Bộ Y TÊ Ẩiờ') tUẢJi (ỷf( TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI BOCỐ CSBO Et)C3 Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc Thầy giáo-Tiến sỹ Lê Thảnh Phước Thầy giáo-Thạc sỹ Lê Đinh Quang, tận tình hướng dân tơi hồn thành khố luận Đồng thời tơi muốn gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy, cơ, anh chị kỹ thuật NGUYỄN viên BộTHỊ mơn; Tơi xinTHƯƠNG gửi lời cảm ơn đến HUYỂN cơ, thư viện ĐH Dược HN; thư viện Quổc Gia; thư viện khoa học kỹ thuật, tạo diều kiện giúp đỡ tơi tìm tài liệu q giá q trình TỔNG QUAN VỂ PHƯƠNG PHÁP LƯỢNG làm luận văn Tơi xin cảmCÁC ơn Ban Giám Hiệu, Đảng Uỷ ĐỊNH nhà trường, thầy CHẤT OXY HĨA giáo tạo điều kiện cho tơiCHỐNG thoả sức học tập mơi trường tốt nhất, cho tơi giảng q báu khố học (KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHĨA: 2003 - 2008) Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình bạn bè tơi, người dã hết lòng giúp đỡ, tạo điều kiện động viên tơi suốt năm qua Hà Nội, ngày 22 tháng năm 2008 - Sinh viên: Người hướng dẫn : PGS.TS Lé Thành Phước ThS Lê Đình Quang Nơi thực hỉện : Bọ mòn Hỏa Đạị Cương-Vồ Cơ Nguyễn Thị Huyền Thương - Thời gian thực HÀ NƠI - 5/2008 CHÚ GIẢI CHỮVIẾT TẤT ABAP: 2,2- Azíno his(amidino-propane hydrochlcride) AỀTẵ: 2,2 -azíno bỉs-(3- cthylbenzothỉazoỉỉne-6-sunfomc acid) AT: a — tocoferol COXH: chống oxy hố DPPH: Diphenyl-p-picrylhydraxyl FAD = Flavin Adenin Dinucleóđ FMN = Flavin mononucleotide GR : Glutathion reductase GSÍTglutathion GSHPx:Glutathion peroxydase NAD = Nicotinamid Adcnin Dinuclcotid NADPH^Dihydronicotinamide adenine đinucieoũd phosphat Oxh: Oxy hố Oxh-kh: Oxy hố khử TAS: Total Antioxidant Status TRAP: Total peroxy radical trapping antioxydanl parameter assay MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ l Phần ỉ: ĐẠI CƯƠNG VỀ CÁC CHẤT COXH VÀ CÁC HỆ CHẤT COXH 1.1- GỐC tự 1.1.1- Khái niệm 1.1.2- Sự hình thành gốc tự thể 1,1.2.1- Từ chuỗi hơ hấp tế bào ty thể ỉ 1.2.2- Từ q trình pcroxyd hố lipiđ 1.1.2.3- Từ phản ứng tạo gđc khác thể 1.1.3- Gốc tự sinh học vai trò 1.1.4- Tác hại gốc tự 1.2- Các hệ chất chống oxy hố thể ] 2.1- Cắc enzym nội bằo 1.2.2- Các chất phi enzym phân tử nhỏ 1.2.3- Cấc phối tử tạo phức khố ion kim loại 1.3- Các châ't có hoạt tĩnh chống oxy hố tự nhiên 1.3.1- Vitamin E 1.3.2- Vitamin c 1.3.3- Havonoid 1] 1.3.4- Curcumin 12 1.3.5- p- Caroten 13 1.3.6- Lycopcn 13 Phần 2: NGUN TẮC CỦA CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CÁC c HẤT CĨ HOẠT TÍN H COXH 15 2.1- Định lượng trực tiếp -sử dụng phương pháp hố lý 15 2.1.1- ữ-Tocoferol 15 2.1.1.1- Phương pháp đo quang 15 ẫ 1, i 2- phương pháp cực phổ é 2.1.1.3- Chuẩn ampe 2.1.] 4-Phương 16 pháp sắc kỷ 17 2.1.1.5- Phương pháp so màu theo M.Furter R.Meyer 18 2.1.1.6- Định lượng tocoferol bàng huỳnh quang theo M.KoHer 18 2.1.1.7- Định lượng tocerol bàng phương pháp oxy hố khử 19 theo M.Klcr 2.1.2- p -caroten lycopcn 20 2.1.3- Vỉtamỉn c 20 2.1.3.3- Phương pháp đo điện 21 2.1.3.4- Phương pháp chuẩn dơ 2,6'diclophcnolindophenol 21 2.1.3.5- Phương pháp oxy hố khử theo DĐVN III 21 2.1.4- Selen 21 ] í - Phương pháp phân tích khối lượng í 2.1.4.2- Phương pháp quang phổ hấp thụ UV-V1S 22 22 2.1.4.3- Phương pháp huỳnh quang 22 2.1.4.4- Phương pháp cực phổ 22 2.1.4.5- Phương pháp kích hoạt phóng xạ 22 2.1.5- Curcumin 23 2.1.5.1“ Phương pháp sắc kỹ 23 ] 5.2- Phương pháp quang phổ 2.2- Các phương phấp đo gián tiếp chất chống oxy hố 2.2.1- Phương pháp cộng hương lừ điện lử (NMR) Yầ bẫy gốc (ESR)23 2.2.2- Đo sản phẩm q trình POL 24 2.2.2.1 - Phép đo pcroxyd lìpid (LOOH) 24 2.2.2.2- Đo ankan bay 25 2.2.2.3- Đo MDA-các chất phản ứng với acid thiobarbituric 26 2.2.2.4- Đo aldehyd khác MDA 2.2.2.5- Đo dien liên hợp 2.2.3- Đo tổn thương protein 2.2.4- Đơ tổn thương AND 2.2.4.1= Phương pháp điện di gel đơn tế bầo (phương pháp comet, phương pháp "sao chổi") 2.2.4.2- Định lượng trực tiếp 8-oxo-đeoxyguanosin ADN bằngHPLC 2.2.5- Đo hoạt tính enzyme supeoxid đixmutase (SOD) 2.2.6Đo chất chống peroxide GSH GSHPx 2.2.6.3“ Định lượng GSH phương pháp so màu 2.2.7- Đo hàm lượng selen 2.3- Định lượng hoạt tính chống oxy hố tồn phần 2.3.1- Phương pháp TRAP 2.3.2- Phương pháp định lượng ABTS in vitro 2.3.3- Phương pháp S.G Blagodorop 2.3.4- Phương pháp xác định hoạt độ chống oxy hố xác định số iod Phẩn 3: BAN LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO 31 31 32 33 33 34 36 36 38 44 IV ĐẶT VẤN ĐỂ Đầu năm 90 cửa kỷ qua, gốc lự oxy, dạng oxy hoạt động vầ cấc chất chống axy hoấ đc cập nhiều ngành y sinh dược Chất ctrếng chống oxy hố íà chất phản ứng trực tiếp loại bỏ gốc tự oxy; vào thể làm tăng vai trò hoạt động chất chống oxy hố khác Cho đến nay, chất chống oxy hố ngày nghiên cứu sử dụng làm thuốc dự phòng điều trị bệnh tim mạch, ling thư, lão heấ gốp phần bầõ vệ sức khoề, kcỡ dlìị tuổi thọ người Để đánh giá ảnh hưởng tác nhân gầy bệnh, hiệu thuốc dự phòng điều trị bệnh trên, người ta thường dựa vào tiêu xác định gốc tự chất chống oxy hố Do đó, phương pháp định lượng đánh giá hoạt tính sinh học chất chống oxy hố quan trọng Tới nay, nhiều trường Đại Học, Viện nghiên cứu triển khai ứng dụng phương phẩp nghỉên cứu, định ỉuợng gốc tự cẩc chất chống oxy hố sỉnh học y dược học Để có cách nhìn hệ thống tồn cảnh phương pháp định lượng này, chúng tơi thực đề tài: “Tong quan phương pháp định lượng chất chống oxy hố” với hai mục tiêu: Viết tổng quan vê gốc tự hệ chất chống oxy htìá thể, tự nhiên Hệ thơng hố ngun tắc phương pháp định lượng cức PHẦN 1: ĐẠI CƯƠNG VỀ CÁC CHẤT CHốNG OXY HỐ VÀ CÁC HỆ CHẤT CHỐNG OXY HOẨ TRONG CO THỂ Trong năm gần đây, người ta đề cập nhiều đến gốc tự do^các chất chống oxy hố, Gốc tự chất độc hại sinh trong q trình chuyển hố (gọi gốc tự nội sinh) gốc tự ngồi mơi trường xâm nhập vào thể (gọi gốc tự ngoại sinh) Gốc tự nội sinh thể hình thành từ: chuỗi hơ hấp tế bào ty thể, q trình peroxyd hố lipid (peroxydlipid = POL), từ phản ứng tạo gốc khác thể Gốc tu ngoại sinh gốc tự ngồi mơi trường xâm nhập vào thể tác động cua mối trường như: tia phóng xạ, xạ, đo nhiêm mơi trường (ngoại mơi) gây nhiễm thể (nội mơi) ỉà: hố chất phi sinh học- thuốc trừ sâu, diệt cỏ, blcomycìn, kim loại nặng, vi khuẩn, virus Các chất oxy hố có khả oxy hố cao, phát sinh phản ứng dậy chuyền làm tổn hại đến tếhàOi lổ chức, gây nhiều loại bệnh tậi vầ lầm tăng q trình lão hố người Gốc tự oxy hố gây loại bệnh số quan như: tim mạch- gây xơ vừa động mạch dẫn đến hậu nhồi máu tim, suy tim, huyết áp cao, thiếu máu thận, suy gan, thiểu tuần hồn não; nhãn khoa- thối hố võng mạc, thối hố điểm vàng, đục thuỷ tinh thể, loại viêm mắt; bệnh tiểu đường; ung thư 1.1- Gốc tự [12] ỉ.l.l-Khái niệm Gốc tự (R*) tiểu phản hố hạc (phân tử, mảnh phân tủ, ngun tử, ion) có eỉectron độc thân tồn độc lập Ví dụ: 'OH , ỏ, 3Ơ2, Nỏ Nỏ2 * C6H5, CL > H 1.1.2 - Sự hình thành gấc tự thể [12] Trong thể, gốc tự hình thành theo đường: Ị2+~e = Ịĩ (I) ì 2,1-Từ chuỗi hơ hấp tế bào ty thể Từ chuỗi hơ hấp tế bào có gốc tự hình thành Q ~, 'Oz, Ngun nhân 02 tạo từ chuỗi vận chuyển hydro electron: Ferocytocrom + 4H+ + 02 = Ferícỵtocrom + 2HzO Đổ phản ứng tổng kết cho ví dụ vận chuyển 4H+ + 4e theo sơ đồ sau: 4H++4e CoO.H^ s khơng khí (oxy tam bội) Vòng Krebs Hơ thống cytocrom Xúc tác bởi: Các enzym vận chuyển hydro (Dehydrogenase) NAD, * FAD, FMN; enzym vận chuyển electron (phức Fe2+, Fe3+) Sau đó, phân tử 302 nhận electron: gốc anion superoxyd o\ + e+ 2H+ = HA (2) Hydroperoxyd H202+ẽ + H+:=H20+*OH (3) Gốc hydroxyd 'OH + ẽ + H+ - H2Ơ Phản ứng tổng: + 4e + 4H = 2H70 + Năng lượng + (4) Do rò rỉ, thẩm lậu, tự huỷ •oj + '0-2 +2H+ = H,0,+ '02 gốc: (5) oxy đơn bội = OH + ỎH + ‘02 khơng xúc tác: Haber - weiss (6) có xúc tác Fe2+, Cu+: Fenton Tốc độ phản ứng Penton » phản ứng Haber- weiss Từ phản ứng dây, xuất chất độc hại: 02 gốc xuất đẩu tiên hơ hấp tế bào, khỏng q độc, khơi mào cho phản ứng sinh gốc khác OH* gốc nguy hiểm (gốc đơn giản, khối lượng nhỏ, hoạt tính H202 phân tứ oxy hoố- khử mạnh, độc hại l 02 phân tử lượng cao, nguy hiểm tiểu phân gọi chung dạng oxỵ hoạt động (OXHĐ) 1.1.2.2- Từ q trình peroxyd hô lipid (peroxydỉipid = POL) R* + LH -+ RH 4- L* Nếu QH* + LH ->H20 + L* Tiếp tục: L*+Õ2 LOO* (7) LOO* + LH LOOH + L* L * + 02 —> LOO’ tiếp tục quay vòng Nếu '02 + LH —> LOOH dãn đến pcroxyd hố Dồn đến phân cắt LH (như acid arachidonic); Hoạc dập tát phản ứng (7) phản ứng gốc + gốc: L* + L* L-L (8) L* + R* L-R Ngồi ra, có mạch ly peroxyd hoạt tính cao, tạo phản ứng sinh gốc vượt qua màng: L00* gốc lipoperoxyđ OH LOOH gốc hydroxyd OOH* Các gốc lại đóng vai trò R' ban đầu khơi mào lại phản ứng chuyền (7) Chuỗi phản ứng (7), (8), (9) làm phá vỡ màng sinh học 1.123- Từ phản ứng tạo gốc khắc thể R* +H2O -^RH + OH* (70 % thể) OH * tham gia vào q trình PQL tham gia phản ứng: R' I + OH*-> R|-OH (10) Dẩn đến Hydroxyl hố ,COOH H2NCH NO-synthase _ ^ HN o7 HN-CH' L-Arginin NADPH ,COI +■ NO NH, L-Citrulin Gốc NO1 sinh nội mạc mạch máu (gây giãn mạch) tế bào (gây chức khác ) Lĩ 3- Gốc tự sình học vai trò [18] R’ sinh học có nhiều vai trò quan trọng: > Dị hỗ, ly giải chất > Tổng hơp chất (2 gốc dễ kết hơp - tổng hợp hormon steroid) thơng qua R* > sản xuất lượng ATP > Bảo vệ (tiêu huỷ virus; vi khuẩn; ký sinh trùng; tế bào già, hỏng, ung thư) > Điều hoằ tính thấm màng Tuy nhiên, thẩm lậu, rò rỉ, dư thừa R* khỏi q trình hữu ích mặt trái gây nguy hại cho thể ỉ.1.4- Tác hai gốc tự dơ [14] Tất phân tử sinh học bị gốc tự cơng, phân lử lipid dẻ Màng tế bào giàu acìd béo chưa no, phân tử dễ bị cẩc gốc cố tinh oxy hố cơng Sự huỷ hoại cấu truc Gẩc acid béo chưa no q trình pcroxidc hố lipid (POL), sinh gốc mới: L*„ LOO* Bản thân gốc LOO* chuyển dịch điện lử tạo peroxid nội phân huy thành mảnh có số ngun tử cacbon ngắn hơn, dạng andehyd độc hại như: hydroxynonenal, malonyldiandchyd, eĩan, pcntan Q trình phân huỷ gây tiỗu huỷ màng tế bào, tạo sản phẩm aldehyđ độc hại Đây mội kiểu gây lổn thương, viêm hoại lử dạc biệt phản ứng gốc íự Q trình gán liền với tổn thương mơ bệnh (như tổn thương gan CC1 4, xơ vữa động mạch, tổn thương khối u ác tính ) Các ADN bị gốc có tính oxy hố mạnh cơng, gốc hình thành gần sát phân tử ADN Những nucleobase tìm thấy nước tiểu lơ chứng có sư cơng liên tục gốc tư phân tử ADN Dù sửa chữa với hiệu cao, số tổn thương vần cố thể tích tụ lại, sau thời gian lượng tích tụ lại đủ để dẫn tới đột biến từ mà sinh ung thư 1.2- Các hệ chất chống oxy hơá củii thể [12] Hê thống báo vệ thể bao gồm: enzym, chất chòng oxỵ hố phi enzym phối tử tạo phức khoắ ion kim loại nghĩa khả nâng loại bỏ gốc * mạnh suy lượng gốc ’ 2' có tế bào thấp Thơng thường để xác định hoạt tính cnzyme SOD, người ta dùng hệ (XH) xanthinoxyđâSê (XO) để tạo râ gốc 02"f gốc phản ứng nhanh với chất INT [2(4-iodophcnyl)-3(4-nitrophenol)-5-phenyltetrazolium chloriđe], tạo phẩm màu đỏ fòrmazan Khi có SOD gốc *0 2' bị phản huỷ, ức chê hình thành màu đỏ formazan Dựa vào phần trăm ức chế suy hoạt độ enzyme SOD 2.2.6- Đo chất chốngperoxide GSH vổ GSỈỊPx [14] [291 [32] Trong hệ thống chống peroxide có hai chất chống oxy hố quan trọng GSH GSHPx Có nhiều phương pháp xác định hai hợp chất chuẩn độ ampc kế, cực phổ nhtmg đặc hiệu nhạy nhũng phương pháp giới thiệu 2.2.6 ỉ -Xác định GSHPx theo phương pháp quang H.V.Bergmeyer Người ta dựa vào sụ biến thiên độ hấp thụ quang học (AE) thời gian phút, chất sản phẩm chuyển hố có khác độ hấp thụ quang học ỏ hước sóng Ả định Khi chất sản phẩm chuyển hố khơng có khác vê mạt độ quang học này, sản phẩm chuyển hố tiền chất có khác mật độ quang học, hoạt độ enzym xác định cách ghcp hai phản ứng, chọ chúng xảy Irong cốc đo, yớị Ịựợng dự tiền chấỊ Ịựựng dư enzym xúc tác cho pư chuyển hố phụ trợ Khí đó, tốc chuyển hố chất enzym cần nghiên cứu phụ thuộc vào lượng enzym có dịch thử Bằng cách theo dõi mật quang bước sóng chọn, ta biết lượng 30 ứng phương pháp đo quang Ằ- 340 nm , với thị quang học !à NADPH2 enzym phụ trợ glutathion reduclase (GR) theo sơ đồ phản ứng: 2GSH + ROOH GSSG + H2Ơ + ROH GSSG + NADPHZ gr»- 2GSH + NADP Việc xác định hoạt độ enzym Ố dựa ngun tắc xác tlịnh hoạt độ enzym phương pháp đo quang cùa H.V.Bergmeyer Vẽ đồ thị biểu diễn mối quan hệ t (phút) E (mệt độ quang), bỉến thiên ÀE theo dõi trước phản ứng bắt đẩu (khi cho thành phần cuối hỗn hạp phản ứng vào cuvet đo) sau khoảng từ đến phút Dựa vào đồ thị thu được, tính AE/phút Từ đổ suy hoạt độ cn/ym 2.2.62- Xác định GSHPx theo phương pháp Paglia Vưlentine: Nguyền tắc phương pháp glutathion peroxidase xúc tác phản ứng oxh GSH eumene hỵdroperoxìd theo phản ứng: ROOH + 2GSH GSHPx» GSSG + H20 + R0H Sự có mặt glutathion reduclase (GR) NADPH, glutathion dạng oxh GSSG trở thành dạng khửGSH theo phản ứng: GSSG + NADPH + H+ 2GSH + NADP* Hoạt độ GSHPx đo giảm độ hấp thụ phổ N ADPH À = 340 nm theo thời gian Vì hỗn hợp phản ứng, hai phán ứng ln đồng thời xảy luợng ROOH, GR ln dư thừa, giảm NADPH tỷ lệ với hoạt độ enzym GSHPx 22.6.3- Định lượng GSH phương pháp so màu: GSH dịch chiết sinh học phản ứng với thuốc thử Ellman (5,5 đithio bis-(2-nitro benzoic acỉd) tạo sản phẩm màu vàng, có độ hấp thụ bước sóng ^=412nm Đo cường độ chất so với chất chuẩn, suy hàm lượng GSH có mẫu đo GSH+ SH COOH 5,5 dithio cooư bis-(2nitro benzoic acid) Người ta tạo dịch thể 9% acỉd metaphotphorỉc 5% 4Õ c tổ chức cần định lượng (gan, não, )- Sau dó thêm acid tricloacetic 20% Ly tâm, loại bỏ tủa điều đến pH trung tính NaOH Lấy 0,5 ml dd nàv thơm 4,5 mỉ dd gồm thuốc thử Ellman hồn hợp đệm Na-,P04 0,IM EDTA 0,05 M Đem ủ 20-25° c Rồi đo quang ^=412nm Khi đó, hàm lượng GSH tính theo cơng thức: 0,5.m Trong đó: X: Hàm lượng GSH (mg/g tổ chức) V: Tổng thể tích dịch thể, acid tricloacetic NaOH (ml) Hàm ỉượng GSH i cm' dung dịch {ụgìml) Nồng độ c xác định qua đồ thị liẻn quan D lượng GSH theo phương pháp thêm chuẩn, m: Khối lượng tổ chức ( mg) 2.2.7 -Đo hàm lượng se len [14] 32 GSHPx-Se, dạng có chủ yếu ngồi ty thể Ngồi tỵ thể có thêm dạng khơng chứa selen Hoạt độ enzym phụ ihuộc nhiều vào lượng selen cung cấp hàng ngày cho eơ thể Nhu cầu hầng ngày người lớn khoảng 70=200 pg selen Nếu thiếu selen hoạt tính enzym giảm ảnh hương lớn tới khả loại bỏ peroxid lipid Vì sclcn chất chống oxh gián tiếp hệ chống peroxid Các phương pháp đo selen trình bày mục 2.1.4, 2.3- Định lượng hoat tính chống oxy hố tồn phẩn 2.3.1- Phương pháp TRÁP [18] Gán người ta nhắc nhiều đến khái niêm tình trạng chống oxh tồn phần -TAS (Total Aniìoxiđant Status) Đã có vài nghiên cứu tiến hành đánh giá tổng hoạt tính chống oxy hố dịch thể Tuy nhiên, chúng thường gặp phải khổ khăn nghiên cứu riêng biệt xác định thành phần có hẹ chất chống oxy hố Phương pháp định lượng đẩu tiên nhóm phương pháp trở nên phổ biến phương pháp TRAP (Total pcroxy radicai trapping antioxydant parametcr assay- Định lượng thơng sớ chống oxh: tổng gốc peroxyl bị bẫy), Dịch sinh học ủ với AAPH, chúng bị phân huỷ tạo thành gốc peroxyl: RN-NR —N2 + 2RR * + —► RO2* Gốc R02' phản ứng với chất chống oxh dịch sinh học: chúng bị suy giảm gốc ROỊ* cơng phân tử lipíd (lipid có dịch sinh học lipid thêm vào dung dịch) gây tượng pcroxyd hố Bằng cách xác định thời gian ban đẩu trước xảy tượng pcroxyd hố (xác định thơng qua việc định lượng thể tích 02 giảm) so sánh với mẫu có thêm eMt chống QXỈ1 dã biết (thường sử dụng cấc chất tan nước có hoạt tính giống vit E Trolox C) giá trị TRAP biểu thị số micro mol gốc 33 peroxyl bị bẫy có lít dung dịch Một phân tử Trolox c bẫy gốc R02* Giá trị TRAP cua huyết tương người vào khoảng lmM ROj' bị bẫy trơng lit, trơng đố giắ trị TRÂP cửa ufàl khơẩng 35-65%, giấ líị TRAP cùa protein huyết tươntĩ khoang 10-50%, ascorbat tới 24% vitamin E từ 5-10% Tuy khỏng thể xác địnli khả nang chống oxh tồn thể thơng qua giá trị TRAP, giá trị khơng xác định tồn thành phần Bởi 02 khơng suy giảm hồn tồn q trình xác định giá trị TRAP gốc R\ yếu tố trung gian sinh từ AAPH, phản ứng với mót vài chất chống oxh khác Hiộn có vài phương pháp TRAP khác Một số chúng sử dụng ỉipiđ hồ tan gốc R0 2* hình thành Một số khác sử dụng phương pháp thích hợp để phát tăng cường phát quang (luminol-enhanced chemiluminescence ) Trong hai phương pháp định lượng dựa sở phycoerythrin ABTS , lần đcu cho thấy Urat đóng vai trồ chủ ỵếu lổng hoạt tính chống oxh huyết tương Trong nước bọt người, nồng độ albumin thấp lượng Ascorbat thấp có - 10 micro mol, Urat đóng vai trò chất chống oxy hố chủ yếu Mặt khác dịch não tuỷ (CSF), nồng độ ascorbat cao gấp lổn so với nồng độ ascorbat máu lượng Urat CFS lại thâp so với lượng Urat có máu, ascorbat khơng phải chất đóng vai trộ yếu việc xác định giá trỊ TRAP, tổng giá trị TRAP dịch não tuỷ thấp giá trị TR AP huyết tương 2.3.2- Phương pháp định lượng ABTS in vitro: [14] [18] Năm 1993, Nicholar J.Miller cộng trình bày phương pháp 34 có màu xanh da trời, có phổ hấp thụ bước sóng cực đại 600, 734 820 nm ABTS hợp chất gốc Nitro trung tâm, viết tắt chất [2,2-azino bis-(3- Êtfrylben?x3lhiazoline^sunfonie acid)] ủ hệ eố peroxiđasẽ (như metmyoglobin) H202 sinh gốc ABTS“ bền Ngồi ra, hệ có gốc tự OH*, LOO‘, LO* gốc vơ khác có thc phản ứng với ABTS tạo cation gốc ABTS Những chất chống oxh huyết tương gồm; glutathion, vìtamin E, vỉtamỉn c, manitol, acid uric tồn mẫu nhiều hay tỷ lê với độ ức chế chất màu tạo Khi hệ đo có chất chống oxh, chất cho hydro lượng catỉon gốc ABTS+’ bị giảm xuống Những chất chống oxh huyết tương gồm: ascorbat, thiolprotcin, bilirubin, urat ơơoccr Những chất có khả nảng phức hố với Fe2+, Cu2+ ceruloplasmin, transferin, đóng góp vào khả chống oxh tồn phẩn Năm 1995-1996, M.B.Amao cộng cải tỉến phép đo hệ ABTS/ H202/ peroxidase CU cải ngựa, có mặt acid ascocbic antioxiđant khác Phương pháp ứng dụng xác định hoạt tính TAS dịch nước ép hoa Từ nhiều tác giả ứng dụng phương pháp để đo TAS huyết tương Trolox 35 “:Xác định bàng cách so sánh với Trolox tương đương với chống oxh Trolox (Trolox equivalent antioxidant capacìty-TEAC) 2.33= Phương pháp S.G ỈUagodorap [4] Đây phương pháp in vitro để đánh giá hoạt tính chống oxy hoấ, Trong phương pháp này, người ta chọn cư chất p -carotene, acid oleic, làm chất oxy hố Dựa vào màu thêm chất chống oxy hố để làm đánh giá hoạt độ chát chống oxy hố chất đem thử Blagodorop cộng sử dụng Tween 80 lâm chất oxy hố, với cố mặt muối sắt ìĩ, acỉđ ascorbic khổng khí để tỉến hành phắn ứng Phương pháp áp dụng với ngun tấc: Tiến hành peroxyd hố acid béo chưa no nhiệt độ định Sau khoảng thời gian phản ứng tạo MDA MDA phản ứng với acìd thiobarbiturìc tạo phức màu hổng hấp thụ cực đại bước sóng 532 nm Đo cường độ màu biết lượng MDA mẫu đo Ở Việt Nam, phương pháp áp dụng rộng rãi GS Đàm Trung Bảo T.s Nguyễn Quang Thường số tác giả đo hoạt độ chất chống oxy hố sổ thuốc chống viêm, thuốc bảo vệ gan, thuốc chống lãohố [1] 2.3.4- Phương pháp xác định hoạt độ chống oxy hố xác định sơ ìod [4] Tween 80 polysorbat thành phần chứa nhiều acid béo, chủ yếu acid oleic Acid đặc trưng chí số iod (chỉ số iod số gam iod tác dụng với 100 gam chất cần thử) chọn Tween 80 làm chất oxy hố thỉ sau q trình peroxy hố mạnh, số nối đơi acid oleic bị cắt giảm, số iod bị giảm Dựa trcn sở này, người ta dầ đề suất “phương phấp sáe định hơạt đệ chất ehống osy hố 50 iođ” vói ngun tắc sau: 36 Tiến hành peroxy hố Twccn 80 nhiệt độ íhời gian định (thí nghiệm tiến hành lọ màu nâu), acid oleic Tween 80 bị cắt giảm dây nối đồi, sổ iod acid oieic bị giảm Ta xác định ehỉ số iod Tween 80 sau phản ứng peroxy hố eho vầ khơng ehe ehất cần thử Từ đố, xác định hoạt độ chất chống oxy hố chất cần thử 37 BẢN LUẬN 4- Phương pháp định lượng trực tiếp gián tiếp nghiên cứu từ lâu; gần đây, người ta nhắc đến phương pháp xác định tổng hoạt tính CCƠXH Và dể xẩc định hoạt lỉnh chống oxh dịch sinh học thể phương pháp lựa chọn tối ưu Khi áp dụng phương pháp SG Blagodorop làm thực nghiệm thuốc đơng dược (ví dụ loại hồn tục vị khác nhau), người ta nhận thấy: màu tất mẫu thử khơng đồng khơng có màu hồng mẫu đối chứng (màu phức tao phản ứng MDA với acid thiobarbituric) Khi đo quang thấy mật độ quang mẫu chứng thấp nhiều so với mẫu thử, mà theo lý thuyết lẽ phải cao Như dung dịch thử có nhiều chất phản ứng với acid thiobarbituric ngồi MDA, chất đổ tương tác với chất thành phần hỗn hợp ủ Vì màu tạo khơng dồng với màu phức MDA với acid thiobarbituric, khơng thổ đo hoạt tính CCOXH hồn lục vị phương pháp Do đó, phương pháp chưa thể áp dụng cho tất thuốc đơng dược điều kiện có, nhiên khắc phục phương pháp xác định số iod 4- Để chống q trình oxh tạo gốc tự gây bệnh tật gây lão bố cho thể cần: > Bảo vệ sức khoẻ, phòng bệnh tật, chống lão hố- kéo dài tuổi thọ * Bảo vệ mồi trường, giữ cân sinh thái để góp phần hạn chế gốc tự sinh tác động từ bên ngồi vào thể Cấc tác động tăng gốc tự thể từ mơi trường ỏ nhiễm: Tia phóng xạ, xạ lượng cao Chất phi sinh học, kim loại nặng * Bảo vệ nội mơi sạch, giảm gốc tự do: từ bỏ thói quen tự gây dộc uống rượu, hút thuốc, nghiện ma tuỹ, sống bng thả * Dinh dưỡng hợp lý khoa học: - Đủ chất bản: Protiđ, Lipid, Glucid 38 I - Đủ vi chất: ngun tố vi lượng, vi chất chống oxy hố vitamin chống oxy hố (E, A, C), Flavonoid, Carotenoid qua lương thực, thực phẩm, rau * Chống mm vật lý (thể chất), tâm lý (tinh thẩn) để tránh ẵteẳ§ oxy hoi > Sử dụng hệ thống chống gốc tự thuốc gồm ba nhóm: Nhóm chất biết rỏ cấu tạo phân tử chế tác dụng (Enzym, coenzym, chất, vitamin E); Dược liệu chế phẩm lừ dược tiêu có hoạt tính chống oxỵ hố; Hormon (Melatonin/íuh tùng; GH (grow hormon)/(uyến n; Testostcron; Oestrogcn) * Nghiên cứu thuốc thẽơ cỡ che chống gốc ĩự ểơ, hõặc tậơ R* dỉệt tế bầơ ung thư KẾT LUẬN Đã viết tổng quan vé gốc tự hệ chất chống oxy hố thể, tư nhiên Đã hệ thống hố ngun tắc phương pháp định lượng trực tiếp chất COXH: £*-tocoferol, vit c, Se, cur, carotene licopen; phương pháp định lượng gián tiếp phương pháp định lượng lổng hoạt tính COXH ĐỀ XUẤT Tiếp lục nghiên cứu phương pháp mới, hiệu việc dinh lượng chất có hoai tính COXH để đánh giá xác ảnh hưởng tác nhân gây bệnh qua đó, nâng cao hiệu thuốc điều trị bệnh gây gốc tự 39 CÁC TÀI LIÊU THAM KHẢO TÀỈ ƯỆUTỉẾNGVỈỆr Đàm Trung Bảo, Nguyễn Quang Thường (1995,1, Một số kết phương pháp xác định hoạt tính chơng oxy hố nghiên cứu thuốc, Báo cáo đề tài nghiệm thu cấp Bộ Y lé,Dược điển Việt Nơm nu Tr Hồng Minh Châu,Từ Vặn Mặc, Từ Vọng Nghi (2002); CơsởHố học phân tích Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, chương 14 (trang 219-250) Mai Khánh Chi (2000), Góp phần hồn thiên kỹ tht đo hoạt tính chống oxy ỉiố invìvo, Khố ln tốt nghiêp DS ĐH, Giáo trình Bài giảng Dược Liệu Tập /, Trường ĐH Dược Hà Nội Giáo trĩnh Dược ỉ âm sàng, Trường Đại Học Dược Hà Nơi Giáo trình Hố phân tích - Tập ỉỉ, Trường Đại Học Dược Hà Nội Lê thị Cẩm Hương (1998), Nghiên cứu phương pháp xác đinh hoạt dồ 12 PGS.TSKH Lê Thành Phước (2007): Chun đê “Gốc tự chất chống oxy hố Y-Dưực”, Trường Đại Học Dược Hà Nội 13: Yũ Thị Phương Thảo (2002); Tổng quan véseletỉ dạng thuốc chứa selen, Luận văn tốt nghiệp DSĐH, Trường ĐH Dược HN 14 TS.Nguyẽn Quang Thường (2003); Nghiên cứu ứng dụng số phương pháp xác định gổc tự chát chổng oxy hố thể, Trường Đại Học Dược Hà Nội 15 Nguyẻn Ngọc Tuấn (1996), Đánh giá hàm lượng ngun tốiod, Thiiỷ ngai} Va ÂSêĩĩ sỗ đấi tượng ĩnồi trường phirơn g pháp kích hoạt nơtron, Luận án PTS khoa hố học, ĐH KHTN, ĐH Quốc Gia Hà Nội 16 Nguyễn Tường Vi (2007) Nghiên cứu thành phần hố hạc riêu chuẩn hố chất lượng dầu gấc Việt Nam, Tr 7~8 17 Viện kiểm nghiệm (1979), Định lượng vitamin, Tr 5-32; 290-295 TẦIUỆƯTIẾNGANH 22.Collins, A., Dusĩnska, M., Pranklin, M„ Somorovska, M., Petrovska, H., Duthie, s., Fillion, L., Panaỵiotidìs, M., Raslova, K and Vaughan, N (1997a) ,Comt mmy ỉn Immcm biomonừat ing síudiẽs: reỉỉabiỉity, valìdation, and appỉìcations ,Environmental and Molecular Mutagenesis 30,139-146 23 Collins, A.R., Dusinská, M„ Gedik, C.M and Stetina, R (1996),Oxidative damage to DNA: we have a relỉabỉe biomarker?,Environmental Health Perspectives 104(suppl.3ị, 365496 24 Collins, A.R., Raslova, K., Somorovska, M., Petrovska H„ Ondrusova, A., Vohnout, B-, Fabry, R and Dusỉnska, M (1998b) ,DNA damage in dỉợbetes; correỉation with a ciinỉcal marker , Free Radicaỉ Biology and Međicine 25, 373-377 25.CoỊỊịns, À.R., SJ.J ẸHỊịon, L.J Fedik, C.M., Vaughan, N and \Vnpd, S.G (1997b) ,Oxidative DNA damage in human cell.s: the infỉuence of antioxidants and DNA repair , Bíochemical Society Transactions 25, 326-331 26.Collins A.R., Gedik, C.M., Olmedilla, B-, Southon, s and Bellizzi, M (1998c) yOxidatìve DNA damage measured in human lymphocytes; large ảifferences behveen sexes and behveen conunbies and correỉatỉons with heart disease mortalỉty rates, FASEB Journaỉ 12, 1397-1400 27.Dandona, p., Thusu, K., Cook, s Snyder, B., Makowski, J., 28.Emest Beuiter (1975), Red celỉ metabolỉsm: A mamưd ỡf biochemical methods.,Grume & Stratton InC., New York,p.p.ố9-73 29.Frank Tietze (1969) Mĩymtic meĩhod for quantitatìve determinaiion of nanugram amounts of íotal and oxidiĩed glutathion :Applications to mammalian blood and other tissues.Analytical Biochemystry.27 , p.p.502-522 30.Gcrald Liiwack volumc 76 Vitamins and hormones 31.Halliwell,B.and Gutteridge,J.M.C(1989), Pree Radicưh in Bioỉogy ,2 ẽđiĩ Cíarênđõn Prêss,Oxfơfd ,pp,ỈS2-lS6 32.Hazenton G.A.& Lang A.c (Ỉ9S0),Gỉutathion contents of lissues in the aging mơH.ve.Biochem, J_,l 88,No 1, p.p.25-30.“ Free Radical in Biology”, Academic Press New York 1982 33.Ireon, C.R.et a].s(2002) Metabỡỉism ữf the cancer chemopreventive agent curcumìn in human and rat ìntestine Cancer Epidemiol Biomarkers and Prev 11(1): 11-105.] 34.Joe B, vìjaykumar M, Lokesh BR, (2004) Bìoỉogical pmperties of curcumin-ceỉỉular and molecular mechanisms of actìon 97-111, 35.joumal of Inorganic Biochemistry 99 (2005) 2217-2225 www.elsevier.com/locate/iinorgbio 36.Mahfouz, M.M., Kawano, H and Kummerow, F.A (1997) MỆects of choỉesterol-vich diets with and without addêd vitamins E and c on the 38.Nazlin k.howeỉland suhur saeed, Free Radìcaỉ in Bỉology Trường khoa học sinh học, Đại học Surrey Guildlbrd, A nh M Qyvind M= Antoẽỉh Kẽĩinelh K Markham (2006); FỈ(iwnokỉchemistry biochemistry appUcations 40.Skoog D.A.,Wesí D.M., Holler F.J (1996) undamentaỉs of Anaỉytica Chemistry, 7th edition,Chapter 21 ,p.p.-460-494 4l.Siĩiith, T.L and Kuminerow, F.A (1989) ,Effect of đỉetary vitamin E on plasma lipỉds and atherogenesỉs in restrỉcted ovulator chickens ,Alherosclerosis 75, 105-109 42.The Alpha-Tocopherol Beta-Caroiene Caneer Prevention Sỉudy [...]... 95:5 Định lượng các hợp chất này bầng sắc ký lớp mỏng (TLC) 2 ỉ 5.2- Phương pháp quang phổ Tiêh hành tách curcumin bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng với hệ 2.22.2.1- Các phương pháp đo gián tiếp các chất chống oxy hoá Phương pháp cộng hưởng từ điện tửịNMR) và bẫy gốc (ESR) [14] * Quang phổ cộng hưởng từ điện tử là kỹ thuật phân tích đo trực tiếp các gốc tự do, từ đó suy ra hoạt tính các chất chống oxy. .. rất lâu Một số chất đã được chiết xuất từ thiên nhiên ở dạng tinh khiết Một số chất lại được bán tổng hợp từ các hợp chất hoá học Cấu trúc, tính chất, các phương pháp định tính, định lượng của các chất này đã được xác định khá rõ và được ghi trong hầu hết các dược điển và bách khoa toàn thư Tuy nhiên, còn rất nhiều các chất chống oxy hoá khác chưa được biết đến Tính chất và khả năng chống oxỵ hoá chưa... khăn hơn các nghiên cứu riêng biệt và xác định từng thành phần có trong hẹ chất chống oxy hoá Phương pháp định lượng đẩu tiên trong nhóm phương pháp này và hiện nay đã trở nên phổ biến là phương pháp TRAP (Total pcroxy radicai trapping antioxydant parametcr assay- Định lượng thông sớ chống oxh: tổng gốc peroxyl bị bẫy), Dịch sinh học được ủ với AAPH, chúng bị phân huỷ tạo thành các gốc peroxyl: RN-NR... atocoferol tổng hợp được dùng làm chất mẫu 2.1 J 7 - Đinh lượng tocoịerol hằng phương pháp oxy hoá khử theo M.Koýỉer Tocoferol ỉà chất dẻ bị oxh, cho nên cứ thể định lượng bằng phương pháp oxy hoá khư Nhiều tác giả khác nhau đã dùng hàng loại các chất để làm thuốc thử oxh Một trong những phương pháp đẩu tiên định lượng tocoíerol đã được P.Karrer và H.Keller nghiên cứu, dựa trên cách định lượng bàng... lập các chất này không phải lúc nào cũng thực hiện được Quá trình định lượng chúng gặp rất nhiều khó khãn Trong trường hợp đổ, các nhà dược học thường định lượng hoạt tính sinh học của chúng một cách gián tiếp qua hệ enzyme hoặc các chỉ số sinh hoá Do vậy, định lượng các chất chống oxỵ hoá và hoạt tính sinh học của nó thường sử dụng 3 phương pháp lớn là: Định lượng trực tịếp có sử dung các phương pháp. .. Ịỷ hóa học, và hoá Ịỷ (phượng pháp này áp dụng cho các chất đã phân lạp); phương pháp đo gián tiếp qua hoạt tính enzyme và chỉ số sinh hoá; và phương pháp đo tổng hoạt tính chống oxy hoấ 2.12.1.1- Định lượng trực tiếp -sử dụng các phương pháp hoá lý a - Tocoferol [17] [30] [36] [41] [42] 2.1.1.1- Phương pháp đọ quang Các a -tocoferol (AT) có phổ hâp thụ đặc hiệu trong vùng tử ngoại Phổ của tất cả các. .. xác định AT có cực đại hấp thụ đạc trưng ở vùng 258-300 nm Phương pháp đo bảng quang phổ có thể dùng để định tính và định lượng các tơcoíerol trong các chế phẩm dược chế tạo từ tocoĩerol tông hợp, vì vậy phổ hấp thụ tử ngoại của ÀT và họ chất acetat của nó đã dược đưa 15 M.Koĩlcrcũng dùng phương pháp quang phổ để định lượng AT trong máu 2.1.1.2- Phương pháp cực phổ Phương pháp đo bằng cực phổ các tocolerol... Đo các chất chốngperoxide GSH vổ GSỈỊPx [14] [291 [32] Trong hệ thống chống peroxide có hai chất chống oxy hoá quan trọng là GSH và GSHPx Có nhiều phương pháp xác định hai hợp chất trên như chuẩn độ ampc kế, cực phổ nhtmg đặc hiệu và nhạy nhất là nhũng phương pháp được giới thiệu dưới đây 2.2.6 ỉ -Xác định GSHPx theo phương pháp do quang của H.V.Bergmeyer Người ta dựa vào sụ biến thiên độ hấp thụ quang... loại bỏ các peroxid lipid Vì vậy sclcn là chất chống oxh gián tiếp của hệ chống peroxid Các phương pháp đo selen đã được trình bày ở mục 2.1.4, 2.3- Định lượng hoat tính chống oxy hoá toàn phẩn 2.3.1- Phương pháp TRÁP [18] Gán đây người ta nhắc nhiều đến khái niêm tình trạng chống oxh toàn phần -TAS (Total Aniìoxiđant Status) Đã có một vài nghiên cứu tiến hành đánh giá tổng hoạt tính chống oxy hoá... vầo phần đuôi phan ấnh số lượng tần suất đoạn gẫy ADN, thường trên một khoảng từ một vài trăm đoạn gầy/ tế bào đến vài nghìn 2.2.42- Định lượng trực tiếp 8-oxo-deoxyguanosỉn trong ADN bằng HPLC [18] [21] [22] [23] [24] [25] Một phương pháp nữa để định lượng tổn thương ADN oxy hoá là định lượng trực tiếp 8-oxo-deoxyguanosin trong ADN đã bị thuỷ phân bằng cách sử dụng phương pháp HPLC phát hiện bằng detcctor ... định ỉuợng gốc tự cẩc chất chống oxy hố sỉnh học y dược học Để có cách nhìn hệ thống tồn cảnh phương pháp định lượng này, chúng tơi thực đề tài: “Tong quan phương pháp định lượng chất chống oxy. .. tiêu: Viết tổng quan vê gốc tự hệ chất chống oxy htìá thể, tự nhiên Hệ thơng hố ngun tắc phương pháp định lượng cức PHẦN 1: ĐẠI CƯƠNG VỀ CÁC CHẤT CHốNG OXY HỐ VÀ CÁC HỆ CHẤT CHỐNG OXY HOẨ TRONG... chất chống peroxide GSH GSHPx 2.2.6.3“ Định lượng GSH phương pháp so màu 2.2.7- Đo hàm lượng selen 2.3- Định lượng hoạt tính chống oxy hố tồn phần 2.3.1- Phương pháp TRAP 2.3.2- Phương pháp định