1 Trường Đại Học Nông Lâm TPHCM Bộ môn Công nghệ sinh học Lớp DH06SH Báo cáo tiểu luận môn Công nghệ sinh học thú y CHẨN ĐOÁN VIRUS PMWS (PROCINE MULTISYSTEMIC WASTING SYNDROM) BẰNG KỸ THUẬT GENE Giáo viên hướng dẫn: PGS.TS NGUYỄN NGỌC HẢI Người thực hiện: NGUYỄN HOÀNG NGÂN Mã sinh viên: 06126086 I ĐẶT VẤN ĐỀ Hội chứng còi cọc heo sau cai sữa PMWS (post weaning multisystemic syndrome) ghi nhận lần đàn heo Canada vào năm 1991 Trên đàn heo này, số heo sau cai sữa khoảng tuần bắt đầu có biểu còi cọc bắt đầu đáp ứng tốt với việc điều trị Sau đó, số trường hợp ghi nhận Mỹ đến nước châu Âu Cho đến năm nay, bệnh phát nhiều đàn heo Mỹ, nhiều nước Châu Âu số nước châu Á gây thiệt hại kinh tế lớn ngành chăn nuôi heo công nghiệp nước Hội chứng PMWS thường xuất heo lứa tuổi từ đến 18 tuần, tỷ lệ chết dao động từ 1-2% đến 10-25% số đàn heo Bệnh xuất với số triệu chứng điển gầy còm nhanh, thở khó, tiêu chảy, có số heo bị vàng da, nhạt màu… PMWS thường hay kết hợp với virus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp heo ( porcine reproductive respiratory syndrome virus- parasuis, PRRSV), virus cúm heo ( porcine parvovirrus-PPV), Haemophilus Actinobacillus pleuropneumoniae, Streptococcus suit Mycoplasma hyoppneumonia 1997 nhóm nghiên cứu thuộc đại học Saskatchewan (Clark, Ellis, Harding, West) phân lập PCV2 từ ca PMWS Từ đó, người ta thực thành công thí nghiệm gây nhiễm PCV2 heo Báo cáo Neumann ctv (2002) cho biết mẫu huyết heo Mỹ lưu trữ từ năm 1969 đem xét nghiệm tìm kháng thể kháng virus PVC2 cho kết dương tính Phương pháp hồi cứu mẫu mô huyết lưu trữ kỹ thuật mô hóa miễn dịch lai mô cho thấy PVC2 lưu hành châu Âu vào năm 1970 tài liệu ghi nhận bệnh PVC2 gây vào thời điểm ( Tucker ctv, 2006) II TỔNG QUAN Tác nhân gây bệnh: • Circovirus thuộc họ virus có DNA mạch vòng, vỏ bao chứa gen vòng đơn • Dựa vào đó, tổ chức quốc tế phân loại virus xếp chúng vào họ DNA virus gọi Circovitidae, giống Circovirus (Lukertvaf cộng sự,1995) • PVC có trọng lượng CsCl 1.33-1.34 (Buhk ctv, 1985) • Là loại virus nhỏ biết đến có khả sống sót cao môi trường • Gồm có tuyp tìm thấy heo, bao gồm type (PVC1) type (PVC2) • Bộ gen DNA PCV1 gồm 1759bp PCV2 1768bp (Meehan ctv,1997) • Bộ gen PVC gồm khung đọc mở (open reading frame – ORFs), ORF1 mã hóa cho protein tham gia vào trình nhân lên virus ORF2 mã hóa cho gen cấu trúc virus • Trên heo có hai loại PVC: PVC1 PVC2 với nhiễm sắc thể tương đồng khoảng 68-78%, ORF tương đồng khoảng 83% trình tự nucleotide 86% acid amin PVC1 xem virus nhiễm thường xuyên tự nhiên tế bào thận heo PK15 virus không gây bệnh Ngược lại, PVC2 xem tác nhân gây PMWS • PVC nhân lên tốt môi trường tế bào PK/15 Sự nhân lên virus đánh giá kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang nhuộm miễn dịch peroxidase hầu hết tế bào bị nhiễm PVC Bằng kỹ thuật nhuộm nhân tập trung, heo bị PMWS, bệnh tích thể bao hàm ưa kiềm tế bào chất số tế bào nhiễm PCV2 tìm thấy ( Clark,1997,Harding,1997,Allan ctv,1999) a/ Circovirus type (PVC-1): • Năm 1974, nhà khoa học phân lập Circovirus type từ tế bào thận heo • Hiện nay, chúng không gây bệnh cho heo b/ Circovirus type (PVC-2): Figure Morphology and genomic organisation of PCV2 A The PCV2-virion consists of a capsid without envelope B The genome of PCV2 is a single stranded circular DNA molecule with a stem loop structure C A highly conserved nonanucleotide sequence is located on the top of the stem loop structure Close to the stem loop structure the ORF2 starts on the viral strand coding for the capsid protein, in the other direction, on the complementary strand, starts ORF1 that codes for the Rep protein Figure3 Porcine circovirus type (PCV2) with fine outer capsid • Được ghi nhận vào 1991 Tây Canada, phát vết thương • Bao gồm nhiều chủng khác (kiểu sinh học kiểu gen) Kháng thể PVC-2 phát huyết heo nuôi Bỉ năm 1985 • Từ kinh nghiệm nghiên cứu ban đầu cho thấy, gây nhiễm virus type lên heo, heo biểu tổn thương đặc trưng bệnh Tuy nhiên, loại virus khác Parvovirus heo (PPV) hay PRRSV tiêm vào lúc heo mang biểu tương tự Những nguyên nhân gây bệnh thường nhiễm PCV type hay vài loại virus khác tất heo bị nhiễm PCV PPRS biểu bệnh lý PMWS • Những nghiên cứu huyết Châu Âu Bắc Mỹ cho thấy, lây nhiễm lan rộng đàn heo phần nhỏ đàn có huyết dương tính biểu bệnh lý Điều hầu hết ca lây nhiễm có biểu ngầm với bệnh Heo bị nhiễm trước cai sữa • Sức đề kháng: PCV2 đề kháng cao với nhiều chất sát trùng ( ethanol, chlohexidine, iodine formaldehyde), tồn môi o trường suốt nhiều tháng, chịu đụng sức nóng 70 C/15’ không bị vô o hoạt pH=3 Virus phân lập từ mô lưu trữ -70 C nhiều tháng (Ellis ctv,1998) Sodiumhydroxide Virkon S với độ pha loãng 1% có hiệu việc bất hoạt PCV2 (Royer ctv, 2001) • Bằng thực nghiệm, người ta ghi nhận PCV2 lây truyền ngang dọc, theo đường hô hấp, đường máu, thai sinh dục • Virus tồn heo mang trùng từ 5-6 tháng Phân, nước tiểu, máu, dịch tiết mũi heo nhỏ bị nhiễm PVC2cos chứa acid nucleic PCV2 phương tiện lan truyền virus đàn • Thực nghiệm, gây nhiễm PCV2 cho heo nuôi thí nghiệm lúc ngày tuổi, Krakowka ctv (2001)đã phát acid nucleic PCV2 có phân, nước tiểu, nước mắt héo sau 31 ngày gây nhiễm • Ngoài ra, PCV2 tìm thấy tinh dịch heo đực nhiễm bệnh lây truyền virus qua giao phối (Kim ctv,2001) • Lây truyền dọc ghi nhận Sự chết bào thai sẩy thai có liên quan đến nhiễm bệnh qua đường sinh dục (Bogdan ctv,2001) Cách gây bệnh Cơ chế gây bệnh PCV2 heo đến chưa biết rõ Tuy nhiên, qua phương pháp lây nhiễm heo sống, Misinzo ctv (2006) phát PCV2 có nhiều loại tế bào tế bào gan, biểu mô, nội mô, lympho bào, tế bào trơn nguyên sợi bào Krakowka ctv (2001) gây nhiễm qua đường mũi hay tiêm tĩnh mạch heo thí nghiệm, tác giả nhận thấy có diện bạch cầu đơn nhân đại thực bào phổi, hạch hạnh nhân, hạch lympho, lách quan khác hệ thống miễn dịch; phổi, gan, thận, dày-ruột lách khoảng ngày 14-21sau gây nhiễm Tình trạng nhiễm virus huyết xuất lúc 14 ngày sau nhiễm kéo dài 2-4 tuần Sau gây nhiễm 21 ngày, phổi thú có nhiều vùng bị xẹp chức năng, hạch lympho sưng lớn chuyển sang màu nâu Đối với hệ thống miễn dịch, PCV2 công vào tế bào đích tế bào hình tương tác với tế bào dòng tủy (tế bào lympho B, lympho T, tế bào NK ngoại trừ tế bào bạch cầu đơn nhân lớn) làm giảm tế bào lympho hạch hạnh nhân hạch lympho để lại bệnh tích vi thể đặc trưng Mức độ cấp tính bệnh tích vi thể số lượng PCV2 bệnh tích liên quan chặc chẽ với mức độ nghiêm trọng biểu lâm sàng PCV2 làm hư hại hệ thống miễn dịch cách ức chế miễn dịch Ngoài ra, virus PCV2 tác dụng làm giảm tiểu cầu nghiêm trọng gây xuất huyết mô kéo dài Sự công virus vào gan khởi đầu làm cho tế bào gan, tế bào Kupffer, tế bào nội mô bị sưng triễn dưỡng nên gan to Sau đó, tế bào bị dung giải nên giảm số lượng kích thướt tế bào gan teo lại, đồng thời mật ứ lại ống mật khiến gan trở nên vàng Nguyên nhiễm • nhân lây Nhiễm từ tinh dịch heo bệnh, phân, phương tiện, vật dụng (quần áo, xe đẩy,…) hay từ loài khác (Chuột, Chim,…) • Tiếp xúc heo bệnh với heo khỏe mạnh • Do Stress (trong trình vận chuyển, thay đổi môi trường, thay đổi chuồng trại,… • đặc Do nhập nhiều heo với độ tuổi khác chăn nuôi với mật độ dày Do thú sản xuất liên tục • Triệu chứng a Heo cai sữa heo trưởng thành o • Sốt 41 - 42 C, đột tử, xuất triệu chứng thần kinh • Sụt cân, hốc hác, lông thô ráp, da tái nhợt, bị vàng da, chậm phát triển (giai đoạn 6-8 tuần tuổi) tai bị đổi màu • Một số trường hợp, bệnh thường kèm với số triệu chứng hô hấp (khó thở viêm phổi) tiêu hóa (30% trường hợp bị tiêu chảy loét dày • Ngoại vi hạch bạch huyết sưng to, đặc biệt hai chân sau heo Nếu ta dựng đỡ heo lên thấy hạch bẹn có kích cỡ lớn banh golf • Thường phát triệu chứng viêm da suy thận (PDNS) đàn bị PMWS • Tỉ lệ heo cai sữa chết khoảng từ 6-10% thông thường cao (20%) Tỉ lệ chết heo lớn lên đến 10% • Những ca bệnh kéo dài đàn nhiều tháng Chúng thường đạt đến đỉnh điểm sau 6-12 tháng sau giảm từ từ b Heo nái heo con: • Những • Hiếm heo trưởng thành, heo nái heo không bị ảnh hưởng heo bú bị ảnh hưởng bệnh tuần tuổi • Đôi triệu chứng xảy tương tự thú bị suy sinh dưỡng, thiếu nước, loét dày, viêm ruột non trực khuẩn, bệnh lý, PRRS bệnh khác… Lúc đó, phải biết loại trừ bệnh xảy lúc hay theo sau PMWS Mối quan hệ hệ bệnh không hiểu rõ bệnh xuất đàn mà không cần có bệnh Bệnh tích: Mổ khám tử thi • Xác súc vật bị gầy da vàng • Lách nhiều hạch bạch huyết sưng to Tuy nhiên, phải đặt nghi vấn trường hợp hình ảnh tuyến bạch huyết sưng to • Thân bị sưng phồng với đốm trắng nhỏ quan sát mắt từ bề mặt • Phổi thường dính, có đốm phù nề, có vằn dai • Ngực, mô quan ổ bụng bị phù nề hay úng nước Giới thiệu pháp PCR a Nguyên chung phương tắc Thành phần cho phản ứng PCR bao gồm: DNA mẫu, mồi xuôi, mồi ngược, dNTP (dATP, dCTP, dTTP, dGTP), dung dịch đệm cho phản ứng PCR, MgCl2, Tap polymerase Tất DNA polymerase hoạt động tổng hợp mạch DNA từ mạch khuôn cần diện mồi chuyên biệt Mồi oligonucleotide có khả bắt cặp bổ sung với đầu 3’của mạch khuôn DNA polymerase nối dài mồi để hình thành mạch Mồi xuôi (forward primer: F) tác động lên sợi DNA theo chiều từ 3’->5’ Mồi ngược (Reverse primer: R) tác đọng theo chiều từ 5’->3’ Phản ứng PCR nhân trình tự nằm hai đoạn Phản ứng PCR cho phép khuếch đại từ DNA ban đầu thành số lượng lớn DNA thực nhờ enzyme DNA polymerase không cần đến diện tế bào Kỹ thuật thực sở phản ứng sinh tổng hợp DNA theo ba giai đoạn sau: o • Giai đoạn biến tính: nhiệt độ 92-95 C, hai chuỗi DNA tách để làm khuôn mẫu để tổng hợp hai mạch bổ sung; giai đoạn ủ để lai phân tử (hybridization), hai mồi bắt cặp bổ sung với mạch khuôn DNA hai đầu nhằm chuẩn bị cho kéo dài; giai đoạn kéo dài (elongation) tạo thành chuỗi DNA bổ sung với chuỗi DNA gốc Mỗi chu kỳ gồm ba bước lặp lặp lại nhiều lần, lượng DNA nhân lên theo cấp số nhân Ba giai đoạn xảy điều kiện nhiệt độ khác nên cần phải có máy luân nhiệt kiểm soát phản ứng với tính tự động hóa cách xác Sự lặp lại theo chu kỳ thường xảy khoảng 30 lần để làm tăng hoạt gen thành khối lương lớn nhiều lần so với khối lượng DNA ban đầu b Ứng dụng PCR nghiên cứu PCV2 Kỹ thuật PCR lần ứng dụng để phát PCV2 mô báo cáo vào năm 1997 Narar ctv Trên giới, nhiều tác giả ứng dụng kỹ thuật PCR để tìm hiểu đặc tình PCV2 đàn có hội chứng PMWS Allan ctv (1998), Harmel (1998), Calsamiglia (2001), Kim (2002), Segales Morvan (2002)… Trong chuẩn đoán bệnh liên quan với PCV2, tác giả (Mori ctv,2000; Lyoo Park, 2001; Royer ctv, 2001) nhận định kỹ thuật PCR nhạy đặc hiệu chuẩn đoán xác định PCV2 Nghiên cứu PCV2 phương pháp xét nghiệm khác nhau, Stevenson (2000) nhận định kỹ thuật PCR nhạy nhất, kỹ thuật lai mô thấp kỹ thuật phân lập virus Quardani ctv (1999) cho biết độ nhạy kỹ thuật PCR phát PCV2 đạt đến 5pg DNA virus Chuẩn đoán PMWS virus A Giới thiệu chung phương pháp chuẩn đoán PMWS virus Trong chuẩn đoán xác định nguyên nhân gây PMWS cần phải sử dụng kỹ thuật thể liên quan trực tiếp virus bệnh tích mô, tế kỹ thuật hóa mô miễn dịch, lai chỗ… khuyến cáo áp dụng nhiều so với kỹ thuật PCR phân lập virus đơn Việc phát PVC2 cho phép kết luận thú bị nhiễm PVC2 kết luận thú bị PMWS DNA kháng nguyên PVC2 phát kỹ thuật hóa mô miễn dịch, lai chỗ đại thực bào nhiều loại mô bệnh Do khác biệt gen ORF2 nhiều so với ORF1 nên đoạn dò thường thiết kế dựa khác biệt gen ORF2 nhằm chuẩn đoán phân biệt PCV1 PCV2 Muirhead (2002) cho để chuẩn đoán xác PMWS cần dựa tiêu chí: biểu lâm sàng, bệnh tích đặc trưng xét nghiệm chứng minh acid nucleotide kháng nguyên PCV2 liên quan đến bệnh tích đặc trưng • Những biểu lâm sàng: tuổi mắc bệnh thường từ 6-14 tuần có lên đến 20 tuần, còi cọc, giảm tăng trọng, chậm lớn, chết đột ngột, kèm với chứng thở khó hoàng đảng Chuẩn đoán phân biệt heo bệnh PCV2 so với nguyên nhân khác làm heo còi, suy nhược suy dinh dưỡng, thiếu ăn, thiếu nước, loét dày, viêm phổi địa phương, viêm ruột E.coli, bệnh hồng lỵ heo, hội chứng PRRS, PDNS (Pemek ctv,2002) • Bệnh tích mổ khám: tích nhiều dịch xoang suy thoái tổ chức lympho, hạch lympho sưng lớn viêm nhiễm quan khác • Những xét nghiệm phòng thí nghiệm: Bệnh tích vi thể: thể bao hàm ưa kiềm, nang lympho thoái triễn, mô bệnh tiến triển từ viêm mô lympho đến u hạt quan (chủ yếu phổi hạch lympho) Phương phát huyết học: giúp đánh giá tình trạng nhiễm PCV2 đàn Kháng thể phát phương pháp miễn dịch huỳnh tế bào quang gián tiếp (IFA), xét nghiệm miễn dịch peroxidase gián tiếp tế bào lớp (IPMA) Elisa Trong đó, phương pháp Elisa cạnh tranh chọn để phát PCV2 tình với PCV2 kháng nguyên tác nhân phản ứng cạnh tranh kháng thể đơn dòng đặc hiệu PCV2 Kỹ thuật Elisa cạnh tranh có độ nhạy đến 99.5% độ đặc hiệu cao 97.1 (Walker ctv, 2000) Hóa mô miễn dịch tế bào ( ICC_ immunocytochemitry) kỷ thuật lai mô (ISH_insitu hybridisation): hai phương pháp dùng để phát kháng nguyên PCV2 mô ca PMWS Hầu hết nghiên cứu PMWS PCV2 sử dụng hai kỹ thuật Trong đó, kỹ thuật ICC nhạy nhiều so với kỹ thuật ISH (Neilly ctv,1999) Phân lập virus: phương pháp liên quan đến việc nuôi cấy môi trường tế bào PK_15 ly trích từ mô mô không lây nhiễm PCV1, cách nhiều ngày không nhạy so với kỹ thuật ICC ISH (Sorden,2000) Về bản, phân lập virus chủ yếu phục vụ cho việc bào chế vaccine định type virus Người ta không ứng dụng vào mục đích chuẩn đoán chứng minh có mặt PCV2 hay hội chứng PMWS đàn Kỹ thuật PCR: có độ xác cao tốn thời gian nên úng dụng chuẩn đoán phân biệt PCV1 PCV2 Trong đó, kỷ thuật PCR nhiều mồi (multiplex PCR assays) sử dụng rộng rãi để phát chủng PCV2 phân lập từ ca khác So với nhiều phương pháp khác lợi phương pháp PCR ứng dụng để xét nghiệm cho nhiều loại mẫu khác huyết thanh, mẫu mô tươi đong lạnh mẫu tinh dịch Do có độ nhạy cao nên kỹ thuật PCR đòi hỏi phòng thí nghiệm phải đại kỹ thuật viên thao tác tốt B.Sử dụng phương pháp PCR để chuẩn đoán a Bước đầu ghi nhận diện Porcine circovlrus type heo biểu còi số trại heo công nghiệp TP Hồ Chí Minh vùng lân cận VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Mẫu: bạch huyết heo có dấu hiệu còi cọc sau cai sữa, lứa tuổi từ đến 18 tuần, nuôi số trại heo công nghiệp từ thành phố Hồ Chí Minh số tỉnh lân cận Sử dụng phương pháp PCR để phát diện virus PCV2 mô Ly trích DNA virus PCV2 theo mô tả Lyoo K, cộng (2001) Chạy phản ứng PCR theo mô tả Harm cộng (2001) Bộ primer sử dụng đặc hiệu cho sản phẩm với kích thướt 702bp Các thành phần cho phản ứng chạy PCR chứa 50 μl dung dịch hỗn hợp bao gồm: μl dung dịch MgCl2 15mM, 0.4 μl dNTPs, 10pmol đoạn mồi, U Tap DNA polymerase μl dung dịch nẫu ly trích DNA, sau cho thêm nước để đạt thể tích 50 μl Hỗn hợp chạy PCR với thông số theo mô tả sản phẩm Sản phẩm PCR phân tích nồng độ agar 0.8% KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Trong 25 mẫu bạch huyết thu thập xét nghiệm để thăm dò diện PCV type phương pháp PCR, phát mẫu dương tính với virus chiếm tỷ lệ 36% Tỷ lệ mẫu dương tính trại thu thập mẫu sau: NGHIÊN CỨU KHOA HỌC KỶ THUẬT Bảng 1: tỷ lệ dương tính với PCV type trại khảo sát: Trại/chỉ tiêu theo dõi Số mẫu theo dõi 10 Số mẫu khảo sát Tỷ lệ % 25,00 0,00 33,33 60,00 Tỷ lệ dương tính PCV2 heo còi trại biến động lớn, từ không nhiễm đến 60% Điều xảy điều kiện vệ sinh chăm sóc, nguồn gốc heo, việc xuất nhập heo trại khác Hội chứng còi cọc sau cai sữa PCV2 mô tả xuất dạng trại chăn nuôi nào, từ trại nuôi heo thịt đến trại nuôi heo giống, không phụ thuộc vào quy mô chăn nuôi, từ trại có 30 heo nái đến trại có 10.000 nái Dewey C, (2000) thực thí nghiệm để tìm nguyên nhân gây hội chứng còi heo sau cai sữa ông rút kết luận vấn đề vệ sinh chăm sóc điều kiện địa lý mật độ chăn nuôi có ảnh hưởng chủ yếu việc phát tán mầm bệnh gây hội chứng Bảng Tỷ lệ mẫu dương tính với PCV type trại khảo sát Nhóm tuổi(tuần)/ 6-8 9-11 12-18 Số mẫu khảo sát 10 Số mẫu dương tính Tỷ lệ % 37,55 40,00 28,57 Chỉ tiêu theo dõi Kết cho thấy phát virus PCV2 nhóm tuổi heo có biểu còi Bảng Sự phân bố virus PCV2 loại hạch bạch huyết heo có biểu còi Vị trí hạch/chỉ tiêu Hạch bẹn cạn Hạch phổi Hạch ruột theo dõi Số mẫu khảo sát 25 25 25 Số mẫu dương tính Tỷ lệ % 36,00 12,00 20,00 Kết từ phản ứng PCR cho thấy hạch bẹn cạn vị trí phát PCV2 cao heo khảo sát Ngoài vị trí hạch bạch huyết hạch hạnh nhân vùng miệng heo phát có khu trú virus PCV2 (Segales J ctv,2001) Phần lớn nghiên cứu bệnh giới cho virus PCV2 có liên quan đến suy giảm miễn dịch heo, làm heo dễ bị kế phát mầm bệnh khác, phổ biến vi khuẩn gây bệnh đường hô hấp Maes R,2000 cho tỷ lệ bệnh PCV2 gây thấp, tỷ lệ chết thường lên đến 100% Bahnson P (2002) xác nhận vai trò PCV2 việc gây hội chứng PMWS heo b Phát virus PCV2 kỷ thuật PCR Phân bố, thu thập bảo quản mẫu Phân bố mẫu Chọn trại có tiền sử heo cai sữa bị còi có heo còi với tỷ lệ tăng đột ngột sau cai sữa với quy mô khác (theo đàn nái) để lấy mẫu Dựa theo số liệu điều tra qui mô, cấu đàn heo chi cục thú y TP Hồ Chí Minh năm 2005 (tài liệu lưu hành nội bộ) Chúng phân thành loại quy mô chăn nuôi theo số lượng heo nái trại sau: Quy mô trại heo Số trại lấy mẫu Số heo còi chọn Tổng cộng heo còi Theo số lượng heo mổ/ trại chọn mổ nái ≤10 10 11-50 2-3 51-100 2-4 16 101-200 3-5 14 >200 5-6 16 Tổng cộng 65 Thu thập bảo quản mẫu Số heo chọn khảo sát 65 con, ghi nhận tất triệu chứng, sau mổ khám để ghi lại bệnh tích theo mức độ nặng nhẹ ca bệnh chụp hình theo cụm quan sát Bước tiến hành 1.ly trích DNA từ mẫu chọn (Lyoo Park,2001) • Cắt nhỏ mẫu (khoảng cm ) cho vào ống eppendorf • Thêm 60 μl dung dịch đệm (50mM tris-HCl, 1mM EDTA 1% o SDS, pH=8) μl protease, ủ hỗn hợp 55 C 1h • Cho vào hỗn hợp phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24) vortex nhẹ, ly tâm 12.000 vòng/phút phút, lấy phần nước nổi, cho o thêm vào 1mL ethanol lạnh, ủ -20 C 2h, ly tâm 12.000 o vòng/phút phút 10 C, lấy cặn làm o • Cho thêm vào 180 μl TE 1X, vortex, ủ 55 C 15 phút • Cho vào 20μl natri acetate 2M, trộn đều, tiếp tục cho vào 500μl ethanol tuyệt đối lạnh, trộn đều, ủ 15 phút ly tâm 12.000 o vòng/phút phút 10 C bỏ phần nổi, lấy cặn, rửa cặn 1ml ethanol 70%, ly o tâm 12.000 vòng/phút phút 10 C, lấy cặn làm khô cặn tủ ấm o 55 C o • Hòa tan cặn 200μl TE 1X, ủ 25 C qua đêm, vortex o Sản phẩm PCR sau ly trích giữ -20 C sử dụng Thực phản ứng PCR Tiến hành phản ứng PCR với sản phẩm DNA ly trích cách dùng cặp mồi đặc hiệu với PCV2 (Hams ctv, 2001) Mồi xuôi PCV1067: 5’ TTAGGCTTTAAGTGGGTGTG 3’ Mồi ngược PCV1740: 3’ATGACGTATCCAAGGAGCCG 5’ Các thành phần cho phản ứng PCR phát DNA virus PCV2: PCR bufer 10X 1.5 μl MgCl2 15mM 1μl dNTPs 10mM 0.35μl MX 0.5mM 0.8μl MN 0.5mM 0.8μl Tap DNA polymerase 5UI 0.2μl DNA mẫu 2μl Nước cất hai lần vô trùng đầy đủ 20μl Trộn nhẹ nhàng hỗn hợp trên, chạy PCR để khuếch đại DNA máy luân nhiệt Chu trình chạy PCR máy luân nhiệt 94 C phút o 94 C 60s o 56 C 56s o 72 C 45s o 72 C phút Điện di gel agarose đọc kết Sản phẩm khuếch đại kiểm tra cách chạy điện di thạch agarose 20% dung dich TBE với thời gian 30 phút Nhuộm gel dung dịch ethidium bromide 1/10.000 Đọc kết máy chụp gel có gắn với hình vi tính (sử dụng phần mềm Quantitu one 2000) Sản phẩm PCR cần thu hoạch vị trí 702bp Kết thảo luận Trong nghiên cứu này, ghi nhận diện virus PCV2 dựa vào cặp mồi Harms ctv (2001) mô tả Kết phương pháp PCR cho sản phẩm có kích thướt 702bp Một số tác giả khác thiết kế cặp mồi khác để phát virus PCV2 Quardani ctv (1999), Lyoo Park (2001), Fenaux ctv (2002) Mỗi cặp mồi cho sản phẩm PCR có kích thướt đặc trưng tương ứng Hình Kết chạy PCR để phát PCV2 từ heo có biểu còi Nghiên cứu PCV2 có nhiều kỹ thuật khác Trong đó, kỹ thuật huyết học (IFA, IPMA Elisa) dùng để đánh giá tình trạng nhiễm PCV2 đàn, kỹ thuật mô hóa miễn dịch lai mô nhằm phát kháng nguyên PCV2 mô heo nhiễm PCV2 heo mắc hội chứng PMWS Phân lập virus phục vụ công tác điều chế vacine định tuýt virus PCV Riêng kỹ thuật PCR ứng dụng nhiều phục vụ công tác chuẩn đoán xác định PCV2.(Lekcharoensuk ctv, 2004) Tương tự phương pháp huyết học, hạn chế kỷ thuật PCR chuẩn đoán phân biệt ca dương tính PCV2 với ca PMWS Ngoài ra, kỹ thuật đòi hỏi phải có phòng xét nghiệm chuẩn kỹ thuật viên thao tác tốt nhằm tránh phân loại nhằm lẫn vấy nhiễm từ phòng thí nghiệm nhiễm chéo suốt trình thu thập mẫu… Khắc phục hạn chế kỹ thuật PCR định tính, PCR định lượng phát triển Nó kết hợp chặc chẽ nồng độ biết trước DNA cạnh tranh để giúp so sánh mức độ DNA PCV2 huyết heo khỏe mạnh so với DNA PCV2 heo mắc hội chứng PMWS (Liu ctv,2000) Các tác giả cho biết độ nhạy kỹ thuật PCR phát PCV2 đạt đến 99.7% độ đặc hiệu 98.1% IV KẾT LUẬN Kỹ thuật PCR nên ứng dụng chuẩn đoán ca heo còi nghi PCV2 trại chăn nuôi với bệnh phẩm hạch bẹn sưng lớn Trong tình hình vacine phòng bệnh PCV2 chưa phổ biến, trại cần áp dụng biện pháp an toàn sinh học khống chế yếu tố gây stress, chọn lọc giống, cải thiện công tác quản lý, điều kiện vệ sinh chăn nuôi nhằm khống chế hội chứng PMWS Tiếp tục khảo sát với số lượng mẫu lớn nhiều đối tượng heo, nhiều tỉnh thành nước, theo mùa vụ năm nhằm nắm rõ dịch tễ đề xuất hướng phòng kiểm oát mầm bệnh PCV2 Khảo sát phân bố virus PCV2 nguồn tinh heo, dịch tiết hô hấp, nước tiểu, phân, máu… để có định hướng kiểm soát nguồn virus đàn heo khỏe mang trùng PCV2 Khảo sát mối liên hệ hội chứng còi cọc PCV2 số tác nhân khác như: PRRS, PPV, Mycoplasma hyopreumoniae, dịch tả heo, E.coli V TÀI LIÊU THAM KHẢO Lê Tiến Dũng, 2006 Phát virus PCV2 kỷ thuật PCR phân lập định danh số vi khuẩn gây bệnh hô hấp heo nghi mắc hội chứng còi cọc sau cai sữa Luận văn tiến sĩ nông nghiệp, ĐH Nông Lâm, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam Nguyễn Ngọc Hải,2007 Công nghệ sinh học thú y Nhà xuất nông nghiệp, TP Hồ Chí Minh www.porkworld.com www.octagon-services.co.uk PHỤ LỤC Trang LỜI MỞ ĐẦU TỔNG QUAN I Giới thiệu bệnh lở mồm long móng II Lịch sử đời vaccine Định nghĩa vaccine Thành phần chủ yếu vaccine Cơ chế hoạt động 10 Phương pháp sản xuất vaccine 10 III Sự chọn giống phát triển vaccine FMD .11 IV Các loại vaccine phòng bệnh lở mồm long móng .12 Vaccine vô hoạt 12 Vaccine nhược độc .14 Vaccine tái tổ hợp .14 Vaccine peptide tổng hợp 19 KẾT LUẬN 20 TÀI LIỆU THAM KHẢO 21 [...]... nhận định kỹ thuật PCR là rất nhạy và đặc hiệu trong chuẩn đoán xác định PCV2 Nghiên cứu về PCV2 bằng phương pháp xét nghiệm khác nhau, Stevenson (2000) nhận định kỹ thuật PCR là nhạy nhất, kế đến là kỹ thuật lai trong mô và thấp nhất là kỹ thuật phân lập virus Quardani và ctv (1999) cho biết độ nhạy của kỹ thuật PCR trong phát hiện PCV2 có thể đạt đến 5pg DNA của virus 7 Chuẩn đoán PMWS virus A Giới... pháp chuẩn đoán PMWS virus Trong chuẩn đoán xác định nguyên nhân gây ra PMWS cần phải sử dụng các kỹ thuật thể hiện liên quan trực tiếp giữa virus và bệnh tích mô, chính vì tế kỹ thuật hóa mô miễn dịch, lai tại chỗ… được khuyến cáo áp dụng nhiều hơn so với kỹ thuật PCR hoặc phân lập virus đơn thuần Việc phát hiện PVC2 chỉ cho phép kết luận thú bị nhiễm PVC2 nhưng không thể kết luận thú bị PMWS DNA hoặc... PCV2 và heo mắc hội chứng PMWS Phân lập virus phục vụ công tác điều chế vacine và định tuýt virus PCV Riêng kỹ thuật PCR được ứng dụng nhiều nhất phục vụ công tác chuẩn đoán xác định PCV2.(Lekcharoensuk và ctv, 2004) Tương tự như phương pháp huyết thanh học, hạn chế của kỷ thuật PCR là không thể chuẩn đoán phân biệt giữa những ca dương tính PCV2 với các ca PMWS Ngoài ra, kỹ thuật này đòi hỏi phải có... không nhạy so với kỹ thuật ICC và ISH (Sorden,2000) Về cơ bản, phân lập virus chủ yếu phục vụ cho việc bào chế vaccine và định type virus Người ta không ứng dụng nó vào mục đích chuẩn đoán hoặc chứng minh sự có mặt của PCV2 hay hội chứng PMWS trong đàn Kỹ thuật PCR: có độ chính xác cao và ít tốn thời gian nên hiện nay được úng dụng trong chuẩn đoán phân biệt giữa PCV1 và PCV2 Trong đó, kỷ thuật PCR nhiều... dịch tế bào ( ICC_ immunocytochemitry) và kỷ thuật lai trong mô (ISH_insitu hybridisation): cả hai phương pháp được dùng để phát hiện kháng nguyên PCV2 trong các mô của những ca PMWS Hầu hết các nghiên cứu về PMWS hoặc PCV2 đều sử dụng một hoặc cả hai kỹ thuật này Trong đó, kỹ thuật ICC nhạy hơn rất nhiều so với kỹ thuật ISH (Neilly và ctv,1999) Phân lập virus: phương pháp này liên quan đến việc nuôi... nhau để phát hiện virus PCV2 như Quardani và ctv (1999), Lyoo và Park (2001), Fenaux và ctv (2002) Mỗi cặp mồi sẽ cho sản phẩm PCR có kích thướt đặc trưng tương ứng Hình 1 Kết quả chạy PCR để phát hiện PCV2 từ heo có biểu hiện còi Nghiên cứu về PCV2 có rất nhiều kỹ thuật khác nhau Trong đó, kỹ thuật huyết thanh học (IFA, IPMA hoặc Elisa) dùng để đánh giá tình trạng nhiễm PCV2 của đàn, kỹ thuật mô hóa miễn... PCR trong nghiên cứu PCV2 Kỹ thuật PCR lần đầu tiên được ứng dụng để phát hiện PCV2 trong mô được báo cáo vào năm 1997 bởi Narar và ctv Trên thế giới, nhiều tác giả đã ứng dụng kỹ thuật PCR để tìm hiểu đặc tình của PCV2 trong những đàn có hoặc không có hội chứng PMWS như Allan và ctv (1998), Harmel (1998), Calsamiglia (2001), Kim (2002), Segales và Morvan (2002)… Trong chuẩn đoán những bệnh liên quan... PMWS DNA hoặc kháng nguyên của PVC2 có thể phát hiện bằng kỹ thuật hóa mô miễn dịch, lai tại chỗ trong đại thực bào của nhiều loại mô bệnh Do đó sự khác biệt về gen của ORF2 nhiều hơn so với ORF1 nên các đoạn dò thường được thiết kế dựa trên sự khác biệt gen của ORF2 nhằm chuẩn đoán phân biệt PCV1 và PCV2 Muirhead (2002) cho rằng để chuẩn đoán chính xác PMWS cần dựa trên 3 tiêu chí: biểu hiện lâm sàng,... so sánh các mức độ DNA PCV2 trong huyết thanh của heo khỏe mạnh so với DNA PCV2 của những heo mắc hội chứng PMWS (Liu và ctv,2000) Các tác giả cũng cho biết độ nhạy của kỹ thuật PCR trong phát hiện PCV2 đạt đến 99.7% và độ đặc hiệu là 98.1% IV KẾT LUẬN Kỹ thuật PCR nên ứng dụng trong chuẩn đoán những ca heo còi nghi do PCV2 tại các trại chăn nuôi hiện nay với bệnh phẩm là hạch bẹn sưng lớn Trong tình... ứng dụng để xét nghiệm cho nhiều loại mẫu khác nhau như huyết thanh, mẫu mô tươi hoặc đong lạnh và cả những mẫu tinh dịch Do có độ nhạy cao nên kỹ thuật PCR đòi hỏi phòng thí nghiệm phải hiện đại và kỹ thuật viên thao tác tốt B.Sử dụng phương pháp PCR để chuẩn đoán a Bước đầu ghi nhận sự hiện diện của Porcine circovlrus type 2 trên heo biểu hiện còi tại một số trại heo công nghiệp ở TP Hồ Chí Minh và