Sắc kí cột phương pháp dùng để tách chất (cấu tử) khỏi hỗn hợp dựa vào tính phân cực chất Dụng cụ: cột sắc kí (giống giống buret, gồm ống thủy tinh khóa, không cần vạch chia độ, bạn không cần khóa nữa, kích thước cột có lớn, có nhỏ, từ bự tổ chảng cột đình đến bé tí tẹo ống tiêm) chất nhồi cột (pha tĩnh, stationary phase, thường dùng silicagel, có loại silicagel pha thuận silicagel pha đảo, silicagel pha thuận thường dùng hơn, gồm Si có đính nhóm OH, silicagel pha đảo gồm Si có đính dây alkan R, dùng alumin) Chất nhồi cột định trình sắc kí bạn Nếu dùng pha thuận, silicagel có gắn nhóm OH giữ chặt chất phân cực bạn hơn, chất không phân cực liên kết với silicagel yếu nên trước, chất phân cực sau Ngoài tùy thuộc vào lượng mẫu bạn có mà bạn dùng lượng silicagel bao nhiêu, từ bạn chọn kích cỡ cột sắc kí bạn Một yếu tố định đến lượng silicagel mỏng bạn, tùy thuộc chất bạn tách gần hay xa mà bạn dùng lượng silicagel gấp 20, 30 hay 50 lần lượng mẫu Chú ý lượng silicagel phải đổ đến khoảng gấp 10 lần đường kính cột trình tách diễn tốt Nếu mỏng lượng chất bạn gần lượng silicagel dùng phải gấp 50 lần lượng mẫu, xa cần gấp 20 lần đủ Dung môi: thông thường bạn chọn dung môi phụ thuộc vào chất nhồi cột Nếu dùng silicagel pha thường (phân cực) chọn dung môi từ không phân cực đến phân cực (ví dụ từ chloroform đếm methanol), thông thường dùng hỗn hợp dung môi, cách chọn dung môi bạn định dựa vào thông tin mỏng Chú ý dung môi chạy sắc kí cột phải phân cực chút so với dung môi chạy mỏng hạt silicagel dùng cho cột sắc kí to hạt mỏng nên khả tách chút (sắc kí cột phương pháp để tách chất sau có tất thông tin mỏng, TLC, thin layer chromatography, biện pháp dùng để "mò mẫm" thông tin hỗn hợp biện pháp tách chất cần lấy) Sau có tất thông tin bạn tiến hành chạy cột Thực Bước nhồi cột Sau chọn cột, làm khô cân silicagel cần dùng, pha dung môi chạy hệ hòa tan silicagel vào dung môi erlen chẳng hạn Lấy miếng nhỏ gòn nhồi đáy cột để chặn silicagel lại, cột dài dùng dây kẽm gòn xuống, ý dùng gòn Với cột có sẵn miếng xốp hay lọc thủy tinh để chặn silicagel không cần làm việc này, nhiên miếng xốp có nhược điểm sau chạy cột xong ta phải rửa lại nhiều lần cho sạch, thời gian so với việc nhồi gòn, chạy cột xong cần vứt gòn xong Sau nhồi chặt gòn tiến hành khuấy silicagel dung môi (không phân cực) pha sẵn rót nhẹ nhàng vào cột Trong lúc rót nên mở khóa để silicagel lắng đều, nhớ để erlen bên để thu hồi dung môi, tiếp tục làm đến cho hết lượng silicagel vào, tiến hành rót thêm dung môi (từ erlen bên dưới) để ổn định hệ, chế chế lại nhiều lần đến hệ ổn định, cột không bị nứt hay gãy xem việc nhồi cột hoàn thành Khóa cột lại Bước 2: nạp mẫu chất vào Có loại nạp mẫu nạp mẫu khô nạp mẫu ướt Nạp mẫu ướt hỗn hợp bạn tan dung môi chạy cột nên cần cho mẫu vào Còn mẫu bạn không tan dung môi chạy cột bạn phải hòa tan mẫu vào dung môi gián tiếp erlen chẳng hạn Sau dùng lượng silicagel cho vào erlen để hấp thu mẫu, sau cho hết vào bình cô quay để cô quay đuổi dung môi thu silicagel khô có chứa mẫu Lúc nạp hết silicagel vào cột cho dung môi chạy cột vào Cái gọi nạp mẫu khô Khi cô quay nhớ lót miếng gòn miệng bình cô quay để tránh silicagel bay lên Cô quay gọi nôm na chưng cất áp suất (chân không) Bước 3: sau hoàn tất việc nạp mẫu lót miếng gòn bên mẫu chất để ổn định hệ tiếp tục châm dung môi vào, từ từ thay đổi độ phân cực hệ, ý không thay đổi đột ngột chuyển từ không phân cực sang phân cực lại quay lại không phân cực, làm gãy cột phải nhồi lại từ đầu, hết chất Bước 4: mở khóa, lúc cột bắt đầu tách chất, hứng lượng dung môi chảy có theo chất tách hũ bi, lần hứng khoảng 1/5 hũ (mỗi hủ bi chứa khoảng 50-200mL tùy kích thước lớn nhỏ) Sau đem chấm hủ bi, hủ có vệt tương tự gom lại, chất Tiếp tục cuối ta tách chất mong muốn Ghi Mỗi lần tách cần khoảng 50-200 hủ bi, thời gian tách từ đến ngày Dùng khóa để điều chỉnh tốc độ dòng chảy dung môi, chậm hay nhanh, việc định trình tách bạn có tốt hay không Nếu thận trọng cho chạy chậm bạn phải chờ lâu, nôn nóng cho chảy nhanh silicagel bạn chưa kịp tách phải cho chất, không tách Có hệ phải tách lâu, cho dù mở khóa hết cỡ không chảy xuống nhanh bạn dùng máy đẩy (máy sục oxi dùng để nuôi cá) Nó sục không khí vào để tăng tốc trình đẩy dung môi xuống (chỉ dùng tốc độ dòng khoảng giọt/phút) Chú ý chất bạn không dễ bị oxi hóa dùng phương pháp Nếu không oxi không khí oxi hóa hết chất bạn Nếu dùng silicagel pha đảo cột không cần khóa pha đảo chạy chậm, nhược điểm bạn phải ngồi canh liên tục, tức tách ngày bạn phải thức trắng đêm để canh cột! CHú ý chạy pha đảo không dùng máy đẩy, chất pha đảo chậm (giống chạy ngược chiều sợ công an thổi phải chạy chậm, sợ bị tông nữa) Nếu dùng máy đẩy nói trên, silicagel không tách được, trình tách bạn hoài công Khi chạy cột điều tối kị khóa cột lại lâu Dĩ nhiên chạy cột 2-3 ngày bạn phải khóa cột lại cuối ngày để về, hôm sau phải lên làm ngay, để lâu chất bị giữ lại cột lâu khó tách Kiến thức hạn hẹp, nói khó hiểu hy vọng đóng góp chút Thân! Shadow 09-22-2008, 09:23 AM Hi ! Cám ơn tie.pok nhiều, làm 3, đề tài chưa trích cao :24h_104: bạn không hiểu câu hỏi ! Khi có mẫu cao tay, biết chất không phân cực phân cực ? ( phân đoạn cô lập biết chất ! ) Còn vấn đề thang chia độ phân cực, thực biết lớn hơn, nhỏ thôi, ví dụ nhóm flavone gọi phân cực nhóm triterpen, flavon phân cực hay không phân cực, hay gọi phân cực trung bình ? Không có thang chia rõ ràng :24h_093: Còn trình trích cao, quy trình bạn đưa chi tiết bạn có làm chưa hay nghe nói :hutthuoc( có số điểm lạ ! Mỗi lần ngâm cao không ngâm 10,20 g ! làm chừng xong :24h_125: không sắc ký lớp mỏng cao MeOH hết -> cao MeOH có nhiều chất -> 100% thấy tách !!! Vì tách nên người ta từ cao MeOH chia thành nhiều phân đoạn có độ phân cực khác nhau, cách trích lỏng-lỏng với loại dung môi có độ phân cực khác nhau, hay dùng cách trích rắn lỏng bạn nói ( cách có nghe nói chưa thấy ) -> sau thực sắc ký lớp mỏng với phân đoạn thu -> thường hay lựa loại cao tách đẹp, dễ để làm trước ( lựa chọn vậy, phải thử hoạt tính phân đoạn lựa chọn loại cao có hoạt tính cao khảo sát ) 3- Cơ chế tách cột HPLC sắc ký cột thông thường giống nhau, bạn thấy khác bạn chưa chạy sắc ký cột pha đảo C18 HPLC tách tốt hạt nhồi cột nhỏ hạt nhồi sắc ký cột nhiều ( bạn dùng loại hạt nhỏ nhồi sắc ký cột dung môi chảy qua ! Điển hình cho trường hợp sắc ký lớp mỏng thường tách tốt sắc ký cột, tách tốt :24h_125: -> đơn giản hạt sắc ký lớp mỏng nhỏ hạt sắc ký cột Mình biết có :018: có đóng góp nha :24h_057: tie.pok 09-23-2008, 09:20 PM Hello shadow Cảm ơn bạn trao đổi Mình có số ý kiến này: Các flavonoid biết chúng thuộc lớp chất phân cực (bản chất chuyển dịch điện tử vòng thơm nhóm C=O có đóng góp cho phân cực flavonoid) Cũng phân cực nên gần làng khảo sát flavonoid HCTN (các chất phân cực tiền bối khảo sát hết cho biết chúng chẳng có hoạt tính j hay ho), mà làm loại này, người ta hay vứt phần chiết ban đầu từ nHexan Theo kinh nghiệm flavonoids thường xuất phần chiết Etyl acetat Metanol Làm thao tác chiết lỏng lỏng chất ý nghĩa mục đích để cô lập lớp chất không phân cực, phân cực trung bình phân cực Trong viết mình, ngâm 10 - 20g mẫu MeOH bước khảo sát ban đầu (để chấm mỏng tìm hệ dung môi, sơ đánh giá tương quan hàm lượng chất mẫu, để đưa thử hoạt tính kháng nấm kháng khuẩn mẫu tổng) Chứ ngâm để làm hầm bà lằng bước sau đưa llên cột Muốn làm để đưa lên cột, fải có 200g đến nhiều g mẫu khô Mà bạn nói, có nhiều chất mẫu chiết MeOH nên người ta phải thử với SKBM với chục hệ dm khác Khi SKBM dùng hệ dm không phân cực chất không phân cực chạy lên chất phân cực nằm nguyên vết gốc, sau SKBM với hệ dm phân cực tăng dần mỏng thể chất không phân cực phân cực vừa nằm hết tiền tuyến dm chất phân cực tách bên với Rf khác vết gốc mờ mờ ok Tất nhiên bước khảo sát ban đầu nên việc tách rõ ràng chất khỏi điều không tưởng Đúng bạn nói việc tách CỘT SK cột (trừ cột Sephadex) tách CỘT HPLC hoàn toàn giống nguyên tắc chế tách Mình biết bạn làm nhiều HPLC nên bạn hiểu Nhưng điều muốn nói chế hoạt động HPLC lại khác nhiều có điều kiện tuyệt vời áp suất, gradient nồng độ, Bạn nhắc đến loại cột C18, có phải mà thiên hạ lâu gọi cột pha đảo không? Vật liệu nhồi cột silica gel có đính với gốc Hydrocacbon no R (chuỗi 18 C) thằng R làm cho loại silica gel trở nên không phân cực Khi chạy cột C18 người ta chạy H2O, H2O:MeOH, MeOH Mà loại có hay hợp với tính tiết kiệm người Việt dùng xong rửa lần sau làm nhồi cột dùng lại Uh, có may mắn dùng hết thùng Meck thuhanoi2304 11-06-2008, 11:26 PM anh Tie.pok dùng hết thùng ah?thần tượng tớ đấy.cái tớ đú không TungPham1986 03-18-2009, 02:55 PM Thấy người bàn HCTN xin góp số ý kiến Việc chọn hệ dung môi để chạy sắc kí cột dựa vào kết sắc kí lớp mỏng Sau có cặn chiết từ dịch cồn ( Cặn n-hexan, Điclometan, Etyl Axetat, Metanol), sắc kí lớp mỏng tiến hành với hệ dung môi với độ phân cực tăng dần, thường làm với N-hexan ( ete dầu hỏa)->Điclometan->etylaxetat>metanol Các hệ dung môi khảo sát với tỉ lệ tăng dần chất phân cực Còn để chọn hệ dung môi phù hợp tùy vào kinh nghiệm người tùy vào mụch đích phân tích Trong trình SKLM có dùng thêm thuốc thử FeCl3 hay Vanidin/H2SO4 để thử định tính số chất có cặn chiết Còn việc chạy SKLM sau thu phân đoạn chủ yếu để gom phân đoạn giống lại ( đơn chất hay hỗn hợp) đơn chất kết tinh chụp phổ OK Còn hỗn hợp tiến hành sắc kí cột lần hai( thường làm công tơ hút) thu chất tinh khiết TungPham1986 03-18-2009, 02:59 PM anh Tie.pok dùng hết thùng ah?thần tượng tớ đấy.cái tớ đú không HUyền phải ko? Anh thật đại gia chơi hẳn thùng hóa chất Merck Chắc làm viện có đề tài lớn, làm nước Chứ VN hóa chất chai Tàu đại gia Dân HCTN toàn mua dung môi công nghiệp cất lại chưa thấy mua hóa chất Merck  ... tách cột HPLC sắc ký cột thông thường giống nhau, bạn thấy khác bạn chưa chạy sắc ký cột pha đảo C18 HPLC tách tốt hạt nhồi cột nhỏ hạt nhồi sắc ký cột nhiều ( bạn dùng loại hạt nhỏ nhồi sắc ký cột. .. chạy cột điều tối kị khóa cột lại lâu Dĩ nhiên chạy cột 2-3 ngày bạn phải khóa cột lại cuối ngày để về, hôm sau phải lên làm ngay, để lâu chất bị giữ lại cột lâu khó tách Kiến thức hạn hẹp, nói... bạn dùng máy đẩy (máy sục oxi dùng để nuôi cá) Nó sục không khí vào để tăng tốc trình đẩy dung môi xuống (chỉ dùng tốc độ dòng khoảng giọt/phút) Chú ý chất bạn không dễ bị oxi hóa dùng phương pháp