quy trình lên men Tinh chế I/ Giới thiệu G-CSF đặc điểm 1/ Giới thiệu G-CSF(Granulocyte-Colony Stimulating Factor) chức kích thích nguyên bào tủy tái sinh, phát triển biệt hóa tạo bạch cầu hạt trung tính Bối cảnh: Hóa trị (điều trị ung Bạch cầu giảm (Bệnh thư) Neutropania) Cần nghiên cứu! Nhu cầu sản xuất quy mô CN Ngưng hóa trị Cần sử dụng GCSF I/ Giới thiệu G-CSF đặc điểm G-CSF giúp tế bào gốc máu biệt hóa thành tế bào bạch cầu hạt trung tính I/ Giới thiệu G-CSF đặc điểm Đặc điểm gen Thuộc locut q21-22 NST 17 Gồm exon intron Kích thước: 2.5 Kb Gen Mã hóa cho hai mRNA khác mRNA Chiếm ưu có hoạt tính mạnh Protein G-CSF 174 acid amin G-CSF 177 acid amin I/ Giới thiệu G-CSF đặc điểm Đặc điểm protein a Cấu trúc chuỗi polipeptide G-CSF 177 acid amin có thêm Glu, Ser, Val G-CSF 174 acid amin - Tồn dạng glycoprotein - Trọng lượng 18,7 kDa I/ Giới thiệu G-CSF đặc điểm Đặc điểm protein cysteine tự vị trí Cys17 a Cấu trúc chuổi polipeptide 17 36 Cys36 - Cys42 42 64 Hai cầu nối disulfide Cys64 - Cys74 74 Vị trí O-glycosyl hóa Thr 133 133 I/ Giới thiệu G-CSF đặc điểm b Cấu trúc không gian ba chiều Cấu trúc protein G-CSF A Mô hình cấu trúc phẳng B Cấu trúc không gian - xoắn α đối song xoắn trái - Một xoắn phụ nhỏ nằm vùng vòng nối xoắn A xoắn B I/ Giới thiệu G-CSF đặc điểm 10 11 17 35 46 172 173 174 II/ Nghiên cứu tạo dòng vi sinh vật biểu G-CSF tái tổ hợp III QUY TRÌNH LÊN MEN Quy mô III QUY TRÌNH LÊN MEN Tiến hành đo so sánh dạng biểu hiện: Các dạng biểu Thể vùi Tan TB chất Tiết chu chất Tiết ngoại bào Thể tích lên men 1L 1L 1L 1L Thời gian lên men 24g 24g 24g 96g 50,1 33,1 11,0 31,8 Lượng G-CSF (g/L) 1,831 0,289 0,158 0,109 Hiệu thu nhận G-CSF (%) 19,86 8,17 2,5 0,16 Mật độ tế bào Sinh khối thô (g/L) %G-CSF/protein tổng Tổng lượng protein thu pha chưa GCSF lít dịch lên men (g) Kết quả: xác định dạng biểu G-CSF thể vùi tế bào chất) tối ưu III QUY TRÌNH LÊN MEN Phương pháp thu phá vỡ tế bào, thu nhận chu chất a Phương pháp thu tế bào Hai phương thức thu sinh khối E.coli dùng rộng rãi: ly tâm lọc tiếp tuyến lọc tiếp tuyến giảm thể tích giai đoạn ban đầu ly tâm thu nhận sinh khối giai đoạn sau III QUY TRÌNH LÊN MEN Phương thức thu sinh khối phương pháp lọc tiếp tuyến (bên phải) III QUY TRÌNH LÊN MEN b Phá vỡ tế bào thu nhận chu chất Các phương pháp phá màng: máy phá tế bào, sử dụng dung môi, sử dụng loại enzyme … Nhược điểm: giá thành cao, áp dụng cho mẫu nhỏ! Phương pháp tối ưu: công nghệ bơm dịch treo tế bào áp lực qua khe nhỏ Thu nhận chu chất: sử dụng sốc thẩm thấu III QUY TRÌNH LÊN MEN Thu nhận G-CSF chu chất sốc thẩm thấu • Tế bào bị phá vỡ lớp màng (outer membrane) • Màng (plasma membrane) không bị vỡ protein chu chất (periplasmic space) giải phóng Chu chất vi khuẩn gram âm (hình dưới) IV TINH CHẾ Tinh chế trung gian Từ Thể Vùi Không tan nội bào, gấp cuộn không xác • • Phương pháp: Ly tâm thu tủa rửa tủa Cần trình tái gấp cuộn pha loãng thẩm tích dd tái gấp cuộn Nguyên lý chung trính tái gấp cuộn: • • Dd protein pha loãng lượng lớn dd tái gấp cuộn Dd tái gấp cuộn oxi hóa- khử thích hợp cho việc tái gấp cuộn protein Vấn đề: kết cụm protein (do tương tác kị nước liên phân tử dạng tái gấp cuộn trung gian) Giải pháp: ngăn ngừa liên kết kị nước cách pha thật loãng dung dịch hòa tan protein dung dịch tái gấp cuộn IV TINH CHẾ Phương pháp thẩm tích dùng trính tái gấp cuộn IV TINH CHẾ Từ TB Chất Từ Chu Chất Từ Môi Trường Tan, gấp cuộn xác • Phương pháp: phá vỡ TB màng ngoài, ly tâm thu dịch Tan ngoại bào, gấp cuộn xác • Phương pháp: ly tâm loại bỏ sinh khối IV TINH CHẾ Tinh chế hoàn tất Quy Mô PTN • Trường hợp có thẻ His: dùng sắc kí lực • Trường hợp thẻ His: His Cys đưa bề mặt, đó, His số 52 156 nằm kế dùng sắc kí lực Quy Mô Công Nghiệp • Dùng sắc kí trao đổi cation Lý do: sau trình tái gấp cuộn, pH dd 4.0 < pI GCSF (5.5 - 6.1) GCSF tích điện dương Tóm Tắt Quy Trình Tối ưu hóa gen Tóm Tắt Quy Trình Biểu gen Tóm Tắt Quy Trình Tinh chế kiểm tra hoạt tính Tài liệu tham khảo • Báo cáo tổng hợp kết khoa công nghệ đề tài nghiên cứu công nghệ sản xuất Granulocyte-Colony Stimulating Factor (G-CSF) người tái tổ hợp để hỗ trợ điều trị bệnh giảm bạch cầu hạt- Trường ĐH Khoa học Tự Nhiên, ĐH Quốc Gia Tp HCM, TS Võ Minh Trí, 2010 • Tạo dòng biểu protein G-CSF người hệ thống biểu khác E.coli- Liên Thúy Linh, 2008 • Tạo dòng biểu protein G-CSF người hệ thống biểu Pichia patoris- Trương Lê Na, 2008 • Nghiên cứu thu nhận G-CSF tái tổ hợp có hoạt tính từ thể vùi biểu E.coli- Trần Thanh Hòa, 2010 • Nghiên cứu biểu thu nhận hG-CSF có hoạt tính từ thể vùi không điển hình E.coli- Nguyễn Thị Phương Hiếu, 2010 Thank You ! [...]... gian lên men 2 4g 2 4g 2 4g 9 6g 50,1 33,1 11,0 31,8 Lượng G- CSF (g/ L) 1,831 0,289 0,158 0,109 Hiệu quả thu nhận G- CSF (%) 19,86 8,17 2,5 0,16 Mật độ tế bào Sinh khối thô (g/ L) %G- CSF /protein tổng Tổng lượng protein thu được trong các pha chưa GCSF của 1 lít dịch lên men (g) Kết quả: xác định được dạng biểu hiện G- CSF ở thể vùi trong tế bào chất) là tối ưu nhất III QUY TRÌNH LÊN MEN 2 Phương pháp thu và... tái g p cuộn protein Vấn đề: sự kết cụm protein (do tương tác kị nước liên phân tử của các dạng tái g p cuộn trung gian) Giải pháp: ngăn ngừa các liên kết kị nước bằng cách pha thật loãng dung dịch hòa tan protein trong dung dịch tái g p cuộn IV TINH CHẾ Phương pháp thẩm tích dùng trong quá trính tái g p cuộn IV TINH CHẾ Từ TB Chất Từ Chu Chất Từ Môi Trường Tan, đã g p cuộn chính xác • Phương pháp:... space) được giải phóng Chu chất của vi khuẩn gram âm (hình dưới) IV TINH CHẾ 1 Tinh chế trung gian Từ Thể Vùi Không tan trong nội bào, g p cuộn không chính xác • • Phương pháp: Ly tâm thu tủa rửa tủa Cần quá trình tái g p cuộn pha loãng và thẩm tích trong dd tái g p cuộn Nguyên lý chung của quá trính tái g p cuộn: • • Dd protein được pha loãng trong lượng lớn dd tái g p cuộn Dd tái g p cuộn có... quá trình tái g p cuộn, pH của dd bằng 4.0 < pI của GCSF (5.5 - 6.1) GCSF tích điện dương Tóm Tắt Quy Trình Tối ưu hóa gen Tóm Tắt Quy Trình Biểu hiện gen Tóm Tắt Quy Trình Tinh chế và kiểm tra hoạt tính Tài liệu tham khảo • Báo cáo tổng hợp kết quả khoa công nghệ đề tài nghiên cứu công nghệ sản xuất Granulocyte-Colony Stimulating Factor (G- CSF) người tái tổ hợp để hỗ trợ điều trị bệnh giảm bạch cầu... bạch cầu hạt- Trường ĐH Khoa học Tự Nhiên, ĐH Quốc Gia Tp HCM, TS Võ Minh Trí, 2010 • Tạo dòng và biểu hiện protein G- CSF ở người bằng các hệ thống biểu hiện khác E.coli- Liên Thúy Linh, 2008 • Tạo dòng và biểu hiện protein G- CSF ở người trong các hệ thống biểu hiện ở Pichia patoris- Trương Lê Na, 2008 • Nghiên cứu thu nhận G- CSF tái tổ hợp có hoạt tính từ thể vùi được biểu hiện trong E.coli- Trần Thanh... tích, thay đổi vài codon dựa theo tần số sử dụng codon ở tế bào chủ biểu hiện: • • o g- csfmE : tế bào chủ biểu hiện gene là E coli g- csfmY : tế bào chủ biểu hiện gene là P pastoris Đánh giá độ tương đồng của protein G- CSF được dịch mã so với protein ban đầu 2/ Tối ưu hóa và dung hợp gen với các phần phụ 2.2/ Dung hợp gen với các phần phụ Các gen sẽ được dung hợp thêm với các thành phần đề phù hợp với... Hệ thống tế bào chủ Hệ thống TB chủ nào phù hợp? Tiêu chí trong sản xuất G- CSF tái tổ hợp Hiệu quả kinh tế E coli P pastoris x x _ Tốc độ tăng trưởng tb chủ cao x x _ Dễ kiểm soát quy trình uôi cấy x x _ Lượng G- CSF được tạo ra lớn x Không đạt Không đạt x x (*) x Quy trình tạo dòng tb chủ đơn giản x x Độ ổn định của gene mục tiêu trong tb x x (*) Mức độ biểu hiện Cao Thấp - Cao Quy trình sản xuất: ... Biến đổi G- CSF sau dịch mã _ O-glycosyl hóa _ Cầu nối disulfide 1/ Hệ thống tế bào chủ Tại sao không chọn các chủng chủ khác như động vật hữu nhũ hoặc tế bào côn trùng? Kinh tế • Năng suất thấp hơn • Nuôi cấy tốn kém Kỹ thuật • Tế bào chuyển gen không ổn đinh • Glycolsyl hóa không ảnh hưởng tới hoạt tính GCSF không cần sử dụng tế bào ĐV • Quá trình nuôi cấy và chuyển gene phức tạp • Thời gian nuôi... cấy lâu 1/ Hệ thống tế bào chủ Các chiến lược biểu hiện Dạng tiết ra chu chất E coli Dạng tan trong tế bào chất Dạng thể vùi trong tế bào chất P pastoris Dạng tiết ra ngoại bào 2/ Tối ưu hóa và dung hợp gen với các phần phụ 2.1/ Tối ưu hóa gen mục tiêu Trình tự gen G- CSF người được lấy từ ngân hàng gen trên NCBI -> cần tối ưu hóa để có thể biểu hiện trên E coli và P pastoris o Dùng phần mềm tin sinh... Tối ưu hóa và dung hợp gen với các phần phụ a Thể vùi: Do E coli không có chaperon g p cuộn protein không tantạo thể vùi Việc loại bỏ thẻ HIS ảnh hưởng tới hiệu suất thu nhận protein Tiến hành nghiên cứu theo hai hướng: Có thẻ HIS Không có thẻ HIS b Tan trong tế bào chất: 2/ Tối ưu hóa và dung hợp gen với các phần phụ c Tiết ra chu chất: Chức Chức năng năng của của SP SP • • Giúp protein được nhận ... quy mô CN Ngưng hóa trị Cần sử dụng GCSF I/ Giới thiệu G- CSF đặc điểm G- CSF giúp tế bào g c máu biệt hóa thành tế bào bạch cầu hạt trung tính I/ Giới thiệu G- CSF đặc điểm Đặc điểm gen Thuộc locut... thu nhận G- CSF (%) 19,86 8,17 2,5 0,16 Mật độ tế bào Sinh khối thô (g/ L) %G- CSF /protein tổng Tổng lượng protein thu pha chưa GCSF lít dịch lên men (g) Kết quả: xác định dạng biểu G- CSF thể vùi... dòng biểu protein G- CSF người hệ thống biểu khác E.coli- Liên Thúy Linh, 2008 • Tạo dòng biểu protein G- CSF người hệ thống biểu Pichia patoris- Trương Lê Na, 2008 • Nghiên cứu thu nhận G- CSF