Sử dụng phương pháp vật lý để khống chế vi sinh vật Sử dụng phương pháp vật lý để khống chế vi sinh vật Bởi: Nguyễn Lân Dũng SỬ DỤNG CÁC PHƯƠNG PHÁP VẬT LÝ ĐỂ KHỐNG CHẾ VI SINH VẬT Tăng nhiệt việc dùng phương pháp vật lý khác thường dùng để diệt khuẩn Các phòng thí nghiệm vi sinh vật dùng nồi hấp áp suất cao (autoclave) để diệt khuẩn Tăng nhiệt, qua lọc, chiếu tia tử ngoại, dùng xạ điện ly phương pháp vật lý thường sử dụng Tăng nhiệt Người Cổ Hy Lạp biết dùng lửa hay đun nước sôi để diệt khuẩn hay tiêu độc Tăng nhiệt đến phương pháp thường dùng để diệt khuẩn Chủ yếu có phương pháp dùng sức nóng ẩm sức nóng khô Sức nóng ẩm dễ dàng gây chết virus, vi khuẩn nấm (bảng 15.2) Trong nước sôi sau 10 phút làm chết tế bào dinh dưỡng bào tử vi sinh vật có nhân thực Nhưng nhiệt độ sôi (100°C) không đủ sức làm chết nội bào tử vi khuẩn Bào tử vi khuẩn tồn vài nước sôi Do cách đun sôi dùng để đun nước uống để tiêu độc vật phẩm không bị phá hủy nước sôi, dùng để diệt khuẩn Bảng 15.2: Điều kiện ước chừng để diệt khuẩn sức nóng ẩm Vi sinh vật Tế bào dinh dưỡng Bào tử Nấm men min., 50-60°C min., 70-80°C Nấm sợi 30 min., 62°C 30 min., 80°C 1/9 Sử dụng phương pháp vật lý để khống chế vi sinh vật Vi khuẩn 10 min., 60-70°C Virus 30 min., 60°C 2-trên 800 min., 100°C 0,5-12 min, 121°C (Theo sách Prescott, Harley Klein) Vì tăng nhiệt biện pháp quan trọng để khống chế vi sinh vật cần có tiêu chuẩn xác hiệu suất diệt khuẩn sức nóng (heat-killing efficiency) Trước dùng điểm gây chết nhiệt (thermal death point, TDP) Đó nhiệt độ thấp đủ để diệt hết vi sinh vật dịch huyền phù (suspention) sau 10 phút Nhưng vi sinh vật chết theo phương thức logarit, lý thuyết không tiêu diệt hoàn toàn vi sinh vật mẫu vật, tức phải kéo dài thời gian tăng nhiệt Vì có phương thức biểu thị xác tiếp nhận rộng rãi, Thời gian giảm thiểu thập phân (decimal reduction time, D) gọi Trị số D (D value) Trị số D thời gian cần thiết để diệt hết 90% vi sinh vật bào tử mẫu vật nhiệt độ định Trên đồ thị bán logarit (semilogarithmic plot) thấy rõ số lượng vi sinh vật biến đổi theo thời gian tăng nhiệt (hình 15.2) Trị số D thời gian cần thiết để số lượng vi sinh vật giảm 10 lần Trị số D liên quan đến tính đề kháng vi sinh vật nhiệt độ khác Từ trị số D mà tính trị số Z (Z value) Trị số Z nhiệt độ tăng lên đủ để làm giảm 1/10 trị số D Một cách biểu thị khác trị số F (F value) thời gian cần thiết (tính min.) đủ để diệt hết quần thể tế bào bào tử nhiệt độ định (thường 121°C) 2/9 Sử dụng phương pháp vật lý để khống chế vi sinh vật Hình 15.2: Tính toán trị số Z Căn vào trị số D nhiệt độ khác để tính trị số Z Trị số Z dùng để tính toán mối quan hệ nhiệt độ thời gian sống sót vi sinh vật Trị số Z số nhiệt độ tăng đủ để làm giảm 10% trị số D Trong đồ thị trị số Z 10,50C Trị số D biểu thị thang logarit (Theo sách Prescott, Harley Klein) Trị số D trị số Z ứng dụng rộng rãi trông công nghiệp chế biến thực phẩm Khi sản xuất đồ hộp cần xử lý nhiệt sau đưa thực phẩm vào hộp hàn hộp lại Cần xử lý nhiệt để đủ mức diệt vi khuẩn gây ngộ độc thịt Clostridium botulinum Vi khuẩn gây độc tố botulism nguy hiểm Xử lý nhiệt độ đủ dài để làm cho số lượng bào tử vi khuẩn có từ 1012 giảm xuống bào tử (10°) Trị số D bào tử vi khuẩn 121°C 0,204 min., để tiêu diệt 1012 bào tử xuống bào tử cần 12D hay 2,5 phút Trị số Z Clostridium botulinum 10°C - tức tăng 10°C giảm 10 lần trị số D Nếu diệt khuẩn 111°C trị số D phải tăng 10 lần, tức 2,04 phút trị số 12D tăng lên đến 24,5 phút Bảng 15.3 nêu lên trị số D trị số Z số vi khuẩn thường gặp thực phẩm Bảng 15.3: Trị số D trị số Z số vi khuẩn gây bệnh gặp thực phẩm 3/9 Sử dụng phương pháp vật lý để khống chế vi sinh vật Vi sinh vật Cơ chất D( ° C),phút Z(° C) Clostridium botul inum Đệm phosphat D121=0,204 10 Cl.perfringens (chủng kháng nhiệt) MT nuôi cấy D90=3-5 6-8 Salmonella Sản phẩm gà D60=0,39-0,40 4,9-5,1 Sản phẩm gà SP Staphylococcus gà tâyDung dịch aureus NạCl 0,5% D60=5,17-5,37D60=15,4 D60=2,0-2,5 5,2-5,8 6,85,6 (Theo sách Prescott,Harley Klein) Có số liệu tụ cầu vàng (S.aureus), cho thấy tốc độ làm chết vi khuẩn thay đổi phụ thuộc vào môi trường hiệu bảo vệ chất hữu Với sức nóng ẩm phải cần nhiệt độ cao 100°C diệt nội bào tử (endospores) vi khuẩn, cần có áp suất cao điều kiện bão hòa hới nước Thiết bị diệt khuẩn thường dùng gọi autoclave (hình 15.3) Hình 15.3: Hai loại autoclave nhỏ lớn 4/9 Sử dụng phương pháp vật lý để khống chế vi sinh vật Về autoclave tương tự nồi hầm chịu áp lực thường dùng gia đình Tùy yêu cầu mà có dùng lửa, có dùng điện, có dùng nước chuyển vào, có nhỏ, có vừa, có lớn lớn Autoclave nhà khoa học Chamberland phát minh vào năm 1884 phát minh thúc đẩy phát triển Vi sinh vật học Autoclave phải có van để đẩy hết không khí nồi có nước bão hòa Có thể đóng van từ đầu đợi áp lực nâng lên mở van để loại hết không khí Cũng mở van từ đầu, thấy hới nước bay nhiều đóng van lại Thường diệt khuẩn 121°C (áp suất 15 pounds) 15 phút Có thể diệt hết tế bào vi sinh vật bào tử Diệt khuẩn sức nóng ẩm thông qua việc phá hủy acid nucleic, làm biến tính enzym protein khác, đồng thời phá vỡ màng tế bào mà làm chết vi sinh vật Diệt khuẩn sức nóng ẩm phải tiến hành triệt để có hiệu Khi chưa loại bỏ hết không khí áp suất 15 pounds nhiệt độ đạt đến 121°C Các vật cần xử lý không nên xếp chật cản trở việc tiếp xúc với nước nóng Lúc diệt khuẩn bình tích lớn phải giữ thời gian dài hơn, để làm cho toàn dịch thể phải đạt tới 121°C Chẳng hạn diệt khuẩn bình lít phải xử lý 70 phút Để khắc phục nhân tố nói người ta thường xếp kèm với sinh vật thị diệt khuẩn vật phẩm Khi dùng ống (ampule) chứa môi trường dinh dưỡng vô khuẩn có thêm mảnh giấy có tẩm bào tử vi khuẩn Bacillus stearothermophilus hay Clostridium sp PA3679 Diệt khuẩn xong phá vỡ ống điều kiện vô khuẩn nuôi cấy vài ngày Nếu sinh vật thi không sinh trưởng việc diệt khuẩn thành công Người ta thường xử lý nhiệt độ sôi sữa nhiều chất khác Phương pháp gọi phương pháp khử trùng Pasteur (Pasteurization) để kỷ niệm phát minh ông Vào thập kỷ 60 kỷ 19 rượu vang bị nhiễm khuẩn, gây khó khăn cho việc bảo quản vận chuyển, gây khó khăn cho việc sản xuất rượu vang Pháp Pasteur dùng kính hiển vi quan sát thấy rượu bị ô nhiễm có mặt vi khuẩn lên men lactic acetic Ông thấy xử lý nhiệt độ 55-60°C làm chết vi sinh vật bảo quản tương đối lâu dài rượu vang Năm 1886 hai nhà hóa học Đức V.H Soxhlet F.Soxhlet sử dụng kỹ thuật để bảo quản sữa làm giảm việc sữa lây truyền mầm bệnh Năm 1889 phương pháp tiêu độc Pasteur với sữa nhập vào Hoa Kỳ người ta dùng phương pháp để xử lý sữa, bia, nhiều loại bđồ uống khác Phương pháp tiêu độc Pasteur không đạt tới mục đích diệt khuẩn đủ làm chết vi khuẩn gây bệnh, giảm mạnh vi khuẩn không gây bệnh làm hư hỏng thực phẩm làm chậm rõ rệt tốc độ biến chất thực phẩm Có thể có hai phương pháp khử trùng sữa Phương pháp tương đối cổ xử lý 63 °C 30 phút Còn phương pháp thường sử dụng phương pháp khử trùng ngắn (flash Pasteurization), gọi phương pháp khử trùng ngắn nhiệt độ cao (high-temperature short-term, HTST), tức xử lý 72°C 15 giây, sau 5/9 Sử dụng phương pháp vật lý để khống chế vi sinh vật nhanh chóng làm lạnh Trong công nghiệp thực phẩm có lúc dùng phương pháp khử trùng siêu nhiệt (ultrrahigh temperature, UHT), tức xử lý sữa sản phẩm sữa nhiệt độ 140-150°C 1-3 giây Sữa xử lý siêu nhiệt không cần bảo quản lạnh, bảo quản hai tháng an toàn nhiệt độ phòng Các gói cà phê kem (coffee creamer) cung cấp khách sạn thường diệt khuẩn theo phương pháp Nhiều vật phẩm diệt khuẩn sức nóng khô (dry heat sterilization) Đưa vật phẩm vào tủ sấy giữ nhiệt độ 160-170°C 2-3 Vi sinh vật bị chết bị oxy hóa thành phần tế bào, làm biến tính protein Mặc dầu diệt khuẩn sức nóng khô hiệu cao sức nóng ẩm Bào tử vi khuẩn Clostridium botulinum bị chết 121°C sau phút dùng sức nóng ẩm bị chết 160°C sau Diệt khuẩn sức nóng khô có ưu riêng không làm ăn mòn vật liệu thủy tinh kim loại sức nóng ẩm, dùng để xử lý dạng bột, dầu chất tương tự Hầu hết phòng thí nghiệm xửn lý hộp Petri pipét sức nóng khô Không thích hợp sử dụng phương pháp để xử lý vật phẩm chất dẻo cao su Hình 15.4: Tủ sấy nhiệt độ khô Nhiệt độ thấp Nhiệt độ thấp sử dụng để ức chế sinh trưởng phát triển vi sinh vật Đây phương pháp quan trọng ngành vi sinh vật học thực phẩm Ở nhiệt độ -20°C hay thấp hơn, vật phẩm bị đông lạnh, vi sinh vật bị đình sinh trưởng Một số vi sinh vật bị chết tinh thể băng phá vỡ màng tế bào,.nhưng lạnh sâu không làm chết phần lớn vi sinh vật nhiễm vật phẩm Trên thực tế nhiều phòng thí nghiệm dùng tủ lạnh sâu -30°C hay -70°C để bảo quản vi sinh vật Vì thực phẩm đông lạnh chứa nhiều vi sinh vật, làm tan băng phải xử lý để tiêu thụ, tránh để tổn hại vi sinh vật gây bện phát triển Bảo quản lạnh giúp làm chậm sinh trưởng phát triển vi sinh vật, không đủ làm ngừng hẳn sinh trưởng Đáng mừng phần lớn vi sinh vật gây 6/9 Sử dụng phương pháp vật lý để khống chế vi sinh vật bệnh thuộc loại ưa ấm (mesophilic) không sinh trưởng nhiệt độ 4°C Các vật giữ lạnh bị hư hỏng vi khuẩn ưa lạnh (psychrophilic) chịu lạnh (psychrotrophic) có tồn nước, tủ lạnh dùng để bảo quản ngắn hạn thực phẩm vật phẩm khác Qua lọc Phương pháp qua lọc phương pháp tốt để giảm thấp quần thể vi sinh vật vật liệu mẫn cảm với nhiệt độ nhiều dùng để diệt khuẩn dung dịch Qua lọc đơn giản loại vi sinh vật khỏi dung dịch diệt khuẩn Có hai loại lọc vi sinh vật Thiết bị qua lọc tầng sâu (depth filter): loại thiết bị cấu tạo sợi hay vật chất dạng hạt, tạo thành lọc dầy với lỗ nhỏ Dưới sức hút chân không dung dịch lọc qua vi sinh vật bị giữ lại hay bị hấp phụ (adsorption) bề mặt lọc Nguyên liệu để làm lọc thường đất Tảo silic (dimatomaceous earth) - thiết bị lọc Berkefield Còn dùng loại sứ (unglazed porcelain) - thiết bị lọc Chamberlain Hoặc dùng thạch miên (asbestos) hay nguyên liệu khác Gần người ta dùng thiết bị màng lọc (membrane filters) thay cho thiết bị qua lọc tầng sâu Màng lọc hình tròn, dày khoảng 0,1mm chế tạo acetate cellulose, nitrate cellulose, polycarbonate, fluoride polyvinylidene hay chất tổng hợp khác Các màng lọc có lỗ với đường kính khoảng 0,2μm dùng để lọc bỏ phần lớn tế bào dinh dưỡng vi sinh vật, trừ virus Dịch lọc thường từ 1ml đến vài lít Màng lọc lắp cố định giá đặc biệt (hình 15.5) Dưới áp lực máy hút chân không dịch lọc chuyển sang bình vô khuẩn Loại thiết bị màng lọc dùng ngành dược, lọc thuốc đau mắt, chuẩn bị môi trường nuôi cấy, loại dầu, chất kháng sinh nhiều vật chất chịu nhiệt khác 7/9 Sử dụng phương pháp vật lý để khống chế vi sinh vật Hình 15.5: Thiết bị màng lọc Bình Erlenmeyer đựng dịch cần lọc Dịch lọc đẩy sang thiết bị màng lọc nhờ máy bơm Thiết bị màng lọc (với loại hình kích cỡ khác nhau) Phương pháp diệt khuẩn nhờ lọc dùng để lọc không khí Hai ví dụ thường gặp trang dùng ngoại khoa nút dùng cho ống nghiệm hay bình nuôi cấy vi sinh vật Không khí qua vi sinh vật bị giữ lại bên Phòng cấy Laminar thoáng khí an toàn sinh học (Laminar flow biological safety cabinet) sử dụng màng lọc không khí hạt hiệu lực cao HEPA (highefficiency particulate filter) Nó lọc đến 99,97% hạt có kích thước 0,3μm coi hệ thống lọc quan trọng Người nuôi cấy vi sinh vật thao tác thoải mái phòng cấy mở phần cửa an toàn nhờ có luồng không khí vô khuẩn thổi từ phía lại thoát qua màng lọc HEPA đặt phía Khi thao tác với vi sinh vật nguy hiểm vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis, virus gây ung thư, ADN tái tổ hợp thiết cần sử dụng phòng cấy Thiết bị dùng phòng thí nghiệm, công nghiệp, công nghiệp dược phẩm, để chuẩn bị môi trường, thao tác thí nghiệm, nuôi cấy mô… Hình 15.6: Phòng cấy Laminar 8/9 Sử dụng phương pháp vật lý để khống chế vi sinh vật Bức xạ (radiation) Bức xạ tử ngoại (Ultraviolet radiation-UV) với bước sóng 260nm có hiệu ứng diệt khuẩn mạnh, nhiên khả xuyên qua thủy tinh, màng bẩn, nước số chất khác Vì UV dùng để diệt khuẩn số trường hợp, ví dụ diệt khuẩn không khí tủ cấy, phòng nuôi cấy bền số vật thể UV có hại da mắt phải tắt đèn UV trước vào làm việc nơi có đèn UV dùng để diệt khuẩn nước, phải tầng nước mỏng qua đèn UV để đủ sức diệt mầm bệnh vi sinh vật khác Bức xạ ion hóa (ionizing radiation) hay xạ điện ly có sức xuyên mạnh dùng tốt để diệt khuẩn Nó diệt tế bào dinh dưỡng lẫn bào tử vi khuẩn, vi sinh vật nhân nguyên thủy (procaryotic) lẫn vi sinh vật có nhân thật (eucaryotic) Tia gamma từ nguồn cobalt 60 dùng để diệt khuẩn nguội chất kháng sinh, kích tố (hormones), khâu vết thương, vật liệu y học chất dẻo (plastic) ống tiêm Tia gamma diệt khuẩn tiêu độc (pasteurize) thịt thực phẩm khác Bức xạ ion hóa diệt vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm Escherichia coli O157:H7, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni Cả quan quản lý thực phẩm thuốc Hoa Kỳ (FDA) lẫn tổ chức Y tế giới (WHO) xác định tính an toàn việc chiếu xạ thực phẩm Đã có nhà máy chiếu xạ thương phẩm gần Tampa (bang Florida) Tiếc phương pháp chưa ứng dụng rộng rãi Hoa Kỳ, nguyên nhân giá cao nhiều người lo ngại ảnh hưởng bất lợi việc chiếu xạ lên thực phẩm Gần đây, Chính phủ Mỹ phê chuẩn việc chiếu xạ lên thịt gia cầm, thịt bò, thịt lợn, thịt bê, thịt cừu non, hoa quả, rau củ chất điều vị Việc chiếu xạ tương lai ngày ứng dụng rộng rãi 9/9 ... triển vi sinh vật, không đủ làm ngừng hẳn sinh trưởng Đáng mừng phần lớn vi sinh vật gây 6/9 Sử dụng phương pháp vật lý để khống chế vi sinh vật bệnh thuộc loại ưa ấm (mesophilic) không sinh trưởng... thấp sử dụng để ức chế sinh trưởng phát triển vi sinh vật Đây phương pháp quan trọng ngành vi sinh vật học thực phẩm Ở nhiệt độ -20°C hay thấp hơn, vật phẩm bị đông lạnh, vi sinh vật bị đình sinh. .. số D trị số Z số vi khuẩn thường gặp thực phẩm Bảng 15.3: Trị số D trị số Z số vi khuẩn gây bệnh gặp thực phẩm 3/9 Sử dụng phương pháp vật lý để khống chế vi sinh vật Vi sinh vật Cơ chất D( °