Đường cong sinh trưởng Đường cong sinh trưởng Bởi: Nguyễn Lân Dũng ĐƯỜNG CONG SINH TRƯỞNG Sự sinh trưởng quần thể vi sinh vật nghiên cứu cách phân tích đường cong sinh trưởng môi trường nuôi cấy vi sinh vật theo phương pháp nuôi cấy theo mẻ (batch culture) hệ thống kín Có nghĩa vi sinh vật nuôi cấy thiết bị kín, trình nuôi cấy không thay đổi môi trường thời gian nuôi cấy kéo dài nồng độ chất dinh dưỡng giảm sút, chất phế thải trao đổi chất tăng lên Nếu lấy thời gian nuôi cấy trục hoành lấy số logarit số lượng tế bào sống làm trục tung vẽ đường cong sinh trưởng vi sinh vật sinh sản cách phân đôi Đường cong có giai đoạn (phases) khác Hình 14.1: Đường cong sinh trưởng hệ thống kín (Theo sách Prescott, Harley Klein) Giai đoạn Tiềm phát (Lag phase) Khi cấy vi sinh vật vào môi trường số lượng thường không tăng lên ngay, giai đoạn Tiềm phát hay pha Lag Trong giai đoạn tế bào chưa phân cắt thể tích khối lượng tăng lên rõ rệt có tăng thành phần tế bào Nguyên nhân tế bào trạng thái già, thiếu hụt ATP, cofactor cần thiết ribosome Thành phần môi trường không giống môi trường cũ tế bào cần thời 1/9 Đường cong sinh trưởng gian định để tổng hợp enzyme nhằm sử dụng chất dinh dưỡng Các tế bào bị thương tổn cần thời gian để hồi phục Bất kỳ nguyên nhân kết tế bào phải tự trang bị lại thành phần mình, tái tạo ADN bắt đầu tăng khối lượng Giai đoạn tiềm phát dài hay ngắn liên quan đến thân loại vi sinh vật tính chất môi trường Nếu tính chất hóa học môi trường sai khác nhiều với môi trường cũ giai đoạn tiềm phát kéo dài Ngược lại, cấy từ giai đoạn logarit vào môi trường có thành phần tương tự giai đoạn tiềm phát rút ngắn lại Nếu cấy vi sinh vật từ giai đoạn tiềm phát hay từ giai đoạn tử vong giai đoạn tiềm phát kéo dài Giai đoạn logarit (Log Phase) hay Pha Chỉ số (Exponential Phase) Trong giai đoạn vi sinh vật sinh trưởng phân cắt với nhịp độ tối đa so với tính di truyền chúng gặp môi trường điều kiện nuôi cấy thích hợp Nhịp độ sinh trưởng chúng không thay đổi suốt giai đoạn này, tế bào phân đôi cách đặn Do tế bào sinh khác đường cong sinh trưởng đường trơn nhẵn không gấp khúc (hình 14.1) Quần thể tế bào giai đoạn có trạng thái hóa học sinh lý học việc nuôi cấy giai đoạn thường sử dụng để nghiên cứu sinh hóa học sinh lý học vi sinh vật Sinh trưởng logarit sinh trưởng đồng đều, tức thành phần tế bào tổng họp với tốc độ tương đối ổn định Nếu cân dinh dưỡng hay điều kiện môi trường thay đổi dẫn đến sinh trưởng không đồng Sự sinh trưởng nhịp độ tổng hợp thành phần tế bào tương đối biến hóa biến đổi theo đạt tới cân Phản ứng dễ quan sát thấy làm thực nghiệm chuyển tế bào từ môi trường nghèo dinh dưỡng sang môi trường giàu Tế bào trước hết phải tạo nên ribosome nâng cao lực tổng hợp protein, sau tăng cưởng tổng hợp protein ADN Cuối tất yếu dẫn đến tốc độ phát triển nhanh chóng Lúc chuyển quần thể tế bào từ môi trường giàu dinh dưỡng tới môi trường nghèo có kết sinh trưởng không đồng Vi sinh vật trước thu từ môi trường nhiều thành phần tế bào chuyển sang môi trường nghèo chúng cần có thời gian để tạo enzyme cần thiết để sinh tổng hợp thành phần sẵn môi trường Sau tế bào phân cắt, ADN tái tạo, việc tổng hợp protein ARN chậm tế bào nhỏ lại tổ chức lại trao đổi chất chúng chúng sinh trưởng tiếp Sau sinh trưởng cân hồi phục trở lại giai đoạn logarit Các thí nghiệm cho thấy sinh trưởng vi sinh vật kiểm soát cách xác, phối hợp phản ứng nhanh chóng với biến đổi môi trường 2/9 Đường cong sinh trưởng Khi sinh trưởng vi sinh vật bị hạn chế nồng độ thấp chất dinh dưỡng cần thiết sản lượng tế bào cuối tăng lên với tăng lên chất dinh dưỡng bị hạn chế (hình 14.2a) Đây sở để sử dụng vi sinh vật việc định lượng vitamin nhân tố sinh trưởng khác Tốc độ sinh trưởng tăng lên với tăng nồng độ chất dinh dưỡng (hình 14.2b) Hình dáng đường cong phản ánh tốc độ hấp thu chất dinh dưỡng nhờ chuyển vận protein vi sinh vật Lúc nồng độ chất dinh dưỡng đủ cao hệ thống vận chuyển bão hòa tốc độ sinh trưởng không tăng lên với tăng lên nồng độ chất dinh dưỡng Hình 14.2: Nồng độ chất dinh dưỡng sinh trưởng (a )- Ảnh hưởng hạn chế chất dinh dưỡng sản lượng chung vi sinh vật Lúc nồng độ đủ cao sản lượng chung đạt tới ổn định.(b)- Ảnh hưởng hạn chế chất dinh dưỡng tới tốc độ sinh trưởng Giai đoạn Ổn định (Stationary Phase) hay Pha Cân Qua giai đoạn Logarit sinh trưởng quần thể cuối dừng lại, đường cong sinh trưởng ngang (hình 14.1) Nồng độ vi khuẩn giai đoạn ổn định thường vào khoảng 109/ml Với vi sinh vật khác thường không đạt đến nồng độ Với động vật nguyên sinh vi tảo thường đạt đến nồng độ 10 6/ml Đương nhiên, số lượng tế bào cuối định ảnh hưởng chung điều kiện dinh đưỡng, chủng loại vi sinh vật nhân tố khác Trong giai đoạn số lượng tế bào sống không thay đổi, số lượng tế bào sinh cân với số lượng tế bào chết đi, tế bào ngừng phân cắt mà giữ nguyên hoạt tính trao đổi chất Có nhiều nguyên nhân làm cho quần thể vi sinh vật chuyển sang giai đoạn ổn định Trong nguyên nhân chủ yếu hạn chế chất dinh dưỡng Nếu chất dinh dưỡng thiết yếu bị thiếu hụt nghiêm trọng sinh trưởng chậm lại Vi sinh vật 3/9 Đường cong sinh trưởng hiếu khí thường bị hạn chế nồng độ oxygen Oxygen thường hòa tan nước, O2 nội môi trường nhanh chóng bị tiêu thụ hết, có vi sinh vật sinh trưởng bề mặt môi trường có đủ nồng độ O2 để sinh trưởng Vì nuôi cấy vi sinh vật phải sử dụng tới máy lắc hay biện pháp thông khí khác Quần thể vi sinh vật bị đình sinh trưởng gặp tích lũy sản phẩm trao đổi chất có hại Một số vi sinh vật kỵ khí (như Streptococcus) lên men đường làm sản sinh lượng lớn acid lactic hay acid hữu khác, làm acid hóa môi trường ức chế sinh trưởng vi sinh vật Đồng thời tiêu hao hết đường làm cho tế bào vào giai đoạn ổn định Sau là, số chứng cho thấy số lượng vi sinh vật đạt đến giới hạn định sinh trưởng bị đình Sự sinh trưởng vi sinh vật chuyển sang giai đoạn ổn định kết chung nhiều nhân tố khác Như chúng ta.đã thấy vi khuẩn nuôi cấy theo mẻ chuyển sang giai đoạn ổn định thiếu thức ăn Trong tự nhiên, nhiều môi trường có nồng độ chấ dinh dưỡng thấp nên vi sinh vật thường chuyển sang giai đoạn ổn định Đối với vi khuẩn việc chuyển sang giai đoạn ổn định loại thích ứng tốt Nhiều loại vi khuẩn biến hóa rõ rệt hình thái (như hình thành bào tử nội sinh-endospore) chúng thu nhỏ kích thước lại, thường chất nguyên sinh co lại nhân giả (nucleoid) đậm đặc lại Một biến đổi quan trọng là, thiếu thức ăn vi khuẩn sinh loại protein đói (starvation proteins) làm cho tế bào đề kháng nhiều với thương tổn nhiều đường khác Chúng làm tăng liên kết peptidoglycan bền vững thành tế bào Chẳng hạn Dps (DNA-binding protein from starved cells), loại protein kết hợp với ADN lấy từ tế bào đói, bảo vệ cho ADN Phân tử Chaperones cản trở biến tính protein hồi phục lại protein bị tổn thương Vì việc nhiều chế khác mà tế bào đói khó bị chết đề kháng với tình trạng bị đói, với biến hóa nhiệt độ, tổn thương ôxy hóa thẩm thấu, tăng sức đề kháng với hóa chất có hại (như chlorine chẳng hạn) Những cải biến có hiệu làm cho số vi khuẩn sống lại sau vài năm bị đói Rõ ràng việc hiểu rõ vấn đề có tầm quan trọng thực tiễn to lớn y học vi sinh vật học công nghiệp Chúng chứng minh vi khuẩn thương hàn (Salmonella typhimurium) nhiều vi khuẩn gây bệnh khác có khả gây bệnh mạnh bị đói Giai đoạn tử vong (Death Phase) Việc tiêu hao chất dinh dưỡng việc tích lũy chất thải độc hại làm tổn thất đến môi trường sống vi sinh vật, làm cho số lượng tế bào sống giảm xuống Đó đặc điểm giai đoạn tử vong Giống giai đoạn logarit, tử vong quần thể vi sinh vật có tính logarit (tỷ lệ tế bào chết không đổi) Tổng số tế bào sống tế bào chết không thay đổi tế bào chết chưa bị phân hủy Muốn xác định số lượng tế bào sống phải pha loãng cấy lên thạch đĩa đưa vào điều kiện thích hợp để xác định số khuẩn lạc xuất Mặc dầu phần lớn vi sinh vật tử vong theo 4/9 Đường cong sinh trưởng phương thức logarit sau số lượng tế bào giảm xuống tốc độ chết tế bào chậm lại Đó số cá thể sống lại nhờ có tính đề kháng đặc biệt mạnh Vì điều nguyên nhân khác làm cho đường cong giai đoạn tử vong phức tạp Tính toán trình sinh trưởng Không nhà vi sinh vật học tính toán tốc độ sinh trưởng vi sinh vật giai đoạn logarit Tính toán nhịp độ sinh trưởng làm sở cho nghiên cứu sinh lý học, sinh thái học vi sinh vật, để giải số vấn đề ứng dụng sản xuất công nghiệp Trong giai đoạn logarit cá thể vi sinh vật tiến hành phân cắt thời gian định Số lượng tế bào tăng theo phương thức 2n Thời gian hai lần phân chia liên tiếp hay thời gian cần cho tăng đôi số tế bào gọi thời gian hệ (generation time hay doubling time) Ví dụ đưa tế bào vào môi trường nuôi cấy, 20 phút phân cắt lần sau 20 phút có tế bào, sau 40 phút có tế bào tiếp tục (bảng 14.1) Bảng 14.1: Một ví dụ sinh trưởng theo logarit Thời gian * Số lần phân cắt n Số lượng (N x n ) lg 10 N t 0 20=1 0,000 20 21=2 0,301 40 22=4 0,602 60 23=8 0,903 80 24=16 16 1,204 100 25=32 32 1,505 120 26=64 64 1,806 *Thời gian hệ 20 phút, giả thiết nuôi cấy từ tế bào Số lượng logarit tế bào 2n, n số hệ Có thể biểu thị số liệu bảng 14.1 công thức sau đây: 5/9 Đường cong sinh trưởng Trong đó: N0 số lượng tế bào ban đầu; Nt số lượng tế bào thời gian t; n số hệ Từ công thức biến đổi sau số hệ n tính logarit thập phân: Khi nuôi cấy phân mẻ (batch culture) tốc độ sinh trưởng giai đoạn logarit biểu thị số tốc độ sinh trưởng bình quân k (mean growth rate constant k) Đó số hệ sinh đơn vị thời gian, thường biểu thị số hệ giờ: Thời gian cần thiết để tăng gấp đôi tổng số tế bào thời gian hệ bình quân (mean generation time) hay thời gian tăn gấp đôi bình quân (mean doubling time) biểu thị g Nếu t=g N t= 2N0 Thay vào công thức ta có: Thời gian hệ bình quân đảo số số tốc độ sinh trưởng bình quân: 6/9 Đường cong sinh trưởng Thời gian hệ bình quân g trực tiếp vào đồ thị bán logarit (semilogarithmic plot) số tốc độ sinh trưởng để tính (hình 14.4) Ví dụ ,số lượng vi khuẩn thứ 10 từ 103 tăng lên đến 109 : (thế hệ/h) giờ/thế hệ hay 30 phút/thế hệ Hình 14.3: Sinh trưởng hệ vi sinh vật (biểu thị hệ)(Theo sách Prescott,Harley Klein) Hình 14.4; Xác định thời gian hệ.Thời gian hệ xác định đường cong sinh trưởng vi sinh vật Lấy thời gian trục hoành lấy số lượng tế bào làm trục tung Thời gian tăng gấp đôi số lượng quần thể (thời gian hệ) đọc trực tiếp đồ thị Thời gian hệ thay đổi tùy theo chủng loại vi sinh vật, điều kiện nuôi cấy Một số vi khuẩn thời gian hệ không 10 phút (0,17h) số vi sinh vật nhân 7/9 Đường cong sinh trưởng thực (eucaryotic) lại dài tới vài ngày (Bảng 14.2) Thời gian hệ tự nhiên thường dài so với nuôi cấy Bảng 14.2: Thời gian hệ số loài vi sinh vật Vi sinh vật Nhiệt độ ( C) Thời gian hệ (giờ) Vi khuẩn Vi khuẩn lam Beneckea natriegens 37 0,16 Escherichia coli 40 0,35 Bacillus subtilis 40 0,43 Staphylococcus aureus 37 0,47 Pseudomonas aeruginossa 37 0,58 Clostridium botulinum 37 0,58 Rhodospirillum rubrum 25 4,6-5,3 Anabaena cylindrica 25 10,6 Mycobacterium tuberculosis 37 Khoảng 12 Treponema pallidum 37 33 Scenedesmus quadricauda 25 5,9 Chlorella pyrenoidosa 25 7,75 Asterionella formosa 20 9,6 Euglena gracilis 25 10,9 Ceratium tripos 20 82,8 Tetrahymena geleii 24 2,2-4,2 Leishmania donovani 26 10-12 Paramecium caudatum 26 10,4 Acanthamoeba castellanii 30 11-12 Giardia lamblia 37 18 Tảo Động vật nguyên sinh 8/9 Đường cong sinh trưởng Nấm Saccharomyces cerevisiae 30 Monilinia fructicola 25 30 9/9 ... làm cho đường cong giai đoạn tử vong phức tạp Tính toán trình sinh trưởng Không nhà vi sinh vật học tính toán tốc độ sinh trưởng vi sinh vật giai đoạn logarit Tính toán nhịp độ sinh trưởng làm... giai đoạn có trạng thái hóa học sinh lý học việc nuôi cấy giai đoạn thường sử dụng để nghiên cứu sinh hóa học sinh lý học vi sinh vật Sinh trưởng logarit sinh trưởng đồng đều, tức thành phần... trọng sinh trưởng chậm lại Vi sinh vật 3/9 Đường cong sinh trưởng hiếu khí thường bị hạn chế nồng độ oxygen Oxygen thường hòa tan nước, O2 nội môi trường nhanh chóng bị tiêu thụ hết, có vi sinh