BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Bài tiểu luận GVHD: PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải SVTH : Nguyễn Văn Khoa Lớp: DH06SH MSSV: 06126060 Tp Hồ Chí Minh, tháng 10 năm 2009 Protein tái tổ hợp virus dịch tả heo Đặc vấn đề Bệnh dịch tả heo( DTH) loại virus pestivirus, họ Flaviviridae, bệnh truyền nhiễm gây tiêu chảy nặng, lây lan nhiều, thuốc đặc trị Bệnh lợn lứa tuổi với nhiều thể khác nhau, gây chết không, lợn nhiễm bệnh trì mầm bệnh lâu dài gây thiệt hại trầm trọng mặt kinh tế cho người chăn nuôi Virus xâm nhập chủ yếu qua đường tiêu hóa, qua niêm mạc, qua vết thương da phần qua hệ thống hô hấp Đặc điểm quan trọng thường thấy dịch tả heo cấp tính xuất huyết điểm giai đoạn đầu bệnh có dấu hiệu lâm sàn giống bệnh phó thương hàn Theo nghiên cứu cho thấy CSFV lây truyền theo chiều ngang theo chiều dọc Lây truyền virus theo chiều ngang tiếp xúc trực tiếp hay không trực tiếp vật nuôi, CSFV lây truyền theo chiều dọc từ mầm bệnh phôi (Van Oirschot, 1992) Lây truyền theo chiều dọc thường dẫn đến chết non, heo sinh bị bệnh, heo mẹ mang bệnh ( carrier sows) thường sinh heo bị nhiễm bệnh (Van Oirschot, 1992; Van Oirschot and Terpstra, 1977) Những heo bị nhiễm bệnh thải lượng lớn virus, triệu chứng lâm sàng xuất sau vài tháng Do , chúng bị lây nhiễm suốt đời sống không dễ để phát (Van Oirschot,1992) Cho nên, việc chuẩn đoán sớm để lập vùng để có áp dụng biện pháp dập dịch Ngay phương pháp chuẩn đoán xây dựng, việc cần thực ngăn chặn loại vaccin chương trình tiêm phòng chắn, loại thải sớm heo mắc bệnh Và chưa có loại vaccine bất hoạt có hiệu việc bảo hộ heo chống lại virus dịch tả Mặc dù vaccine nhược độc an toàn có hiệu chống lại dịch tả heo nhược điểm phân biệt heo chủng vaccine nhược độc heo bị nhiễm virus thực địa Cộng đồng châu Âu nỗ lực tìm vaccin phòng bệnh chọn heo bị nhiễm với hy vọng dập tắc dịch Tuy nhiên, điều thực lý phân biệt heo nhiễm từ vaccin Do đó, vaccin cấm sử dụng cuối năm 1990 trước thị trường chung nội địa châu Âu thiết lập, cho phép buôn bán sản phẩm từ heo kháng thể kháng CSFV Những qui định khắc khe ảnh hưởng việc buôn bán sản phẩm từ heo quốc gia có sử dụng vaccin Cho nên , nước châu Âu cố gắng tìm loại vaccin với đặc tính có khả phân biệt heo nhiễm CSFV vaccin hay tự nhiên (DIVA), đồng thời phát triển phương pháp chuẩn đoán để phát sớm heo bị nhiễm CSFV Những ứng dụng tái tổ hợp cho phép cho phép tạo loại vaccin tái tổ hợp đáp ứng yêu cầu trên, với hai test để phát Protein tái tổ hợp virus dịch tả heo virus Bayer’s Bayovac® CSF với Ceditest Erns ELISA ( Đức) Intervet’s Porcilis® Pesti với Chekit CSF Erns ELISA ( Hà Lan) A Virus dịch tả heo_pestis suum I Vài nét bệnh dịch tả heo Bệnh dịch tả lợn lần ghi nhận Mỹ vào năm 1833 đến 1855 bệnh lây lan toàn nước Mỹ Sau bệnh lan nước châu Mỹ, lan châu Âu châu Á, châu Phi châu Úc Ở nước ta bệnh DTLCĐ phát lần vào năm 1923-1924 Dịch phát nặng miền Bắc vào năm 1959 Từ 1975 đến năm 1979 dịch có phần lắng dịu Nhưng đến năm 1980 dịch lại phát 13 tỉnh biên giới( Vũ Đình Tiến, 1980) Nguồn bệnh chủ yếu lợn bệnh, lợn mang trùng Đặc biệt nguy hiểm lợn bệnh biểu triệu chứng lâm sàng, lợn bệnh lưu niên Những nguồn lợn bệnh gieo rắc mầm bệnh qua phân, nước tiểu dịch mũi, nhiễm vào thức ăn, nước, đất, dụng cụ chăn nuôi, phương tiện vận chuyển v.v… Các công trình nghiên cứu cho thấy, virus không thay đổi đặc tính qua tiếp đời liên tiếp, tác động mạnh yếu khác tùy ổ dịch (Jactot, 1939) Giống lợn lang miền Nam Trung Bộ có tính cảm thụ cao với virus Tiêm 1/500 ml máu bệnh cho lợn gây chết 100% Giống lợn cảm thụ với giống bệnh dịch tả lợn nơi khác giống virus Angeri, virus Bắc Bộ Trung Bộ Qua kết nghiên cứu tính gây bệnh tính kháng nguyên chủng phân lập Hà Nội, Hà Tây Nghệ An tác giả Trần Minh Châu(1970) chủng truyền đời qua lợn có đặc điểm không giống Chủng Nghệ An gây bện cho lợn thể thứ cấp điển hình, chủng Hà Tây gây bệnh bệnh tích không điển hình Tất chủng giết lợn, chủng có độc lực mạnh chủng Nghệ An với log LD50 10,5 Các chủng có tính kháng nguyên chung với chủng nhược độ vacxin (chủng nhược độc III54) Lợn tiêm phòng vacxin bảo hộ 100% công chủng cường độc phân lập nói Nguyên nhân làm dịch lan rộng loại lợn giống chuyển từ nơi có ổ dịch sang nơi mới, vùng có tập quán nuôi nái, loại thải lợn bệnh không triệt để, virus có điều kiện tồn tại, nơi lợn chưa tiêm phòng tiêm phòng chưa triệt để Theo Lê Độ(1981) dịch thường xảy vào vụ đông xuân, qua tổng kết 10 năm(1966-1980) khoảng 60% ổ dịch phát tháng 1, 2, Cao tháng 2(khoảng 30%), tháng khác năm có dịch Theo Trịnh Văn Thịnh(1982) Lợn lứa tuổi mắc bệnh, nặng lợn theo mẹ, lợn sau cai sữa Protein tái tổ hợp virus dịch tả heo II Đặc điểm virus dịch tả heo ( CSFV) Phân loại: chi Pestivirus Họ Flaviridae Hình thái: Virus dịch tả heo thuộc ARN virus, chuỗi đơn ARN ( dài 12.3kp) Vỏ bọc lipoprotein Đường kính 29nm Dưới kính hiển vi điện tử virus có cấu tạo hình cầu với nucleocapside đối xứng, khối bao bọc bỡi màng ( envelop) Virion có đường kính 40- 50nm Cấu trúc gen Các virus CSF Cấu trúc virus dịch tả heo Nguồn : http://www.thepigsite.com/pighealth/ article/447/classical-swine-fevercsf- hog-cholera-hc Bộ gen hoàn chỉnh chủng virus dịch tả heo giải mã thập niên qua, RNA virus mã hoá protein cấu trúc C, Erns, E1 E2 protein không cấu trúc Npro, p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A NS5B, chứa khung đọc mở nằm bên sườn 5’-UTR 3’-UTR mã hoá polyprotein lớn với khoảng 3900 amino acid Polyprotein cắt protease mã hoá virus tế bào vật chủ để tạo nên protein trưởng thành virus Trình tự sản phẩm gen dọc theo khung đọc mở là: NH2-(Npro-C-Erns-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B)- Protein tái tổ hợp virus dịch tả heo Cấu trúc gen Pestivirus (Brett D L., 2007) Một polyprotein lớn dịch mã từ RNA virus xử lý thành protein virus riêng biệt Protein mã hoá Npro protein không cấu trúc có nhiệm vụ phân cắt vị trí Npro/C Peptidase ký chủ phân cắt vị trí C/Erns, E1/E2, E2/p7 p7/NS2 với phân cắt không hoàn toàn vị trí E2/p7 NS2-3 phân cắt autoprotease NS2 Sự phân cắt polyprotein hình thành NS4A, NS4B, NS5A NS5B thuỷ phân enzyme protease serine NS3-4A ❖ Npro autoprotease không cấu trúc có hoạt tính thuỷ phân protein Npro không cần thiết chép virus Npro hoạt động chất đối kháng hoạt hoá IRF-3 sản xuất IFN, ức chế phiên mã IRF-3 tế bào nhiễm virus DTH Những đột biến bỏ Npro virus DTH đề xuất dự tuyển vaccin virus sống ) Protein cấu trúc C (mã hoá protein p14): protein nucleocapsid Đầu cuối C (Cterminus) protein C virus DTH xác định định vị phần kỵ nước chuỗi peptide tín hiệu bên (internal signal peptide) khởi đầu di chuyển Erns vào khoang mạng lưới nội chất Erns (mã hoá protein gp44/48), E1(gp33), E2(gp55): protein vỏ E2 Erns có tính kháng nguyên mạnh Erns có tác dụng hỗ trợ thải virus qua màng đặc biệt, tiết từ tế bào nhiễm, đặc điểm bật Erns hoạt tính ribonuclease với tính chuyên biệt gốc uridine Những kháng thể ức chế hoạt tính ribonuclease có khuynh hướng trung hoà tính nhiễm virus, đột biến Erns phá huỷ hoạt tính ribonuclease gây nên gia tăng số lượng virus Erns tái tổ hợp độc Protein tái tổ hợp virus dịch tả heo chất tế bào bạch huyết ống nghiệm, kết hợp với giảm bạch cầu nhiễm tự nhiên Mặc dù độc tính tế bào đặc điểm bật enzyme ribonuclease hoà tan khác người ta chưa rõ hoạt tính ribonuclease Erns có liên quan đến độc tính hay không Vùng đầu cuối C (C-terminal) Erns khởi động di chuyển qua màng tế bào, coi mục tiêu chức tế bào Tuy nhiên, Erns tái tổ hợp nối cách vững với bề mặt tế bào qua tương tác với glycosaminoglycan ức chế lây nhiễm E1 E2 protein màng thiếu E2 virus DTH tái tổ hợp kết hợp với tế bào ngăn chặn lây nhiễm virus DTH BVD Mặc dù vai trò quan trọng glycoprotein virus lắp rắp tiếp nhận kháng thể Erns E2 trung hoà tính lây nhiễm virus hai kháng nguyên tạo tính sinh miễn dịch bảo vệ Protein p7 theo sau protein cấu trúc, gồm vùng đảm đương nhiệm vụ trung tâm việc tách đầu cuối kỵ nước cần cho sản sinh virus lây nhiễm không đòi hỏi trình chép RNA P7 pestivirus phân cắt cách không hiệu từ E2 qua peptidase đặc biệt E2-p7 không phân cắt không cần thiết chép nuôi cấy tế bào hai E2-p7 p7 giúp tế bào kết hợp với Tuy nhiên, chưa biết rõ p7 protein cấu trúc hay không cấu trúc không phát virus tinh Pestivirus có p7 hình thành kênh ion tham gia lắp ráp tiếp nhận virus ) Protein không cấu trúc Protein NS2 enzyme thuỷ phân protein chứa cysteine nhận diện Sự phân cắt NS2-3 thiết yếu chép RNA pestivirus hiệu phân cắt NS2-3 điều chỉnh chaperone tế bào xác định tính gây bệnh tế bào Vùng NS2-3 tham gia lắp ráp virus NS3 chứa vùng protease serine đầu cuối N helicase RNA đầu cuối C Protease serine NS3 đòi hỏi NS4A yếu tố hỗ trợ Protease serine NS3-4A phân cắt leucine amino acid không phân cực nhỏ Hoạt tính protease serine ảnh hưởng đến chép RNA virus,đóng vai trò thiết yếu khả tồn virus NS4A hoạt động yếu tố hỗ trợ hoạt tính protease serine NS3 NS4A NS4B không đóng vai trò thiết yếu chép RNA virus NS5A NS5B diện dạng hai sản phẩm phân cắt hoàn toàn không khác NS5A-5B không phân cắt Chức NS5A chưa biết rõ Protein tái tổ hợp virus dịch tả heo NS5B mang đặc điểm enzyme polymerase RNA phụ thuộc RNA (RdRp RNA dependent RNA polymerase) Một số hình ảnh biểu bệnh Xuất huyết da đốm xuất huyết thận Xuất huyết màng bụng ruột Hoại tử amidam viêm loét ruột già có hình nút Gây liệt chân sau viêm kết mạc Protein tái tổ hợp virus dịch tả heo Protein tái tổ hợp Marker vaccin Công nghệ gen cho phép sản xuất nhiều loại protein tái tổ hợp ( recombinat- rprotein) số lượng lớn mà có chất lượng protein tốt Công nghệ DNA tái tổ hợp cho phép sản xuất lượng lớn protein virus dùng sản xuất vaccine chống lại virus Về mặt lý thuyết, gen mã hóa protein miễn dịch tạo dòng biểu tế bào nhận nấm men, vi khuẩn, động vật có vú kỹ thuật DNA tái tổ hợp Số lượng gen mã hóa bề mặt kháng nguyên tác nhân gây bệnh từ virus, vi khuẩn, động vật nguyên sinh tạo dòng thành công hệ thống biểu vi khuẩn, nấm men, côn trùng động vật có vú dùng để tạo vaccin So với loại vaccine bất hoạt trước không tạo hiệu lớn việc phòng bệnh dịch tả heo nhà nghiên cứu đề xuất sản xuất loại vaccine Sơ đồ chung sản xuất vaccin tái tổ hợp Gen mã hóa kháng nguyên tác nhân gây bệnh ( màu cam) chèn vào vector plasmid (màu hồng) tạo thành plasmid tái tổ hợp Chuyển plasmid tái tổ hợp với virus gây bệnh ủ vào môi trường nuôi cấy tế bào : Protein tái tổ hợp virus dịch tả heo Heo bị nhiễm CSFV tạo kháng thể chống lại protein cấu trúc vỏ Erns, E2 protein không cấu trúc NS3 Erns, E2 kháng nguyên kháng thể trung hòa kháng nguyên đặc trưng CSFV Dựa đáp ứng mặt huyết học heo bị nhiễm CSFV Một số nghiên cứu phát triển vaccine cho phép phân biệt heo chủng ngừa vaccine heo bị nhiễm virus thực địa Vaccine gọi vaccine đánh dấu (Marker vaccine hay DIVA vaccine) Nguyên tắc vaccine đánh dấu: Phân biệt thú tiêm veccine với thú nhiễm bệnh thông qua vắng mặt hay nhiều protein mà bình thường tồn chủng hoang dại (thực địa) Sử dụng kỹ thuật xét nghiệm đồng hành phát kháng thể chống lại protein thiếu chủng vaccine phát thú nhiễm bệnh đàn thú chủng ngừa vaccine Việc nhiễm bệnh từ kiểm soát Ưu điểm vaccine đánh dấu: Có thể tiến hành điều tra dịch tễ tình hình nhiễm bệnh đàn thú tiêm vaccine • Không ảnh hưởng đến việc chẩn đoán huyết học quy mô toàn đàn hay cá thể • Có thể đánh giá hiệu vaccine điều kiện thực tế • Có thể sử dụng mà không ảnh hưởng đến việc mua bán động vật Hướng áp dụng sản xuất vaccine đánh dấu: ❖ Vaccine tiểu phần (Subunit vaccine) Những tế bào nhân thật tế bào nấm men tế bào côn trùng (Spodoptera frugiperda) thường sử dụng làm hệ thống biểu Các hệ thống biểu làm nhiệm vụ tổng hợp nên protein virus quy định gen chèn vào (dòng hóa-cloning) Protein virus ( protein tái tổ hợp) sau tinh kỹ thuật sắc ký lọc để tạo vaccine Đoạn gen E2 từ gen CFCV cắt chèn vào plasmid tế bào côn trùng Sau nhân lên sản xuât kháng nguyên Protein tái tổ hợp virus dịch tả heo Baculovirus độc số virus có nhiều ứng dụng lĩnh vực công nghệ sinh học: virus chuyên biệt cho tế bào côn trùng không dùng cho mục đích quản lý vấn đề côn trùng gây hại, mà công cụ nghiên cứu phòng thí nghiệm cho sản xuất protein tái tổ hợp thể protein, vector tiềm cho liệu pháp gen người Baculovirus virus sợi đôi DNA xâm nhiễm loài côn trùng khác vật chủ tự nhiên Người ta nhận thấy baculovirus không xâm nhiễm động vật có xương sống (Carbonell et al 1985, Carbonell & Miller 1987), phương pháp an toàn để sản xuất protein DNA baculovirus dùng hầu hết hệ thống vector biểu baculovirus DNA virus polyhedrosis Autographa californica (nuclear polyhedrosis virus - AcNPV) Tế bào côn trùng thường dùng nhiều mà nhạy với xâm nhiễm AcNPV dòng tế bào Sf9 Sf21 Cả dòng tế bào thiết lập ban đầu từ mô buồng trứng ấu trùng Spodoptera frugiperda Những dòng tế bào phát triển thể huyền phù dùng bioreactor Đoạn DNA lạ chuyển đồng thời với DNA virus AcNPV mạch thẳng vào tế bào côn trùng Việc cho phép tái tổ hợp vị trí tương đồng, chuyển gen lạ vào DNA AcNPV Protein tái tổ hợp mong muốn sản xuất, thu nhận tinh Qui trình sản xuất vaccin tái tổ hợp dựa vào Spodoptera frugiperda ( theo William Sohn, 12/2008, viện ứng dụng khoa học công nghệ Hàn quốc) Bước 1: Tái tổ hợp kháng nguyên đoạn gen E2 CFSV với vector Baculovirus vào tế bào côn trùng Spodoptera frgiperda tiến hành lên men Tế bào côn trùng tăng sinh khối protein E2 tăng lên Bước 2: Gây nhiễm với với vector Baculovirus tái tổ hợp mục đích tạo vaccin tái tổ hợp CFSV Bước 3: Tiến hành phá vỡ tế bào thu nhận vaccin tái tổ hợp tinh Giai đoạn tiến hành xử lý tế bào với β-propiolactone Sau tinh phương pháp sắc ký lọc Cuối trình bổ sung chất bổ trợ , xác định công thức nhũ tương với nước dầu (formulation as an oil-inwater emulsion) hợp chất dầu paraffin với mycobacteria làm chết, có tác dụng tá dược đóng vai trò việc làm tăng khả đáp ứng miễn dịch với kháng nguyên Khi heo miễn dịch với vaccin, chúng tạo kháng thể chống lại E2, không tạo kháng thể chống lại protein miễn dịch khác Erns Do vậy, test huyết dùng để phân biệt nhiễm từ vacccin E2 10 Protein tái tổ hợp virus dịch tả heo dựa phát đặc biệt kháng thể Erns (Moormann et al., 1996; de Smit et al., 2000; Floegel-Niesmann, 2001) Cho nên, kết dương tính sớm kết luận có mắc CSFV, kết âm tính chưa hẳn khác chưa đáp ứng miễn dịch Do vaccine tiểu phần chứa hay vài protein riêng biệt tinh bán tinh nên chúng có ưu điểm sau: • Độ an toàn cao • Có thể phối hợp nhiều loại vaccine tương ứng với yếu tố kháng nguyên khác phòng nhiều bệnh khác nhau, giảm chi phí phân phối, tăng hiệu kinh tế • Tính hướng đến tế bào đích cao • Cho phép phân biệt thú tiêm vaccine thú nhiễm bệnh tự nhiên Vào năm 2001, hai vaccine đánh dấu sử dụng rộng rãi EU để phòng bệnh dịch tả heo, là: Bayer’s Bayovac ® CSF với Ceditest Erns ELISA ( Đức) Intervet’s Porcilis ® Pesti với Chekit CSF Erns ELISA ( Hà Lan) Cả hai loại vaccin chứa protein E2 virus test ELISA kháng thể kháng protein Erns chủng thực địa (Hulst et al., 1993; Moormann et al., 2000) Trong nước châu ÂU Porcilis ® Pesti sử dụng công nhận hiệu Porcilis ® Pesti chứa kháng nguyên E2, dạng nhũ tương dùng để tiêm Porcilis ® Pesti thường dùng tiêm vào heo tuần Porcilis® Pesti tuổi nhằm ngăn ngừa chết bị bệnh CFS dùng để khử thải virus vào môi trường Liều lượng tiêm: tiêm liêu thứ 2ml vào phía sau tai Liều thứ hai tiêm sau tuần, tiêm lặp lại sau tháng tác dụng vaccin sau tuần khoảng thời gian tháng ( theo European Medicines Agency Veterinary Medicines MEA/V/C/046) Đánh giá hiệu vaccin E2 E2, protein cấu trúc chính, tạo kháng thể trung hòa bảo vệ miễn dịch heo tiêm (Wensvoort, 1989; Van Zijl et al., 1991; Hulst et al., 1993; Rumenapf et al., 1991; van Rijn et al., 1996, 1999) Các vaccin đánh dấu CSFV phát triển dùng E2 tái tổ hợp bọc protein (Van Zijl et al., 1991; Hooft van Iddkinge et al., 1996; Hulst, et al., 1993; Lutticken et al., 1998; Van Rijn et al., 1996, 1999) Nhưng vaccin tiểu phần E2 hiệu vaccin truyền thống thú nuôi thử nghiệm ngắn sau tiêm Không có bảo hộ chống lại bệnh quan sát sớm 15 ngày ( tuần) bảo hộ 11 Protein tái tổ hợp virus dịch tả heo chống lại lây nhiễm có tiêm đến tuần thứ (Bouma et al., 2000; Utenthal et al., 2001) Sự không thành công dẫn tới miễn dịch bảo vệ đặc hiệu nhanh không sử dụng vaccin tiểu phần để có biện pháp kiểm soát khẩn cấp suốt thời kỳ phát triển CSFV Thêm vào đó, test chuẩn đoán huyết cho vaccin đánh dấu tiểu phần E2 dựa kháng thể Erns có độ đặc hiệu độ nhạy Những kết công bố bỡi nhà khoa học ARS Plum Island Animal Disease Center (Risatti et al, 2005c) vaccin đánh dấu E2 CSFV test tốt sử dụng điều kiện ngắn hạn Bên cạnh có loại vaccine đánh dấu khác: vaccine virus lai Các loại vaccine dịch tả heo thông thường sử dụng virus Trung Quốc “chủng C” làm yếu tố kháng nguyên Kháng thể tạo thành thể thú không phân biệt thú chủng ngừa vaccine thú bị nhiễm bệnh thực địa Công nghệ di truyền cho phép tạo nên dòng virus lai (chimera) mang gen virus “chủng C” virus chủng “ Brescia” Gen quy định glycoprotein E2 virus “chủng C” thay glycoprotein E2 virus chủng “Brescia” Sự thay gen cho phép phân biệt kháng thể tạo thành virus vaccine với virus “chủng C” virus chủng “Brescia” nhờ vào kháng thể đơn dòng chuyên biệt cho chủng virus: “chủng C” chủng “Brescia” E KẾT LUẬN Dịch tả heo (Classical swine fever - CSF) dịch bệnh gây tổn thất kinh tế lớn người chăn nuôi giới Có nhiều nghiên cứu tính gây độc trình chép virus CSFV thực để làm sở đưa biện pháp phòng trừ; nhiên nhiều vấn đề chưa giải thích cụ thể thực chưa có biện pháp hoàn hảo Do CSFV chưa có thuốc đặc trị nên vaccin phương pháp phòng trừ có hiệu Vaccin đánh dấu – vaccine DIVA tạo dựa glycoprotein E2 biểu nhờ hệ thống baculovirus – tế bào côn trùng đưa thị trường ưu điểm lớn vaccin tính an toàn cao, phân biệt heo nhiễm vaccin hay tự nhiên có khả sản xuất với qui mô lớn giá thành không cao so với loại vaccin khác nhờ phương pháp lên men Tuy nhiên vaccin có tác dụng thời gian sau tuần tiêm hiệu dừng lại khoảng thời gian tháng điều cần thiết sử dụng loại vaccin vào trường hợp gây miễn dịch với CSFV khoảng thời gian ngắn Để hướng tới giải bệnh dịch tả heo hoàn thiện tác dụng vaccin tái tổ hợp cần nghiên cứu kỹ hiệu loại vaccin với nhiều hướng triển vọng hơn, chủ yếu dựa xây dựng kỹ thuật di truyền, như: (1) 12 Protein tái tổ hợp virus dịch tả heo peptide CSFV có tính kháng nguyên; (2) Vaccine DNA; (3) Protein CSFV biểu nhờ virus chuyển gen; (4) Pestivirus lai (chimeric) (5) genome CSFV cắt bỏ gen (VRP) TÀI LIỆU THAM KHẢO 1Công nghệ sinh học thú y Nguyễn Ngọc Hải NXB Nông nghiệp TP Hồ Chí Minh, 2007 2Bốn bệnh đỏ lợn biện pháp phòng trị Phan Thanh Phượng, Trần Thị Hạnh, Phạm Công Hoạt NXB Nông Nghiệp Hà Nội, 2002 3Bài giảng dịch tả heo TS Nguyễn Ngọc Hải 4Kuby immunology/ chapter 18 vaccines ( sách điện tử) 5APPENDIX 4: National Veterinary Stockpile Countermeasures Working Group Report Classical Swine Fever_ The Classical Swine Fever Countermeasures Working Group, Hannover, Germany April 17, 2008 6Evaluation of the epidemiological importance of classical swine fever infected, E2 sub-unit marker vaccinated animals with RT-nPCR positive blood samples_ Dewulf1,F Koenen , S.Ribbens,A Haegeman, H Laevens and A De Kruif1 7Chapter Towards better control of classical swine fever epidemics: vaccination with an E2 marker vaccine_D Klinkenberg, M.C.M de Jong 8http://www.emea.europa.eu 9http://www.thepigsite.com/pighealth/article/447/classical-swinefever-csf- hog-cholera-hc 13 Protein tái tổ hợp virus dịch tả heo MỤC LỤC A Đặc vấn đề B Virus dịch tả heo I vài nét bệnh dịch tả heo II đặc điểm virus dịch tả heo ( CSFV) phân loại Hình thái Cấu trúc gen III Một số hình ảnh biểu bệnh C Protein tái tổ hợp Marker vaccine Vaccine tiểu phần (Subunit vaccine) 10 D 13 Kết luận Tài liệu tham khảo 14 [...]... phòng bệnh dịch tả heo cho nên các nhà nghiên cứu đã đề xuất sản xuất một loại vaccine mới Sơ đồ chung trong sản xuất vaccin tái tổ hợp Gen mã hóa kháng nguyên của tác nhân gây bệnh ( màu cam) được chèn vào vector plasmid (màu hồng) và tạo thành plasmid tái tổ hợp Chuyển plasmid tái tổ hợp cùng với virus gây bệnh ủ vào trong môi trường nuôi cấy tế bào : 8 Protein tái tổ hợp và virus dịch tả heo Heo bị... nhiệm vụ tổng hợp nên các protein virus được quy định bởi gen được chèn vào (dòng hóa-cloning) Protein virus ( protein tái tổ hợp) sau đó sẽ được tinh sạch bằng các kỹ thuật sắc ký và lọc để tạo vaccine Đoạn gen E2 từ bộ gen của CFCV được cắt ra và chèn vào plasmid tế bào côn trùng Sau đó nhân lên sản xuât ra kháng nguyên 9 Protein tái tổ hợp và virus dịch tả heo Baculovirus là độc nhất trong số virus. .. 9http://www.thepigsite.com/pighealth/article/447/classical-swinefever-csf- hog-cholera-hc 13 Protein tái tổ hợp và virus dịch tả heo MỤC LỤC A Đặc vấn đề 3 B Virus dịch tả heo 4 I vài nét về bệnh dịch tả heo 4 II đặc điểm virus dịch tả heo ( CSFV) 5 1 phân loại 5 2 Hình thái 5 3 Cấu trúc bộ gen 5 III Một số hình ảnh biểu hiện bệnh 8 C Protein tái tổ hợp Marker vaccine 9 Vaccine... vào trường hợp gây miễn dịch với CSFV trong khoảng thời gian ngắn Để hướng tới giải quyết bệnh dịch tả heo thì ngoài hoàn thiện tác dụng của vaccin tái tổ hợp và cũng cần nghiên cứu kỹ hiệu quả các loại vaccin mới với nhiều hướng triển vọng hơn, chủ yếu dựa trên xây dựng kỹ thuật di truyền, như: (1) 12 Protein tái tổ hợp và virus dịch tả heo peptide CSFV có tính kháng nguyên; (2) Vaccine DNA; (3) Protein. .. học và công nghệ Hàn quốc) Bước 1: Tái tổ hợp kháng nguyên là đoạn gen E2 của CFSV với vector là Baculovirus vào trong tế bào côn trùng Spodoptera frgiperda rồi tiến hành lên men Tế bào côn trùng tăng sinh khối và protein E2 cũng tăng lên Bước 2: Gây nhiễm với với vector Baculovirus tái tổ hợp mục đích là tạo ra vaccin tái tổ hợp CFSV Bước 3: Tiến hành phá vỡ tế bào thu nhận vaccin tái tổ hợp và tinh... triển trong thể huyền phù và do đó có thể dùng trong bioreactor Đoạn DNA lạ được chuyển đồng thời với DNA virus AcNPV mạch thẳng vào trong tế bào côn trùng Việc này cho phép tái tổ hợp giữa các vị trí tương đồng, chuyển gen lạ vào DNA AcNPV Protein tái tổ hợp mong muốn có thể được sản xuất, thu nhận và tinh sạch Qui trình sản xuất vaccin tái tổ hợp dựa vào Spodoptera frugiperda ( theo William Sohn, 12/2008,... vaccine và thú bị nhiễm bệnh thực địa Công nghệ di truyền đã cho phép tạo nên một dòng virus lai (chimera) mang gen của virus “chủng C” và virus chủng “ Brescia” Gen quy định glycoprotein E2 của virus “chủng C” được thay thế bằng glycoprotein E2 của virus chủng “Brescia” Sự thay thế gen cho phép phân biệt kháng thể tạo thành do virus vaccine với virus “chủng C” và virus chủng “Brescia” nhờ vào các... các con heo miễn dịch với vaccin, chúng sẽ tạo ra duy nhất kháng thể chống lại E2, nhưng không tạo ra kháng thể chống lại một trong protein miễn dịch khác là Erns Do vậy, các test huyết thanh dùng để phân biệt nhiễm từ vacccin E2 là 10 Protein tái tổ hợp và virus dịch tả heo dựa trên sự phát hiện đặc biệt trên kháng thể Erns (Moormann et al., 1996; de Smit et al., 2000; Floegel-Niesmann, 2001) Cho nên,... những virus chuyên biệt cho tế bào côn trùng này không chỉ dùng cho mục đích quản lý vấn đề côn trùng gây hại, mà nó còn là công cụ nghiên cứu phòng thí nghiệm cho sản xuất protein tái tổ hợp và thể hiện protein, cũng như là vector tiềm năng cho các liệu pháp gen trên người Baculovirus là virus sợi đôi DNA xâm nhiễm các loài côn trùng khác nhau như vật chủ tự nhiên của nó Người ta nhận thấy baculovirus... chủng virus: “chủng C” và chủng “Brescia” E KẾT LUẬN Dịch tả heo (Classical swine fever - CSF) là một trong những dịch bệnh gây tổn thất kinh tế rất lớn đối với người chăn nuôi trên thế giới Có rất nhiều nghiên cứu về tính gây độc và quá trình sao chép của virus CSFV được thực hiện để làm cơ sở đưa ra các biện pháp phòng trừ; tuy nhiên hiện nay vẫn còn nhiều vấn đề chưa được giải thích cụ thể và cũng ... hog-cholera-hc 13 Protein tái tổ hợp virus dịch tả heo MỤC LỤC A Đặc vấn đề B Virus dịch tả heo I vài nét bệnh dịch tả heo II đặc điểm virus dịch tả heo ( CSFV) ... nặng lợn theo mẹ, lợn sau cai sữa Protein tái tổ hợp virus dịch tả heo II Đặc điểm virus dịch tả heo ( CSFV) Phân loại: chi Pestivirus Họ Flaviridae Hình thái: Virus dịch tả heo thuộc ARN virus, ... thành plasmid tái tổ hợp Chuyển plasmid tái tổ hợp với virus gây bệnh ủ vào môi trường nuôi cấy tế bào : Protein tái tổ hợp virus dịch tả heo Heo bị nhiễm CSFV tạo kháng thể chống lại protein cấu