Chƣơng mở đầu CHƢƠNG MỞ ĐẦU Trong vài thập niên gần đây, thực phẩm chức - thực phẩm có chứa probiotic có tiến đáng kể, đặc biệt sản phẩm từ sữa Sữa có chứa nhiều chất dinh dƣỡng mà môi trƣờng thích hợp cho sống phát triển vi khuẩn probiotic Vi khuẩn probiotic, đặc biệt Bifidobacteria Lactobacilli, thƣờng có ruột ngƣời Bifidobacteria thƣờng đƣợc sử dụng sản phẩm probiotic số lý Thứ nhất, Bifidobacteria đƣợc tìm thấy ruột trẻ sơ sinh bú sữa mẹ cao, trung bình khoảng 3/4 tổng số tế bào vi khuẩn ruột, so với ruột ngƣời lớn thấp khoảng 3%, sữa mẹ kích thích tăng trƣởng Bifidobacteria Thứ hai, Bifidobacteria có khả sống đƣợc phần khác ruột giúp cho trình tiêu hóa hấp thu đƣợc dễ dàng Những loài Bifidobacteria địa có ruột phụ thuộc vào độ tuổi nhƣ Bifidobacterium infantis B.breve có trẻ em B.adolescentis chủ yếu ngƣời lớn, B.longum có lứa tuổi Những vi khuẩn có lợi đến sức khỏe ngƣời cách cải thiện cân hệ vi khuẩn đƣờng ruột cải thiện niêm mạc bảo vệ chống lại tác nhân gây bệnh Hơn nữa, vi khuẩn Bifidobacteria có tác động tốt cho ngƣời tiêu dùng nhƣ tăng cƣờng hệ miễn dịch, giảm cholesterol, tổng hợp vitamin, chống ung thƣ, chống lại vi khuẩn gây bệnh Mặc dù thị trƣờng nghiên cứu gần tập trung vào sản phẩm lên men từ sữa yoghurt có chứa Bifidobacteria, nhƣng sản phẩm chƣa phải môi trƣờng tối ƣu cho dòng vi khuẩn (đặc biệt chủng Bifidobacterium) Phô mai trì khả sống Bifidobacteria cách bổ sung vào sản phẩm kết hợp với giống lên men Phô mai có pH (khoảng 4,8-5,6) , hàm lƣợng lipid, hàm lƣợng oxy, điều kiện bảo quản thuận lợi cho tồn Bifidobacteria trình sản xuất tiêu hóa môi trƣờng ổn định cho sống Bifidobacetia Phô mai probiotic phô mai có chứa vi sinh vật sống có hai vấn đề đƣợc đặt là: Hàm lƣợng probiotic bổ sung vào phô mai bao nhiêu? Thời gian bảo quản phô mai? Đề tài nghiên cứu giải hai vấn đề Chƣơng Tổng quan tài liệu CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 PROBIOTIC 1.1.1 Lịch sử phát triển Probiotic năm gần nhận đƣợc nhiều quan tâm, nhƣng chúng đƣợc phát từ lâu Lợi ích thực phẩm chứa vi khuẩn probiotic đƣợc biết từ nhiều kỷ trƣớc Louis Pasteur ngƣời tìm thấy vi khuẩn acid lactic năm 1857 Nhà nghiên cứu Henry Tissier ý tới có mặt Bifidobacteria phân xu trẻ em vào năm 1900 Nhƣng cha đẻ ngành miễn dịch học đại, Elie Metchnikoff (1845-1916), nhà vi sinh vật ngƣời Nga đạt giải Nobel, ngƣời khám phá miêu tả xác lợi ích probiotic Metchnikoff ngƣời đề nghị sử dụng loại vi khuẩn có lợi đem lại cho sức khỏe cho ngƣời Khi ông giáo sƣ Viện Pasteur Paris, ông đƣa lý thuyết có mặt acid lactic ruột kiểm soát nhiễm trùng từ vi khuẩn sinh bệnh vi khuẩn sinh độc tố Năm 1907, ông cho sản phẩm lên men sữa từ vi khuẩn sinh acid dùng thƣờng xuyên đặn có sống lâu khỏe Sau thời kì Metchnikoff, nghiên cứu loài vi khuẩn dƣờng nhƣ không phát triển Đến năm 1953, thuật ngữ probiotic đƣợc biết đến, sau nhiều thập kỷ đặc tính có lợi cho sức khỏe loài vi khuẩn sinh acid lactic đƣợc giới thiệu nhƣ probiotic [22] Ngày nhà khoa học tiếp tục nghiên cứu phát triển probiotic 1.1.2 Khái niệm a) Probiotic Probiotic vi sinh vật sống, chủ yếu vi khuẩn lactic đƣợc sử dụng để cải thiện tình trạng sức khỏe ngƣời động vật Sử dụng chế phẩm Chƣơng Tổng quan tài liệu probiotic cải thiện tính chất hệ vi sinh vật dày, ruột, ống hô hấp có khả chống lại tác nhân gây bệnh [8] b) Prebiotic Hiện có hai hƣớng làm tăng số lƣợng vi sinh vật có lợi dày ruột bổ sung sinh vật sống có lợi (probiotic) chất bổ trợ tiêu hóa (prebiotic) để biến đổi có chọn lọc thành phần hệ vi sinh vật đƣờng ruột Prebiotic đƣợc định nghĩa nguyên liệu thực phẩm tiêu hóa, tác động có lợi vật chủ cách kích thích hoạt tính lƣợng giới hạn vi khuẩn kết tràng để cải thiện sức khỏe vật chủ Prebiotic kích thích tăng trƣởng hệ vi sinh vật thƣờng trú vật chủ Tạo điều kiện cho chủng vi khuẩn chuyên biệt với vật chủ sinh sản phát triển nhanh chóng Prebiotic giúp vi khuẩn có lợi tăng số lƣợng tăng hoạt tính chuyển hóa chất lên men Các prebiotic bao gồm disaccharide, oligosaccharide, fructose, galactooligosaccharide, soybean-oligosaccharide, inulin oligo- saccharide không tiêu hóa khác [8] c) Synbiotic Hệ vi sinh vật đƣờng ruột vật chủ đƣợc điều chỉnh cách sử dụng đồng thời probiotic prebiotic Sự kết hợp gọi “synbiotic” Sự kết hợp probiotic prebiotic mang lại nhiều tác động so với sử dụng chất riêng lẻ Khi nghiên cứu chuột bị ung thƣ kết tràng, ngƣời ta thấy cho chuột dùng bifidobacteria oligofructose bệnh chuột không giảm, nhƣng cho chuột dùng kết hợp đồng thời bifidobacteria oligofructose làm giảm đƣợc bệnh ung thƣ kết tràng 1.1.3 Các loại vi khuẩn probiotic Vi khuẩn probiotic có đặc tính sau: Không sinh bệnh độc tố Có lợi cho vật chủ Chƣơng Tổng quan tài liệu Có khả sống cao Có thể tồn ruột Dễ dàng nuôi cấy qui mô công nghiệp           Các loại probiotic LACTOBACILLI, STREPTOCOCCI, BIFIDOBACTERIA L acidophilus  S salivarius subsp thermophilus L caseL.delbrueckii subsp bulgaricus  S faecium L brevis  S diacetylactis L cellobiosus  S intermedius L curvatus  B bifidum L fermentum  B adolescentis L lactis  B animalis L plantarum  B infantis L reuteri  B.longum S cremoris  B.thermophilum 1.1.4 Vai trò probiotic sản phẩm từ sữa lên men - Sinh acid lactic hợp chất kháng khuẩn để bảo quản đƣợc sữa - Tạo hợp chất có mùi nhƣ acetyldehyde yoghourt phô mai - Nâng cao giá trị dinh dƣỡng nhƣ giải phóng acid amin tự tổng hợp vitamin - Cung cấp cho điều trị đặc biệt phòng ngừa ung thƣ điều hòa hàm lƣợng cholesterol [19] 1.1.5 Ứng dụng probiotic vào sống ngƣời a) Thuỷ phân lactose, tăng hấp thu lactose Suốt trình lên men, vi khuẩn lactic sinh enzyme lactase thủy phân lactose thành glucose galactose Các vi khuẩn probiotic đƣờng ruột giúp chuyển hoá hầu hết lƣợng lactose không đƣợc hấp thu ruột non [10] b) Làm giảm số bệnh đường tiêu hoá Chƣơng Tổng quan tài liệu Bệnh ung loét: Bệnh loét hệ thống tiêu hoá (do vi khuẩn Helicobacter pylori gây ra) có liên quan đến chế độ ăn uống hàng ngày sử dụng sản phẩm sữa lên men rau quả, sử dụng nhiều sữa, thịt, tinh bột Vi khuẩn lactic ngăn chặn phát triển vi sinh vật gây bệnh làm giảm hoạt tính enzyme urease – enzyme cần thiết cho vi sinh vật gây bệnh lƣu trú môi trƣờng acid dày Vi khuẩn lactic ngăn chặn bệnh tiêu chảy vi sinh vật, vi khuẩn lactic ngăn chặn bám chặt phát triển vi sinh vật gây bệnh đƣờng ruột nhƣ Samonella, E.coli, Shigella Ngoài vi khuẩn lactic kích thích hệ thống miễn dịch tăng lên đáp ứng miễn dịch IgA đặc hiệu chống lại nhiễm vi sinh vật gây bệnh c) Tác dụng ngăn chặn vi sinh vật gây bệnh Vi khuẩn lactic sinh acid acetic, acid lactic, acid hữu khác, làm giảm pH môi trƣờng ảnh hƣởng bất lợi số vi sinh vật nhạy cảm với tính acid Vi khuẩn lactic sinh chất kháng sinh tự nhiên (Bacteriocin) Bacteriocin peptide, polypeptide, protein chất mang cấu trúc gen protein đƣợc cấu tạo từ amino acid, bao gồm amino acid nhƣ lanthionine hay β-methyllanthionine Bacteriocin vi khuẩn lactic đƣợc chia làm nhóm sau: - Nhóm chứa lanthibiotic: peptide nhỏ có khả chịu nhiệt, chứa amino acid nhƣ lanthionine - Nhóm chia thành nhóm nhỏ nhóm 2a thƣờng gặp bao gồm bacteriocin nhƣ pediocin có khả chống Listeria - Nhóm nhóm protein không bền nhiệt - Nhóm phức hợp protein, lipid glucid Vi khuẩn lactic tranh giành nơi cƣ trú, tranh giành chất dinh dƣỡng, ngăn chặn bám chặt phát triển vi sinh vật gây bệnh Tạo cản trở không gian ảnh hƣởng đến phát triển vi sinh vật gây bệnh [10] Chƣơng Tổng quan tài liệu d) Chống dị ứng thức ăn Một phƣơng pháp phòng chống dị ứng thức ăn điều chỉnh hệ vi sinh vật đƣờng ruột, nguồn vi sinh vật kích thích hệ thống miễn dịch Qua nghiên cứu, ngƣời ta thấy ngƣời bị dị ứng số lƣợng vi khuẩn Lactobacilli nhiều Clostridia so với ngƣời thƣờng bị dị ứng e) Tổng hợp số vitamin Các vi khuẩn đƣờng ruột có khả sinh nhiều vitamin khác Việc hấp thu vitamin đƣờng ruột kém, việc vi khuẩn có khả sinh vitamin quan trọng Các vi khuẩn sinh tất loại vitamin hòa tan nƣớc –vitamin B (folic acid, niacin, riboflavin, B12, B6, acid pantothenic) vitamin K Theo nghiên cứu, L.brevis có khả tổng hợp vitamin D vitamin K; B.longum tổng hợp vitamin B; B.bifidum L.acidophillus tổng hợp đƣợc vitamin B nhƣ niacin, folic acid, biotin, B6 vitamin K [5] f) Giảm cholesterol Vi khuẩn đƣờng ruột chuyển cholesterol sang dạng khó hấp thu (coprostanol) làm cản trở việc hấp thu cholesterol hệ thống ruột Theo nhà nghiên cứu, vi khuẩn probiotic khống chế làm cho cholesterol khó hấp thu đƣợc vào máu thông qua chế chủ yếu sau: - Hấp thụ lƣợng cholesterol có mặt hệ thống ruột - Tăng chuyển hóa cholesterol thành chất khác giảm hấp thu chất vào thể - Giảm hấp thu cholesterol ruột tăng tiết phân - Giới hạn biến đổi cholesterol thành acid mật cho gan dự trữ - Các vi khuẩn bifidobacteria đồng hóa cholesterol [9] Chƣơng Tổng quan tài liệu Nếu hàm lƣợng chất béo cao bữa ăn, gây tăng cholesterol, việc bổ sung vi khuẩn có lợi phƣơng pháp giúp cân mức lipid chất béo, giữ hệ thống tim mạch mạnh khỏe g) Tăng cường hệ miễn dịch Miễn dịch trạng thái bảo vệ đặc biệt thể sống chống lại yếu tố gây bệnh (các vi sinh vật, độc tố vi sinh vật, phân tử lạ…) chúng xâm nhập vào thể: - Kháng thể globulin máu động vật, có khả liên kết đặt hiệu với kháng nguyên kích thích sinh nó, hay gọi kháng thể miễn dịch kháng thể đặc hiệu Kháng thể chủ yếu đƣợc tìm thấy huyết - IgA đƣợc tổng hợp chủ yếu nhờ tế bào B niêm mạc ruột, đƣờng hô hấp thực chức chống vi khuẩn bề mặt niêm mạc ruột Các vi khuẩn probiotic làm tăng hệ miễn dịch cách: - Tăng cƣờng chức chống virus hệ miễn dịch - Tăng hoạt động tế bào NK (natural killer) nhằm tiêu diệt trực tiếp tế bào bị nhiễm khuẩn cách tiết chất độc để phân giải chúng - Tăng S-IgA, sinh cytokine, điều khiển đáp ứng miễn dịch tế bào - Sinh nitric oxide NO, có vai trò quan trọng việc dẫn truyền thông tin hệ thần kinh đặc biệt có tác dụng làm thƣ giãn - Tăng khả đề kháng chống lại số trình tự miễn - Giảm đáp ứng trung gian IgE (IgE-mediated responses) - Gián tiếp chống lại tƣợng radiation-included depression in white blood cells: tƣợng tế bào bạch cầu bị ức chế tiêu diệt chiếu xạ Hiện tƣợng thƣờng xảy điều trị bệnh ung thƣ chiếu xạ [20] Chƣơng Tổng quan tài liệu h) Ngăn chặn ung thư Vi khuẩn probiotic kết hợp, ngăn chặn làm hoạt tính yếu tố gây ung thƣ Giảm hoạt tính enzyme phân, nơi khơi nguồn mầm móng gây ung thƣ, kích thích hệ thống miễn dịch, ngăn chặn tạo thành khối u Đa số ung thƣ ngƣời liên quan đến thói quen ăn uống Một số chủng vi khuẩn lactic (L.bulgaricus, S.thermophilus, L.acidophilus Bifidobacteria) sử dụng sản phẩm sữa lên men xem nhƣ chất chống ung thƣ chống gây đột biến Các vi khuẩn có lợi giảm enzyme liên quan đến tác nhân gây ung thƣ (ß-gulucoronidase, azoreductase, nitroreductase ß-glucosidase) làm giảm nguy gây ung thƣ ruột kết Bifidobacteria ngăn chặn yếu tố tiền ung thƣ nhƣ nitrate nitrosamines thông qua chế nội bào Chúng kết hợp với heterocyclic amines (các chất gây ung thƣ trình nấu thịt) sau đƣợc tiết theo phân [8] 1.1.6 Một số sản phẩm probiotic phổ biến giới Hình 1.1 Một số sản phẩm probiotic Các loại phô mai bổ sung probiotic Các sản phẩm từ sữa lên men nhƣ kefir, Yakult, loại sữa chua khác Dƣa chua probiotic Kem probiotic Các loại nƣớc ép trái bổ sung probiotic Chƣơng Tổng quan tài liệu 1.2 BIFIDOBACTERIA Bifidobacteria vi khuẩn Gram dƣơng, không di động, kỵ khí đƣợc phân loại nhƣ sau: Lớp: Actinobacteria Lớp phụ: Actinobacteriadae Bộ: Bifidobacteriales Họ: Bifidobacteriaceae Giống: Firmicutes [18] 1.2.1 Đặc điểm hình thái Vi khuẩn Bifidobacterium không di động, không sinh bào tử, hình que với nhiều hình dạng nhƣ dạng cong, dạng móc câu, dạng hình gậy đánh gôn, dạng phân nhánh,… thƣờng xuất dạng chữ “Y” Các tế bào vi khuẩn Bifidobacteria thƣờng đứng riêng lẻ, xếp thành cặp xếp thành hình chữ “V” Kích thƣớc tế bào vi khuẩn khoảng 0,5-1,3nm Bifidobacterium có dạng hình que chẻ đôi que phân nhiều nhánh dƣới điều kiện tăng trƣởng khác tế bào nhiều hình dạng khác (Tisser, 1990) Khi sử dụng N – Acetyl D – glucosaminde, alamine, acid aspartic, acid glutamic, Serine Ca2+ môi trƣờng nuôi cấy ảnh hƣởng đến hình dạng tế bào vi khuẩn Bifidobacteria Tế bào bifidobacteria vỏ bao hệ thống tiêm mao bao quanh Vách tế bào đƣợc cấu tạo thành phần chính: peptidoglycan, polysachharide, acid lipoteichoic Peptidoglycan vi khuẩn Bifidobacteria đƣợc cấu tạo từ acid Nacetylmuramic N- acetylglucosamine Các phân tử kết hợp với tạo thành chuỗi oligopeptide Ngoài ra, vách tế bào vi khuẩn Bifidobacteria chứa nhiều polysacchide gồm phân tử đƣờng glucose, galactose, rhamnose,…liên kết với [18] Chƣơng Tổng quan tài liệu Hình 1.2 Một số hình thái Bifidobacteria [16] 1.2.2 Đặc điểm sinh lý Bifidobacterium cƣ trú ruột thể ngƣời động vật Chúng đóng vai trò quan trọng việc kiểm soát pH đƣờng ruột, kết tràng Chúng đƣợc phát từ phân trẻ sơ sinh bú sữa mẹ Lƣợng vi khuẩn phổ biến đƣờng ruột, tính ổn định chúng liên quan đến tuổi tác, tuổi lớn lƣợng vi khuẩn giảm Lƣợng vi khuẩn bifidobacteria thể bị tác động nhiều yếu tố nhƣ thức ăn, thức uống, sử dụng kháng sinh tình trạng thể [17] 10 Chƣơng Kết bàn luận Hình 3 Khuẩn lạc B.bifidum Sau 48 quan sát khuẩn lạc B.bifidum nuôi cấy môi trƣờng MRS agar 370C khuẩn lạc nhỏ hình tròn, trơn bóng có màu trắng sữa, đầu nhô lên với bề mặt nhẵn ƣớt, đƣờng kính khoảng 1,0 – 1,5mm 3.3 Đƣờng chuẩn quan hệ mật độ quang mật độ probiotic: Vi khuẩn B.bifidum đƣợc nhân giống môi trƣờng MRS lỏng 37 0C sau 24 chuyển sang môi trƣờng nhân giống cấp 2, sau tiến hành đo OD trải đĩa để thu đƣợc bảng số liệu sau: Bảng 3.1 Đƣờng chuẩn OD mật độ probiotic Thời gian (giờ) Log (CFU/ml) 6,778 7,083 7,659 8,799 9,136 Sinh khối (CFU/ml) 6,0.106 12,1.106 45,6.106 6,3.108 137,7.108 OD 0,4767 0,567 1,277 2,6476 3,264 37 Chƣơng Kết bàn luận Hình Đồ thị đƣờng chuẩn Đƣờng chuẩn có phƣơng trình y= 0,6432x + 7,9612 (R2= 0,9576) Trong x: mật độ quang OD y: mật độ tế bào vi khuẩn CFU/ml 3.4 Đƣờng cong sinh trƣởng vi khuẩn Bifidobacteria Khảo sát vi khuẩn B.bifidum đƣợc lên men môi trƣờng MRS lỏng với tỷ lệ giống 10% , sau tiến hành đo OD khoảng thời gian khác bƣớc sóng 600nm OD bắt đầu giảm lúc giống vào thời kỳ suy vong Từ OD đo đƣợc dựa vào đƣờng chuẩn y= 0,6432x + 7,9612 để suy mật độ tế bào log (CFU/ml) Bảng 3.2 Bảng đƣờng cong sinh trƣởng B.bifidum Thời gian (giờ) 24 26 28 30 32 OD 0,477 0,567 1,277 2,647 3,597 5,661 6,369 7,392 7,141 6,517 Log (CFU/ml) 8,268 8,326 8,783 9,663 10,275 11,603 12,058 12,716 12,554 12,153 38 Chƣơng Kết bàn luận Hình Đồ thị đƣờng cong sinh trƣởng B.bifium Đƣờng cong sinh trƣởng yếu tố quan trọng khảo sát vi sinh vật, qua nhận biết khoảng thời gian vi sinh vật sinh trƣởng mạnh suy vong Từ đồ thị rằng: Vi khuẩn B.bifidum có pha lag kéo dài thời gian vi khuẩn thích nghi với môi trƣờng tƣơng đối ngắn Pha log diễn 26 sinh khối vi khuẩn đạt cực đại log 12,716 CFU/ml mật độ bắt đầu giảm thứ 30, thời gian suy vong vi khuẩn Do muốn thu sinh khối nhiều thu sau 28 sau nhân giống cấp 3.5 Khảo sát pH Hầu hết vi khuẩn lactic có pH tối ƣu cho trình sinh trƣởng phát triển pH trung tính Sự tăng giảm pH môi trƣờng nuôi cấy ảnh hƣởng đến sinh trƣởng vi sinh vật nói chung Chúng tiến hành nuôi cấy vi khuẩn erlen 250ml, chứa 100ml môi trƣờng Trƣớc hấp khử trùng môi trƣờng đƣợc chỉnh mẫu giá trị pH khác Tiến hành nuôi cấy với tỷ lệ giống 10%, nhiệt độ 370C, môi trƣờng MRS chuẩn sau 24 đo OD bƣớc sóng 600nm, đƣợc bảng kết sau: 39 Chƣơng Kết bàn luận Bảng 3 Ảnh hƣởng pH đến tốc độ tạo sinh khối vi khuẩn bifidobacteria pH 5,0 5,5 6,0 6,5 6,8 7,0 OD 4,697 5,346 5,522 5,577 5,599 5,324 Log (CFU/ml) 10,982 11,400 11,513 11,548 11,562 11,386 Hình Ảnh hƣởng pH đến mật độ tế bào vi khuẩn bifidobacteria Từ đồ thị cho thấy pH 6, pH 6,5 pH 6,8 mật độ tế bào có giá trị gần khoảng 11,5 CFU/ml khoảng pH có giá trị gần với khoảng pH tối ƣu Vi khuẩn B.bifidum có pH tối ƣu nằm khoảng từ 6,5-7,0 [11] Khi khảo sát giá trị pH từ 5,0-7,0 ta thấy vi khuẩn B.bifidum pH 5,0 có mật độ tế bào thấp 10.982 CFU/ml Mật độ tế bào nuôi cấy tăng dần theo giá trị pH nhƣng giảm pH 7,0 với mật độ tế bào 11.386 CF/ml điều kiện nuôi cấy Nhƣ chọn pH tối ƣu 6.8 có log 11,562 CFU/ml lớn Do thí nghiệm sau sử dụng pH 6,8 để khảo sát yếu tố khác 40 Chƣơng Kết bàn luận 3.6 Khảo sát nhiệt độ Chúng tiến hành nuôi cấy bifidobacteria erlen 250ml chứa thể tích môi trƣờng 100ml Môi trƣờng khảo sát pH 6,8 lƣợng giống cấy vào 10% nuôi cấy tủ ủ nhiệt độ khác môi trƣờng MRS, sau 28 tiến hành đo OD với bƣớc sóng 600nm thu đƣợc kết sau: Bảng 3.4 Ảnh hƣởng nhiệt độ lên tốc độ tạo sinh khối vi khuẩn Bifidobacteria Nhiệt độ 280C 370C 400C OD 6,345 7,74 4,845 Log (CFU/ml) 12,042 12,940 11,078 Hình Biểu đồ ảnh hƣởng nhiệt độ đến mật độ tế bào vi khuẩn Bifidobacteria Vi khuẩn lactic vi khuẩn ƣa nhiệt, theo dõi B.bifidum chế độ nhiệt độ phòng, 370C 400C sau 28 đo đƣợc log 12,94 CFU/ml cao ứng với nhiệt độ 370C nhiệt độ thể ngƣời Khi nhiệt độ lớn ba độ làm cho lƣợng tế bào giảm đáng kể log 11,07CFU/ml điều chứng tỏ nhiệt độ lớn 370C gây ức chế phát triển tế bào vi khuẩn B.bifidum vi 41 Chƣơng Kết bàn luận khuẩn tồn tốt thể ngƣời nên thích hợp để bổ sung vào phô mai để trở thành thực phẩm probiotic 3.7 Khảo sát tỷ lệ sữa phô mai Lấy 10ml dịch tế bào vi khuẩn phát triển MRS lỏng nuôi cấy điều kiện tối ƣu đem ly tâm 5000 vòng 20 phút thu lấy sinh khối loại bỏ phần dịch lỏng, sau cho nƣớc cất tiệt trùng vào ly tâm phút để loại mùi MRS Lƣợng sinh khối thu đƣợc cho vào 15g phô mai nguyên liệu nấu nóng chảy để nguội với tỷ lệ sữa khác đƣợc ủ 370C với mật độ tế bào 1011 CFU/g sản phẩm Bảng Ảnh hƣởng tỷ lệ sữa phô mai đến chất lƣợng sản phẩm Tỷ lệ sữa phô mai (g/ml) Sữa không đƣờng Sữa có đƣờng 1:3 2:3 1:1 1:3 2:3 1:1 51,53 63,07 75,23 52,36 61,24 65,43 Thời gian đông tụ (giờ) 10 10 7 Hàm lƣợng acid lactic (%) 1,161 1,235 1,125 1,1667 1,1875 1,406 5 5 5 Độ ẩm (%) pH Dựa vào bảng kết cho thấy thời gian đông tụ thu sản phẩm mẫu có đƣờng từ 5-7 ngắn so với mẫu không đƣờng, vi khuẩn chuyển đƣờng thành acid làm giảm pH gây đông tụ sữa Theo Miloud Hadadji chủng Bifidobacteria có thời gian đông tụ sữa khoảng từ 6-8 [14] Hầu hết mẫu phô mai có pH tƣơng đối giống xác định chênh lệch xác mẫu sản phẩm dạng cứng nên đo giấy đo pH Thời gian đông tụ phô mai đƣợc định đến giá trị cảm quan sản phẩm 42 Chƣơng Kết bàn luận Hình Ảnh hƣởng tỷ lệ sữa đến độ ẩm phô mai Đồ thị cho thấy đa số mẫu phô mai có bổ sung sữa không đƣờng có độ ẩm cao phô mai bổ sung sữa có đƣờng Độ ẩm mẫu chênh lệch không nhiều Ở tỷ lệ sữa phô mai 2:3 độ ẩm mẫu bổ sung sữa không đƣờng 63.07% có đƣờng 61.24% gần Độ ẩm định cấu trúc sản phẩm Trong thời gian đông tụ, hàm lƣợng chất khô phô mai bổ sung sữa không đƣờng hay có đƣờng nhƣng với tỷ lệ khác 1:1 2:3 tức lƣợng sữa đƣa vào nhiều có độ ẩm cao Theo theo kết nghiên cứu M.Gobbetti phô mai Crescenza bổ sung vi khuẩn Bifidobateria có độ ẩm từ 61.7- 63% [12] Các mẫu đƣợc khảo sát có độ ẩm lớn so với độ ẩm phô mai Crescenza nên thuộc loại phô mai mềm 43 Chƣơng Kết bàn luận Hình Ảnh hƣởng tỷ lệ sữa đến hàm lƣợng acid lactic Dựa biểu đồ cho thấy phô mai có bổ sung sữa có đƣờng có hàm lƣợng acid 1.667, 1.875, 1.306 cao so với phô mai có bổ sung sữa không đƣờng với thời gian đông tụ ngắn Ở tỷ lệ sữa phô mai 2:3 hàm lƣợng acid cao 1.235% 1.875% so với tỷ lệ khác Với lƣợng vi sinh vật cho vào tỷ lệ sữa phô mai 1:1 hai trƣờng hợp bổ sung sữa có đƣờng đƣờng sinh lƣợng acid nhỏ so với tỷ lệ khác Trong sữa có pH xấp xỉ 6,6-6,7 micelle casein mang điện tích âm, micelle mang điện tích âm nên chúng đẩy Các phân tử nƣớc liên kết với điện tích casein góp phần trì micelle trrong dung dịch Khi giảm độ pH (do trình men sinh acid lactic) ion H+ acid liên kết micelle mang điện tích âm làm giảm điện tích micelle Khi tới hạn (pH khoảng 5,1-5,3) micelle casein đông tụ Do bổ sung sữa có đƣờng hàm lƣợng chất khô nhiều sinh nhiều acid lactic làm pH giảm nhanh nên thời gian đông tụ ngắn bổ sung sữa không đƣờng Theo P.Dinakar hàm lƣợng acid lactic phô mai Cheddar 1.08% [15], thấy mẫu phô mai bổ sung sữa có đƣờng có hàm lƣợng acid gần với phô mai Cheddar 44 Chƣơng Kết bàn luận Vì vậy, mục đích kinh tế thu đƣợc nhiều sản phẩm (30g sản phẩm) với thời gian đông tụ ngắn hàm lƣợng acid lactic sinh chọn bổ sung sữa có đƣờng vào phô mai với tỷ lệ 1:1 3.8 Thăm dò cảm quan sản phẩm phô mai giàu probiotic Tổng kết khảo sát cảm quan từ 17 bạn sinh viên thu đƣợc bảng kết luận sau: Bảng Nhận xét cảm quan sản phẩm Tỷ lệ sữa phô mai (g/ml) Sữa không đƣờng 1:3 2:3 Sữa có đƣờng 1:1 1:3 2:3 1:1 Mùi phô mai sữa chua Sữa Sữa Sữa Sữa Vị Lạt, béo Chua nhẹ Chua nhẹ Lạt, béo Chua nhẹ Lạt Cấu trúc Mềm Cứng Bán cứng Mềm Cứng Bán cứng Dựa vào bảng kết thăm dò thấy đa số mẫu có mùi sữa phô mai nguyên liệu có mùi đặc trƣng mà sữa đặc biệt sữa có đƣờng có nhiều mùi vani Ở tỷ lệ 1:3 lƣợng sữa cho vào nên sản phẩm có vị béo so với tỷ lệ khác Các tỷ lệ 2:3 1:1 chất béo bị phân hủy trình lên men tạo thành acid béo no không no, acid lactic sinh nhiều tỷ lệ nên vị béo.Nhƣng để thu đƣợc sản phẩm với khối lƣợng lớn có vị đặc trƣng phô mai lạt chọn tỷ lệ sữa có đƣờng phô mai nguyên liệu 1:1 với mật độ tế bào 1011 CFU/g sản phẩm để tiến hành cho thí nghiệm bảo quản sản phẩm 3.9 Khảo sát mật độ probiotic thời bảo quản Nuôi cấy tế bào vi khuẩn môi trƣờng MRS lỏng với điều kiện tối ƣu đƣợc khảo sát trên, lấy thể tích khác đem ly tâm để thu đƣợc sinh khối với lƣợng tế bào khác (109, 1010, 1011 CFU/g), sau cho lƣợng sinh khối thu đƣợc vào với sữa có đƣờng phô mai với tỷ lệ 1:1phân phối đem ủ 370C 10 để đông tụ phô mai, sau đem sản phẩm thu đƣợc vào nhiệt độ mát khoảng 100C bảo quản Tiến hành khảo sát mật độ tế bào sau tuần, ta thu đƣợc bảng kết sau: 45 Chƣơng Kết bàn luận Bảng Mật độ probiotic theo thời gian bảo quản Mật độ probiotic (CFU/g) Thời gian (tuần) Ban đầu 3.109 9.109 2,4.1010 5,7.1010 1,66.1011 tuần tuần 7,8.108 4,51.108 3,26.109 6,0.108 5,8.109 9,2.108 6,9.109 1,6.109 1,45.1010 3,75.109 tuần 7,0.107 2,5.108 4,0.108 6,8.108 2,7.109 tuần 2,2 107 4,0.107 5,2 107 2,1 108 7,1 108 tuần 8,1 106 1,04 107 4,1 107 7,8 107 1,8 108 Hình 10 Mật độ probiotic thời gian bảo quản Trong tuần đầu, B.bifium có mật độ tế bào giảm nhiều so với tuần lại, vi khuẩn chƣa kịp thích nghi với môi trƣờng bảo quản lạnh Vào tuần lƣợng vi khuẩn có giảm nhƣng không nhiều Sản phẩm probiotic công nghiệp có mật độ probiotic ≥ 106 CFU/g sản phẩm thời điểm tiêu thụ, mật độ đem lại tác động tốt cho sức khỏe ngƣời [18] Quan sát thời gian bảo quản 10 0C ta thấy mật độ probiotic phô mai giảm xuống đến 106 CFU/g phô mai đến mức giới hạn sản phẩm bổ sung probiotic tuần thứ 46 Chƣơng Kết bàn luận Về màu sắc mùi vị sản phẩm không bị thay đổi suốt trình tuần bảo quản Cấu trúc không bị thay đổi, không sinh mùi lạ, có mật độ tế bào giảm so với thời điểm ban đầu Vì vậy, để đảm bảo phô mai probiotic (chứa lƣợng probiotic đủ đem lại ảnh hƣởng tốt cho sức khỏe ngƣời tiêu dùng) phải bổ sung mật độ probiotic vào thời điểm ban đầu 109 -1011 CFU/g sản phẩm, sau tuần bảo quản 100C đảm bảo lƣợng tế bào probiotic >10 6CFU/g phô mai sản phẩm đạt chất lƣợng trƣớc tiêu thụ 47 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Qua kết thu đƣợc từ nghiên cứu phòng thí nghiệm việc bổ sung vi khuẩn probiotic vào phô mai, cho phép rút kết luận sau: Điều kiện tối ƣu để thu sinh khối vi khuẩn B.bifidum 370C môi trƣờng MRS lỏng pH 6,8 đƣợc nuôi cấy khoảng từ 28-30 với tỷ lệ giống bổ sung 10%, với mật độ tế bào vi khuẩn 1012 CFU/ml Tỷ lệ bổ sung sữa có đƣờng vào phô mai 1:1, cho loại phô mai mềm có độ ẩm khoảng 61-65%, có vị lạt với hàm lƣợng acid lactic khoảng 1,11,2%, phô mai có màu trắng sữa, pH 5, với mật độ tế bào 1011 CFU/g sản phẩm Hàm lƣợng probiotic bổ sung vào phô mai khoảng 109 -1011 CFU/g sản phẩm, sau thời gian bảo quản sản phẩm phô mai probiotic tuần với mật độ probiotic khoảng từ 106- 107 CFU/g sản phẩm (đạt yêu cầu sản phẩm probiotic) nhiệt độ bảo quản 100C Đề tài “Thử nghiệm tạo sản phẩm phô mai probiotic” bƣớc đầu khảo sát điều kiện tối ƣu trình nhân giống probiotic, hàm lƣợng probiotic đƣa vào phô mai ứng với thời gian bảo quản đảm bảo hoạt tính probiotic Đề tài tiền đề cho nghiên cứu sau này, góp phần đa dạng hóa sản phẩm probiotic nƣớc 4.2 Kiến nghị Giới hạn thí nghiệm bổ sung vi khuẩn B.bifidum vào phô mai để thử nghiệm tạo sản phẩm phô mai probiotic Mục tiêu sản phẩm probiotic số tế bào vi khuẩn sống sau thời gian bảo quản ≥106 CFU/g sản phẩm, mật độ probiotic có ảnh hƣởng tốt cho ngƣời tiêu thụ sản phẩm probiotic, đƣa số kiến nghị sau: + Để kéo dài thời gian bảo quản cho sản phẩm trƣớc tiêu thụ cải thiện khả sống sót Bifidobacteria kỹ thuật vi gói vi sinh vật trƣớc cho vào phô mai 48 + Ngoài ra, tiến hành nghiên cứu với nhiều chủng Bifidobateria khác để đƣa vào sản phẩm lên men từ sữa nhƣ phô mai nhằm chọn chủng có khả sống sót phô mai cao + Nghiên cứu cách để làm tăng khả sống sót vi khuẩn probiotic giai đoạn khác trình sản xuất phô mai, để tránh tƣợng sụt giảm lƣợng probiotic đƣa vào + Khảo sát nhiệt độ bảo quản khác để chọn đƣợc nhiệt độ thích hợp có thời gian bảo quản lâu nhƣng đảm bảo hoạt tính probiotic 49 PHỤ LỤC Hình 4.1 môi trƣờng MRS Hình 4.3 sản phẩm phô mai giàu probiotic Hình 4.2 môi trƣờng nhân giống sau 28 Hình 4.3 sản phẩm phô mai giàu probiotic 50 PHIẾU THĂM DÒ CẢM QUAN (sản phẩm phô mai probiotic) Họ tên ngƣời cảm quan: ………………………………………………………… Thời gian thực hiện: 10/12/2010 Địa điểm phòng thí nghiệm 108 B2 Mùi Vị Cấu trúc 1= mùi chua 1=chua 1= cứng 2= không mùi 2= chua nhẹ 2= cứng 3= mùi sữa 3= lạt 3= lỏng 4= mùi sữa chua 4= lạt, béo 4= sệt 5= mùi phô mai 5= mặn, béo 5= mềm Mẫu Mùi Vị Cấu trúc Mẫu ngon nhất: ……………………………… 51 [...]... ca hai dng b sung cỏc vi khun probiotic v s sng sút ca chỳng trong phụ mai bỏn cng: dng bt ụng khụ v dng sinh khi b sung vo sa Cỏch b sung dng sinh khi tuy khụng ci thin gỡ v kh nng sng sút ca vi khun probiotic trong quỏ trỡnh chớn, nhng õy l la chn kinh t hn so vi b sung dng ụng khụ [4] 1.4.2 Hm lng probiotic b sung vo phụ mai Trong quỏ trỡnh sn xut phụ mai probiotic thỡ phụ mai ti (phụ mai khụng qua... PROBIOTIC V CC NGHIấN CU TRONG V NGOI NC 1.4.1 Cỏch thc b sung probiotic Cú 2 cỏch b sung vi khun probiotic vo trong quỏ trỡnh sn xut phụ mai m cú nh hng trc tip n kh nng sng sút ca vi khun l: b sung vi khun probiotic trc khi lờn men (cựng lỳc vi ging sn xut phụ mai) hoc l b sung sau quỏ trớnh lờn men B sung vi khun probiotic trc khi lờn men thỡ s lng t bo vi khun probiotic gim xung trong quỏ trỡnh tỏch... theo hm m ca phụ mai Hm lng nc trong phụ mai thng c biu din thụng qua t l phn trm gia lng nc v tng khi lng phụ mai tr bộo, ký hiu MFFB Bng 1.2 Phõn loi phụ mai theo hm lng m Loi sn phm MFFB (%) Phụ mai rt cng < 41% Phụ mai cng 49-56 % Phụ mai bỏn cng 61-63 % Phụ mai bỏn mm 61-69% Phụ mai mm >67% [2] 17 Chng 1 Tng quan ti liu Da theo hm lng bộo trong phụ mai Lng cht bộo trong phụ mai thng c biu din... chớnh: phụ mai ti, phụ mai cú qua giai on chớn Bng 1.4 Phõn loi phụ mai theo qui trỡnh sn xut Loi sn phm c im Phụ mai ti Phụ mai cú qua giai on chớn Khụng qua giai on chớn H VSV tham gia trong quỏ trỡnh chớn - Vi khun - Vi khun v nm mc Cỏc bin i trong giai on chớn din ra ch yu : - Trờn b mt khi phụ mai - Trong b sõu khi phụ mai [2] 18 Chng 1 Tng quan ti liu 1.3.4 Nguyờn liu sn xut phụ mai a) Sa:... Lc.Lactis [17] B sung probiotic cỏc giai on khỏc nhau trong quỏ trỡnh sn xut phụ mai 1.4.2.1 Giai on cy ging 24 Chng 1 Tng quan ti liu Ging v probiotic s tỏc ng ln nhau gõy nh hng xu cht lng phụ mai T bo probiotic s mt kh nng sng sút trong quỏ trỡnh tỏch whey, do ú chỳng ta nờn kim tra ban u chn ra nhng ging v probiotic thớch hp nht Kim tra nhng thi im khỏc nhau trong quỏ trỡnh lờn men cy probiotic vo... phụ mai ó tr bộo Bng 1.3 Phõn loi phụ mai theo hm lng bộo Loi sn phm Hm lng bộo % Phụ mai cú hm lng bộo rt cao >60% Phụ mai cú hm lng bộo cao 45- 60 % Phụ mai cú hm lng bộo trung bỡnh 25 45 % Phụ mai cú hm lng bộo thp 10- 25% Phụ mai gy < 10% [2] Da vo quy trỡnh cụng ngh sn xut phụ mai Cú quỏ trỡnh chớn hay khụng v da vo h vi sinh vt gõy nờn cỏc bin i trong giai on chớn sn phm, ngi ta chia phụ mai. .. cm quan Sn phm sau khi b sung probiotic s c bo qun 100C v bt u kim tra cỏc ch tiờu theo dừi ti thi im ban u (ti thi im 0 gi) Cỏc ch tiờu theo dừi: pH, s lng vi khun probiotic (CFU/g) Cỏc yu t c nh 15g phụ mai nguyờn liu T l 1:1 sa tit trựng cú ng v phụ mai Thi gian 370C trong 8 gi Bo qun nhit 4-60C T l probiotic b sung vo 109, 1010, 1011 phụ mai Theo dừi ch tiờu Mt t bo probiotic (CFU/g) 35 Chng... phụ mai khỏc nhau Quy trỡnh k thut ch bin 3 loi phụ mai u h ẫp b 50% nc Cy ging 1% vi khun Lactobacillus sp 2-5% mi ging mc khỏc nhau tựy theo loi phụ mai mc nhit phũng Bo qun v chớn Hỡnh 1.3 Sn phm phụ mai lm t u nnh [24] Nhng nghiờn cu v phụ mai b sung probiotic vn cha c thc hin 26 Chng 1 Tng quan ti liu 1.4.3.2 Nghiờn cu ngoi nc Nm 1997 M.Gobbetti v cỏc cng s ó sn xut phụ mai Crescenza cú b sung. .. khỏc nhau v vic phõn gii protein khi cú b sung Bifidobacteria, nhng khi pH cao 4.6-N hũa tan v hot tớnh ca aminopeptidase, iminopeptidase, dipeptidase, v tripeptidase xut hin trong phụ mai b sung bifidobacteria Phụ mai Crescenza cú b sung bifidobacteria cha lactose, nng tng i cao acid lactic, acid acetic so vi phụ mai Crescenza truyn thng Khi phụ mai Crescenza b sung bifidobacteria thỡ hng v khụng thay... 3.6ì103 CFU/g Nghiờn cu ny cho rng phụ mai cheddar l loi phụ mai thớch hp cho vic b sung probiotic v chng L.acidophilus cn c ci thin nhiu hn [13] Nhng nh nghiờn cu Phn Lan ỏnh cao v tim nng ca phụ mai probiotic tng cng h min dch cho ngi gi Nghiờn cu ca TS Fandi Ibrahim i hc Turku kho sỏt ngi gi tui t 72-103 tui, tt c sng trong cựng iu kin, n phụ mai vo ba n sỏng trong 4 tun Sau ú kim tra mỏu xỏc nh