Phương pháp nghiên cứu sinh thái học vi sinh vật Phương pháp nghiên cứu sinh thái học vi sinh vật Bởi: Nguyễn Lân Dũng buivietha chungchithanh Những phương pháp nghiên cứu truyền thống Sinh thái học vi sinhvật khoa học nghiên cứu mối tác động qua lại vi sinhvật môi trường, quy luật chúng Do đặc điểm vi sinh vật phân tích vá quan sát tất cá vi sinh vật hệ sinh thái chúng, mà phải phân tích nghiên cứu có mục tiêu số lọai hình vi sinh vật đó, bao gồm nghiên cứu số lượng, đặc tính, chức Một số loài phải nuôi cấy khiết nghiên cứu Trong trình nghiên cứu quan sát thực tiễn lâu dài người ta tích lũy phương tiện kỹ thuật phương pháp nghiên cứu có hiệu quả, lấy mẫu, phân lập , nuôi cấy làm giàu, đếm trực tiếp (qua kính hiển vi), đếm khuẩn lạc (phương pháp CFU), đếm phương pháp giá trị xác suất cực đại (phương pháp MPN) Sau giới thiệu sơ lược phương tiện kỹ thuật phương pháp nói Lấy mẫu, nuôi cấy làm giàu phâp lập khiết Căn vào mục đích yêu cầu khác nhau, cách lấy mẫu khác Lấy mẫu đất bùn không yêu cầu thao tác vô trùng, số lượng vi sinh vật đất vốn lớn, ô nhiễm không khí dụng cụ lấy mẫu mang lại bỏ qua, phải ý vào phạm vi chiều sâu lấy mẫu Khi lấy mẫu nước vào độ nước, lấy mẫu trực tiếp cô lọc qua giấy lọc (yêu cầu vật dụng thao tác vô khuẩn) Khi lấy mẫu không khí cần lọc qua giấy lọc thao tác vô trùng Lấy mẫu thể sinh vật, thường cần phải lấy lượng mô định, rửa dung dịch vô khuẩn để thu gom vi sinh vật Mẫu lấy thường tiến hành phân tích giữ tủ lạnh Sau lấy mẫu phải đếm số lượng vi sinh vật nuôi cấy, phân lập Nuôi cấy làm giàu (hay nuôi cấy phong phú) nuôi cấy vi sinh vật môi trường chọn lọc, nhằm tăng sô lượng chúng mẫu để dễ phân lập Thường tiến hành 2-3 lần nuôi cấy làm giàu phân lập Thông thường dùng lọai môi trường đổ đĩa 1/7 Phương pháp nghiên cứu sinh thái học vi sinh vật Petri, lấy que gạt để gạt mặt thạch Tiếp theo, tách khuẩn lạc đứng riêng biệt cấy chuyền môi trường nhật định Sau 2-3 lần thu chủng khiết a- Phương pháp giá trị xác suất cực đại Để nghiên cứu kết cấu chức vi sinh vật hệ sinh thái vi sinh vật, cần phải xác định số lượng vi sinh vật Ngoài phương pháp đêm trực tiếp kính hiển vi, sử dụng phương pháp định giá trị xác suất cực đại (Most possible numberMPN, gọi phương pháp pha loãng) Pha loãng mẫu (thường phải làm tới độ pha loãng), cấy vào môi trường dịch thể, sau thời gian nuôi cấy, quan sát tình trạng sinh trưởng chúng độ pha lõang khác Căn vào số lương ống nghiêm có vi sinh vật sinh trưởng, dùng phương pháp thống kê để tìm số lượng vi sinh vật (tìm thống kê có sẵn) Phương pháp giá trị xác suất cực đại thường dùng ống nghiệm ống nghiệm đựng môi trường nuôi cấy Phương pháp dùng để định lượng tổng số vi khuẩn dị dưỡng hiếu khí, dị dưỡng kỵ khí, nitrate hóa phản nitrate hóa, vi khuẩn khử sulfate b- Phương pháp kiểm tra số lượng vi sinh vật sống Có thể đêm số lượng vi sinh vật sống thông qua việc xác định số khuẩn lạc xuất môi trường thạch đĩa Vì khuẩn lạc vài vi sinh vật đứng cạnh tạo thành, có khái niệm Đơn vị hình thành khuẩn lạc (colony forming units, CFU) Thao tác cụ thể phương pháp dùng nước sinh lý vô khuẩn pha lõang thành dãy độ pha loãng khác Lựa chọn ba độ pha loãng thích hợp để cấy giọt lên mặt thạch môi trường thích hợp đựng hộp Petri Gạt giọt dịch huyền phù que gạt thủy tinh đưa vào nuôi cấy nhiệt độ thích hợp Sau lấy đếm số khuẩn lạc đĩa Petri, nên chọn độ pha loãng cho số lượng khoảng 30-300 khuẩn lạc hộp Petri Phương pháp dùng để đếm số lượng vi sinh vật sông, có sống tạo thành khuẩn lạc Phương pháp thường dùng để xác định tổng số nấm men, nấm sợi, vi khuẩn, xạ khuẩn Khi tính số lượng vi sinh vật phải ý đến số lượng vi sinh vật không nuôi cấy được, mà đa số vi sinh vật thiên nhiên thực chưa cớ thể nuôi cấy phòng thí nghiệm (Pace, 1996) Số lượng vi sinh vật nuôi cấy chưa tới 1% tổng số vi sinh vật Đối với việc phân bố tính đa dạng vi sinh vật không nuôi cấy cần sử dụng phương pháp khác , bao gồm phương pháp sinh học phân tử 2/7 Phương pháp nghiên cứu sinh thái học vi sinh vật Các phương pháp sinh học phân tử dùng nghiên cứu sinh thái học vi sinh vật Các kỹ thuật sinh học phân tử đại ứng dụng nghiên cứu Sinh thái học nói chung Sinh thái học vi sinh vật nói riêng Các kỹ thuật giúp khắc phục khiếm khuyết phương pháp Sinh thái học vi sinh vật truyền thống, giúp trực tiếp khám phá cấu trúc quần thể Vi sinh vật thiên nhiên mối quan hệ chúng với môi trường Những kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng Sinh thái học vi sinh vật chủ yếu gồm kỹ thuật dò DNA (DNA probing), kỹ thuât nhân DNA đặc hiệu PCR (polymerase chain reaction), kỹ thuật phân tích RNA ribosom, phương pháp điện di gel gradient biến tính v.v…Ứng dụng kỹ thuật nói giúp thu thành quan trọng tạo đột phá nghiên cứu Sinh thái học vi sinh vật, làm cho số nghiên cứu vi sinh vật trở nên khả thi cho phép tìm hiểu vấn đề sinh thái mức độ phân tử a- Kỹ thuật lai DNA Kỹ thuật lai DNA cho phép xác định xác DNA vi sinh vật môi trường Kỹ thuật kết hợp với phương pháp xác định mật độ quang học dùng để trực tiếp để so sánh cường độ mẫu lai dương tính (băng điện di vết chấm lai), từ cho phép phát vi sinh vật có liên quan đánh giá mức độ biểu chức chúng Các mẫu dò dùng cho lai DNA dạng chuỗi nucleotide đánh dấu dùng trực tiếp để phát trình tự DNA quan tâm dung dịch, cố định màng, tế bào mô Mẫu dò dài (100-1000 cặp base), chuỗi ngắn (10-50 cặp base), liên kết bổ sung với trình tự DNA quan tâm Phương thức lai lai khuẩn lạc, lai in situ (lai nguyên vị hay lai chỗ) Người ta dùng phương pháp sinh học phân tử để thăm dò phân tích định lượng gen mã hoá enzyme khử thủy ngân quần thể Vi sinh vật nguồn nước bị ô nhiễm thủy ngân Lai vết chấm (dot blot) gen mã hóa enzyme phân hủy polyclorinad biphenyl (PCB) giúp xác định phân giải PCB quần thể vi sinh vật đất mức độ phân tử Có người dùng cách lai với khuẩn lạc để theo dõi quần thể vi sinh vật hồ cấy chủng Alcaligenes có khả phân giải clorophenol Người ta phát thấy xử lý clorophenol với nồng độ khác nhau, hoạt tính quần thể phân giải clorophenol tỷ lệ thuận với nồng độ clorophenol Hosein ứng dụng phương pháp lai mẫu dò gen trao đổi chất phân hủy để nghiên cứu, phân tích quần thể vi sinh vật thủy sinh phân hủy creosot, hydrocarbon dị vòng thơm đa vòng thơm Kết cho thấy, sau hóa, tổng số vi sinh vật nuôi cấy tăng gấp 100 lần, mà tổng số vi sinh vật chứa gen phân hủy tăng lần Hogan đồng ứng dụng phương pháp lai mẫu dò nucleotide nghiên cứu phân bố gen tfdA (gen mã hoá enzyme dioxydase bước phân hủy 2,4-D) vi sinh vật đất không phân hủy 2,4-D Kết cho thấy, gen nói 3/7 Phương pháp nghiên cứu sinh thái học vi sinh vật phân bố rộng rãi vi khuẩn đất Có thể gen có chức khác Guo cộng ứng dụng phương pháp lai DNA để nghiên cứu DNA chiết xuất từ vi khuẩn mẫu đất bị ô nhiễm dầu mỏ chưa bị ô nhiễm Kết cho thấy, tỷ lệ phát gen mã hóa enzyme phân hủy hydratcarbon DNA vi khuẩn lấy từ đất bị ô nhiễm rõ ràng cao so với từ mẫu không bị ô nhiễm Phân tích định lượng cho thấy, ô nhiễm nghiêm trọng, hàm lượng gen mã hóa enzyme phân hủy cao Vì dùng phương pháp để đánh giá mức độ ô nhiễm dầu mỏ đất Pollard, nhà nghiên cứu sinh thái học người Australia dùng phương pháp lai mẫu dò DNA để đo tốc độ sinh trưởng vi sinh vật xác định bùn hoạt tính Ông thêm tymin đánh dấu phóng xạ vào hệ thống xử lý bùn họat tính, khiến vi khuẩn phân bào bị đánh dấu phóng xạ Sau chiết xuất toàn DNA bùn họat tính Cuối lấy mẫu dò nucleotide chuyên biệt cố định màng lai, cho lai với toàn DNA bùn họat tính, vào cường độ phóng xạ để phân tích định lượng DNA vi khuẩn xác định Điều cho thấy dùng phương pháp nghiên cứu động học quần xã vi khuẩn bùn họat tính Đối với vi sinh vật kích thước quan sát kính hiển vi, kỹ thuật lai in situ giúp định lượng vi sinh vật môi trường cách hữu hiệu Kỹ thuật ứng dụng rộng rãi ngành Sinh học môi trường b- Kỹ thuật nhân đặc hiệu PCR Trong công tác kiểm tra môi trường thực địa, việc thăm dò vi sinh vật định gen quần thể phức tạp, phương pháp lai DNA trực tiếp không nhậy đoạn DNA quan tâm thường lẫn hỗn hợp dịch chiết xuất tế bào, với hàm lượng thấp Dùng kỹ thuật PCR nhân đoạn DNA quan tâm lên nhiều lần, lai mẫu dò để phát đoạn DNA đích nhân lên đó, qua nghiên cứu phân tích cấu trúc quần thể Vi sinh vật định tính định lượng Kỹ thuật PCR thường kết hợp sử dụng với kỹ thuật khác PT-PCR, PCR cạnh tranh, PCR dạng máng, RAPD, ARDRA v.v… Kỹ thuật PCR kết hợp với kỹ thuật cắt enzyme giới hạn để xác định tồn gen phân hủy naphthalen nah Ac bùn đáy tự nhiên Enzyme giới hạn dùng để cắt sản phẩm nhân PCR gen nah Ac, thông qua phân tích sản phẩm cắt để đánh giá tính đa dạng gen Erb cộng dùng phương pháp nhân PCR từ bùn đáy bị ô nhiễm PCB để chiết xuất gen bph C từ DNA tổng số, từ nghiên cứu sâu biểu gen bph trình phân hủy PCB Phân tích enzyme giới hạn sau chứng tỏ quần xã vi sinh vật phân hủy PCB bùn đáy có tính đa dạng sinh học cao Kết cho thấy số lượng gen bph C bùn đáy nước hồ chưa bị ô nhiễm PCB tương đối RAPD (randomly amplified polimorphic DNA) kỹ thuật ứng dụng rộng rãi RAPD dùng mồi (đoạn nucleotide) không đặc hiệu để nhân đọan gen 4/7 Phương pháp nghiên cứu sinh thái học vi sinh vật định Điện di đồ đặc trưng (finger-printing) phân tích RAPD nhóm gen hữu dụng so sánh thay đổi quần thể vi sinh vật quãng thời gian xác định thiết bị xử lý có quy mô vừa nhỏ, chưa đủ để dự đoán tính đa dạng sinh học quần thể Dùng phân tích RAPD để kiểm tra quần xã vi sinh vật môi trường sình lầy nhiều lầu cặn quy mô phòng thí nghiệm cho thấy: dùng môi trường có thêm sinh lầy dầu cặn thích hợp cho phát triển hoạt tính nhóm loài vi sinh vật khác so với môi trường ban đầu c- Phương pháp phân tích gen RNA ribosom (rRNA) Phương pháp phân tích gen rRNA ứng dụng tổng hợp nhiều kỹ thuật sinh học phân tử để phân tích gen rRNA vi khuẩn, từ vạch tính đa dạng vi sinh vật Đây phương pháp quan trọng Sinh thái học vi sinh vật phân tử, kết đạt nhiều Trong phương pháp này, kỹ thuật sử dụng chủ yếu bao gồm chiết xuất DNA tổng số từ mẫu môi trường, thiết kế mồi mẫu dò, nhân PCR, điện di gel gradien biến tính (bao gồm DGGE TGGE), phân tích đoạn đồng hình (restricted fragment length polyphorism – RFLP), sàng lọc kho lưu trữ gen, xác định trình tự, phân tích trình tự xây dựng tiến hóa hệ thống, lai tái tổ hợp điểm, lai tái tổ hợp in situ (tại chỗ), in vivo lai tái tổ hợp dò (nested probes) v.v Tùy theo đối tượng mục đích nghiên cứu khác nhau, kỹ thuật sử dụng đơn độc kết hợp Phương pháp phân tích gen rRNA, thực tạo cách mạng phương pháp nghiên cứu tính đa dạng vi sinh vật Sinh thái học vi sinh vật, qua thúc đẩy mạnh mẽ việc nghiên cứu tính đa dạng vi sinh vật, khiến người ta có nhận thức hoàn toàn quần thể vi sinh vật không nuôi cấy (uncultured microbes) Phương pháp phân tích gen rRNA ứng dụng lần đầu để phân tích quần thể vi sinh vật phù du biển Đây nhóm vi khuẩn SARII không nuôi cấy được, chuỗi rRNA có 12,5% khác với trình tự gen kho số liệu; dùng phương pháp RFLP phân tích 51 clone có đến 47% trình tự khác với quần thể biết Phương pháp sử dụng để tiến hành giám định phân tử hiển vi quần thể vi khuẩn màng sinh vật giá tạo thể rắn Quá trình thực sau: dùng cặp mồi đặc hiệu để nhân 16S rDNA vi khuẩn khử sulfate, lấy sản phẩm PCR làm mẫu dò, tiến hành lai tái tổ hợp in situ Kết cho thấy: có quần thể vi khuẩn có hình thái khác biệt rõ ràng (phẩy khuẩn to phẩy khuẩn nhỏ), vi khuẩn sinh sôi nảy nở nhanh chóng mặt phẳng giới hạn tạo thành Qua phân tích trình tự DNA, có loài phát hiện: Desulfovibrio vulgaris (độ tương quan trình tự 98%), Desulfuromouas acefoscidans (độ tương quan 96%) dạng xoắn thể (Spirochaeta) Dùng bùn họat tính xử lý nước thải phương pháp kỹ thuật công nghệ quan trọng người ta lại biết tương quan thành phần chức thể hội sinh vi sinh vật bùn hoạt tính Phần đáy bùn 5/7 Phương pháp nghiên cứu sinh thái học vi sinh vật hoạt tính coi lớp biofilm cố định Biofilm tiêu thụ nhiều hợp chất hữu chất ô nhiễm Kỹ thuật lai tái tổ hợp dò (nested probe hybridization) thích hợp để nghiên cứu thể hội sinh phức tạp này: Sử dụng mẫu dò chuyên biệt tiến hành nghiên cứu từ cấp độ lớn đến nhỏ (top-to-bottom) phân loài khác Ví dụ lai tái tổ hợp vòng sử dụng mẫu dò chuyên biệt cho vi khuẩn cổ khuẩn; kết quả: phát nhiều tế bào kết hợp với mẫu dò vi khuẩn Vòng hai sử dụng mẫu dò vi khuẩn cho lớp phụ α, β, γ lớp trực khuẩn biến vi khuẩn thuộc phả hệ khác để tiến hành tái tổ hợp Kết việc sử dụng mẫu dò giúp phát vài loại hình thái khác Vi khuẩn oxy hóa ammon có ý nghĩa sinh thái học quan trọng Đó nhóm vi khuẩn tự dưỡng đặc biệt có vai trò quan trọng vòng tuàn hoàn nitơ Dựa đặc tính hình thái, phân biệt vi khuẩn tới cấp độ chi Để phân biệt loài thuộc chi phải vào tỷ lệ % (G+C) DNA việc lai DNADNA Vì phương pháp phân tích rRNA đặc biệt thích hợp để nghiên cứu nhóm vi khuẩn Kết phân tích trật tự gen 16S rRNA chứng tỏ vi khuẩn tự dưỡng oxy hóa ammon có hai nhóm: nhóm có chứa vi khuẩn Nitrosococcus oceanus - thuộc lớp phụ γ, nhóm có chứa vi khuẩn Nitrosococcus mobilis chi vi khuẩn khác - thuộc lớp phụ β Có thể nói phương pháp phân tích gen rRNA la phương pháp lý tưởng nghiên cứu hệ thống sinh thái Kết hợp nhiều phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử cho thấy Nitrosospira phân bố rộng rãi loại môi trường, Nitrosomonas lại tìm thấy loại môi trường Nhưng kết thu nghiên cứu phòng thí nghiệm lại cho kết luận ngược lại Điều chứng tỏ loài phân lập nuôi cấy dễ dàng không luôn loài ưu sinh thái học Phương pháp phân tích rRNA ứng dụng để xác định vi khuẩn đất, xác định tính an toàn vi sinh vật chuyển gen, chuyển gen vi sinh vật đất, v.v Woese cộng kiến nghị xây dựng kho liệu 18S rRNA 16S rRNA (dự án RDP- the ribosomal database project) Muốn liên hệ với kho liệu theo địa e-mail: rdp@phylo.life.uicu.edu server @rdp.life.uicu.edu d- Kỹ thuật điện di gel gradient biến tính Kỹ thuật điện di gel gradient biến tính (denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE) Đây dạng kỹ thuật ”dấu vân tay” (fingerprinting) phân tử Kỹ thuật cho phép phân biệt trình tự DNA khác dựa khác tỷ lệ (G+C)/(A+T) trình tự Khi điện di gel có građien chất biến tính, tùy theo thành phần nucleotit mà phân tử DNA dừng lại vị trí định đặc trưng: phân tử nhiều G C phân tử lâu bị biến tính lâu dừng lại gel điện di Vì vậy, vị trí khác điện di đồ DGGE phản ánh khác trình tự đoạn DNA phân tích Trong trường hợp cụ thể, vị trí đặc trưng cho trình tự DNA phản ánh có mặt loài hay cá thể quần xã phân tích 6/7 Phương pháp nghiên cứu sinh thái học vi sinh vật Myuzer lần dùng kỹ thuật DGGE để nghiên cứu Sinh thái học vi sinh vật, xác định tính đa dạng di truyền quần thể vi sinh vật môi trường thiên nhiên Gần người ta mở rộng phương pháp DGGE để tuyển chọn chủng vi sinh vật rút ngắn nhiều khối lượng công việc Trong thực tế, nên phối hợp phương pháp nghiên cứu truyền thống với phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử nghiên cứu tính đa dạng vi sinh vật cấu trúc quần lạc vi sinh vật hệ thống sinh thái vi sinh vật vô phức tạp Khi phân tích tính đa dạng vi sinh vật cần sử dụng DNA chung quần thể vi sinh vật sử dụng DNA vi sinh vật nuôi cấy khiết 7/7 ... vi c phân bố tính đa dạng vi sinh vật không nuôi cấy cần sử dụng phương pháp khác , bao gồm phương pháp sinh học phân tử 2/7 Phương pháp nghiên cứu sinh thái học vi sinh vật Các phương pháp sinh. .. Các phương pháp sinh học phân tử dùng nghiên cứu sinh thái học vi sinh vật Các kỹ thuật sinh học phân tử đại ứng dụng nghiên cứu Sinh thái học nói chung Sinh thái học vi sinh vật nói riêng Các kỹ... phân tích 6/7 Phương pháp nghiên cứu sinh thái học vi sinh vật Myuzer lần dùng kỹ thuật DGGE để nghiên cứu Sinh thái học vi sinh vật, xác định tính đa dạng di truyền quần thể vi sinh vật môi trường