HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY CHỦNG NẤM SỢI Penicilium oxalicum SINH TỔNG HỢP ENZYME CHITINASE ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ ĐẤT NGUYỄN THỊ HÀ Trường i h Cần Th Nhiều enzyme quan trọng khai thác từ vi sinh vật ứng dụng rộng rãi đời sống sản xuất, vi sinh vật chiếm khối lượng lớn có khả chuyển hóa vật chất tự nhiên hữu hiệu Khi so sánh với nguồn enzyme khác có nguồn gốc từ động vật thực vật, enzyme có nguồn gốc vi sinh có nhiều ưu điểm hoạt tính cao, thời gian sinh tổng hợp ngắn, nguyên liệu sản xuất rẻ tiền, sản xuất theo quy mô công nghiệp Nhiều enzyme khai thác từ vi sinh vật tập trung nghiên cứu ứng dụng thời gian qua protease, amylase, cellulase, pectinase Bên cạnh có nhóm enzyme chitinase có khả thủy phân lớp vỏ chitin loài giáp xác đặc biệt quan tâm Bài báo trình bày số kết tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy chủng Nấm sợi phân lập từ đất thành phố Cần Thơ nhằm tạo nguồn chitinase với hoạt tính cao I VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Các chủng Nấm sợi phân lập từ đất thành phố Cần Thơ Phương pháp Kiểm tra hoạt tính chitinase chủng Nấm sợi phân lập phương pháp đo đường kính vòng vô khuẩn Khảo sát ảnh hưởng yếu tố thời gian nuôi cấy, nhiệt độ, ẩm độ, hàm lượng muối, độ pH, chất đến khả sinh tổng hợp chitinase nấm sợi Chọn yếu tố có ảnh hưởng đáng kể lên khả sinh tổng hợp chitinase chủng Nấm sợi nghiên cứu để tối ưu hóa theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm II KẾT QUẢ Phân lập số chủng Nấm sợi có khả sinh tổng hợp chitinase Đã phân lập 70 chủng Nấm sợi tiến hành nuôi cấy chủng môi trường nuôi cấy nấm sợi ngày Tiến hành khảo sát khả sinh tổng hợp enzyme chitinase phương pháp đo đường kính vòng phân giải Kết nghiên cứu cho thấy có 10 chủng Nấm sợi thể hoạt tính chitinase trình bày bảng ng Đường kính vòng phân giải chitin 10 chủng Nấm sợi nghiên cứu TT Tên Đường kính vòng phân giải (cm) TT Tên Đường kính vòng phân giải (cm) 4,0 NB62 2,5 4m 2,7 NB63 5,5 BM11 2,0 NB64 2,2 LX31 1,5 OM11 3,5 NB61 6,5 10 TN11 1,7 Chủng NB61 có đường kính vòng phân giải cao (6,5cm) chọn để nghiên cứu tiếp 1001 HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ Khảo sát đặc điểm hình thái định danh chủng NB61 * Đặc điểm hình thái chủng NB61: nh nh h i i th vi th c a ch ng n m NB61 * Định danh phương pháp sinh học phân tử: Chủng nấm sợi NB61 nghiên cứu định danh đến loài theo phương pháp sinh học phân tử Trình tự gene nhận được phân tích so sánh với gen biết sở liệu trang eb NCBI sử dụng chương trình BLAST CCCACCCGTGTTTATCGTACCTTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCTCAGGCCGCCGGGGGGC ATCCGCCCCCGGGCCCGCGCCCGCGAAGACACAAAAACGAACTCTTGTCTGAAGATTGCA GTCTGAGTACTTGACTAAATCAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCAT CGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATC GAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTC ATTGCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGCTCTCGCCCCCCGCTTCCGGGGGGCGG GCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTCGTCACCCG CTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCCCGCCGGCGAACACCATCAATCTTAACCAGGTTGACCTC GGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA Đối chiếu trình tự DNA với trình tự DNA chủng NS từ ngân hàng gen NCBI cho thấy tỷ lệ tương đồng với loài Penicillium oxalicum cao (90%) Kết hợp kết phân tích hình thái sinh học phân tử, chủng Nấm sợi NB61 thuộc loài Penicillium oxalicum Ảnh hưởng số yếu tố môi trường đến trình sinh tổng hợp chitinase Penicillium oxalicum Hoạt tín h enzyme (U/mg ) - Ẩm độ môi trường nuôi cấy: 1.40 1.20 1.20 1.00 0.81 0.80 0.50 0.60 0.40 0.49 0.31 0.20 0.00 50% 60% 70% 80% 90% Ẩm độ (%) Hình Bi 1002 bi u th nh hưởng c a ẩ lên kh inh hi ina e a P oxalicum HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ Biểu đồ hình cho thấy, nấm P oxalicum phát triển tốt môi trường có ẩm độ 80%, hoạt tính enzyme chitinase đạt cao (1,20U/mg protein), khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức khác, ẩm độ thấp (50-70%) nấm mốc không phát triển tốt, hoạt tính enzyme thấp Ở ẩm độ cao (> 80%), lượng nước dư môi trường nuôi cấy làm hồ hoá với chất kết chặt môi trường lại làm độ xốp, thoáng khí môi trường đồng thời gây khó khăn cho khuẩn ty phát triển Điều cho thấy độ ẩm ảnh hưởng lớn đến trình phát triển sinh tổng hợp enzyme chitinase nấm P oxalicum Hoạt tính en zyme (U/mg ) - Ảnh hưởng nồng độ NaCl 1.12 1.20 0.90 1.00 0.87 0.85 0.80 0.60 0.40 0.29 0.20 0.00 0% 2% 4% 6% 8% Nồng độ muối (%) Hình Bi bi u th nh hưởng c a n ng mu i NaCl n kh inh hi ina e a P oxalicum Kết thí nghiệm hình cho thấy, chủng Nấm sợi P oxalicum sinh tổng hợp chitinase tốt nồng độ NaCl môi trường nuôi cấy 2%, hoạt tính enzyme thu nhận 1.12 U/mg protein, tăng gấp khoảng lần so với đối chứng không bổ sung NaCl Tuy nhiên nồng độ muối tăng 2% khả sinh tổng hợp enzyme P oxalicum lại giảm xuống Điều cho thấy khoáng Na+ cần thiết cho phát triển P oxalicum sinh tổng hợp enzyme chitinase - Ảnh hưởng hàm lượng chitin: 1.49 Ho ạt tính enzyme (U/mg) 1.60 1.40 1.20 1.00 1.08 0.96 0.83 0.80 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00 0% 5% 10%3 15%4 20%5 Hàm lượng Chitin (%) Hình Bi bi u th nh hưởng c a h ng chitin n kh inh hi ina e a P oxalicum Hoạt tính chitinase P oxalicum tăng dần hàm lượng chitin tăng đạt cực đại 1,49 U/mg hàm lượng chitin bổ sung 10%, nhiên hàm lượng chitin cao lại ức chế khả sinh enzyme nấm 1003 HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ H oạ t tín h e nzym e (U/ mg ) - Ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy: 1.40 1.18 1.20 1.00 0.93 0.80 0.60 0.52 0.40 0.32 0.27 5.5 6.0 0.20 0.00 4.0 4.5 5.0 pH môi trường Hình Bi bi u th nh hưởng c a i rường n kh inh hi ina e a P oxalicum Về ảnh hưởng pH, qua biểu đồ hình cho thấy, trình sinh tổng hợp enzymes không đạt hiệu cao tăng độ pH môi trường nuôi cấy Ở giá trị pH lớn 5,5 6,0 hoạt tính (U/mg protein) enzyme nấm sợi sinh tổng hợp không cao Tuy nhiên trình sinh tổng hợp diễn mạnh pH 4,0 đạt cao pH 4.5 với hoạt tính riêng enzyme ghi nhận đạt cao 1.18 U/mg Ở giá trị pH từ 5-6, hoạt tính enzyme giảm mạnh, điều chứng tỏ yếu tố pH môi trường có ảnh hưởng vô quan trọng đến khả sinh tổng hợp enzyme nấm sợi P oxalicum - Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy: Hoạt tính enz yme (U/m g) 1.20 1.00 0.90 0.96 0.80 0.60 0.40 0.29 0.20 0.05 0.00 Thời gian nuôi cấy (ngày) Hình Bi bi u th nh hưởng c a y u t thời gian nuôi c y n ho t tính enzyme chitinase c a n m s i P oxalicum Biểu đồ xác định hoạt tính riêng enzyme thu nhận theo thời gian (hình 6) cho thấy P oxalicum có khả sinh tổng hợp chitinase mạnh từ lúc bắt đầu nuôi cấy hoạt tính riêng enzyme thu đạt cao 0.96 U/mg vào ngày thứ chứng tỏ nấm mốc dễ thích nghi với môi trường bắt đầu diễn phản ứng sinh hoá sử dụng chất dinh dưỡng môi trường để sinh trưởng phát triển Sang ngày thứ hoạt tính riêng enzyme bắt đầu giảm mạnh trình sinh tổng hợp enzyme kết thúc nguồn dinh dưỡng từ môi trường cạn 1004 HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ Hoạt tính enzyme (U/mg) - Ảnh hưởng nhiệt độ môi trường nuôi cấy: 1.80 1.60 1.40 1.20 1.00 1.65 1.35 1.30 0.79 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00 0.62 25oC 30oC 35oC 40oC 45oC Nhiệt độ môi trường (oC) Hình Bi bi u th nh hưởng c a nhi i rường nuôi c y n kh inh hi ina e a P oxalicum Biểu đồ thể ảnh hưởng yếu tố nhiệt độ môi trường nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp enzyme chitinase chủng Nấm sợi P oxalicum (hình 7) cho thấy sinh tổng hợp enzyme đạt hiệu cao (hoạt tính riêng enzyme cao 1,65 U/mg) nuôi cấy 40oC Quy hoạch thực nghiệm tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy chủng Nấm sợi P oxalicum sinh tổng hợp chitinase cao Từ kết cho thấy yếu tố ẩm độ, pH nhiệt độ có ảnh hưởng mạnh đến khả sinh tổng hợp enzyme nấm sợi Do đó, ba yếu tố môi trường là: m độ, nhiệt độ pH chọn để tiếp tục nghiên cứu thí nghiệm khảo sát tối ưu ng Sơ đồ kết bố trí thí nghiệm thực nghiệm Các yếu tố theo tỷ lệ thực HTR enzyme Các yếu tố theo tỷ lệ m hóa TN Z1 Z2 Z3 X0 X1 X2 X3 Y 45 85 1 1 1.568 35 75 -1 -1 1.484 45 75 1 -1 1.373 35 85 -1 1 1.705 45 85 1 -1 1.589 35 75 -1 -1 -1 1.624 45 75 1 -1 -1 1.776 35 85 -1 -1 1.654 40 80 4.5 1.092 10 40 80 4.5 1.108 11 40 80 4.5 1.138 1005 HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ Từ số liệu thí nghiệm, ta xác định hệ số hồi quy Sau loại bỏ hệ số ý nghĩa phương trình hồi quy có dạng: Y = 1.597-0.064X3-0.042X1X3 + 0.071X2X3 Từ phương trình hồi quy nhận thấy muốn tăng giá trị hoạt tính enzyme chitinase nấm sợi P oxalicum cần phải tăng giá trị ẩm độ, giảm nhiệt độ pH môi trường nuôi cấy Do đó, tiếp tục nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy môi trường phương pháp đường dốc mức sở Chọn bước nhảy ẩm độ, nhiệt độ 0.2 pH môi trường Kết trình bày bảng ng Kết nuôi cấy P oxalicum theo phương pháp leo dốc TT Nhiệt độ Ẩm độ pH môi trường HTR enzyme chitinase 40 80 4.5 1.520 38 82 4.3 1.603 36 84 4.1 1.824 34 86 3.9 1.548 32 88 3.7 1.515 Số liệu bảng cho thấy, điều kiện nuôi cấy môi trường bán rắn tối ưu cho nấm sợi P oxalicum sinh tổng hợp enzyme phân giải chất chitin là: Môi trường có ẩm độ 84%, độ pH môi trường 4.1, chất cảm ứng chitin 10%, nhiệt độ môi trường 36 oC, hàm lượng muối 2%, thời gian nuôi cấy 48h III KẾT LUẬN Trong 70 chủng Nấm sợi phân lập từ đất thành phố Cần Thơ có 10 chủng thể hoạt tính chitinase, Penicillium oxalicum có khả sinh tổng hợp enzyme chitinase cao Các yếu tố môi trường như: m độ, độ muối, nhiệt độ, hàm lượng chất cảm ứng chitin, thời gian nuôi cấy, pH môi trường có ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp enzyme chitinase nấm sợi P oxalicum, ba nhân tố ẩm độ, pH nhiệt độ có ảnh hưởng nhiều Môi trường bán rắn tối ưu cho nấm sợi P oxalicum sinh tổng hợp enzyme phân giải chất chitin môi trường có ẩm độ 84%, độ pH 4.1, chất cảm ứng chitin 10%, nhiệt độ 36oC, hàm lượng muối 2%, thời gian nuôi cấy 48h TÀI LIỆU THAM KHẢO Võ Bích Giang, 2005 Thực tập enzyme học, Trường Đại học Sư phạm Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Đức Lượng, 2004 Công nghệ enzyme, NXB Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh, tr.27-108 Nguyễn Đức Lượng, 2003 Thí nghiệm công nghệ sinh học tập 1, NXB Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh, tr 200-250 Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết, 2006 Thí nghiệm công nghệ sinh học tập 2, NXB Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Minh Tuyển, 2004 Quy hoạch thực nghiệm, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, tr.84-100 Pankaj Patidar, Deepti Agrawal, Tushar Banerjee, Shridhar Patil, 2005 Optimisation of process parameters for chitinase production by soil isolates of Penicillium chrysogenum under solid substrate fermentation Process Biochemistry, 40, 2962-2967 Yoon Gyo Lee, Ki-Chul Chung, Seung Gon Wic, Jae Chang Lee, Hyeun-Jong Bae, 2009 Purification and properties of a chitinase from Penicillium sp LYG 0704 Protein Expression and Purification, 65, 244-250 1006 HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ OPTIMISATION OF CULTURE CONDITIONS FOR CHITINASE PRODUCTION BY Penicillium oxalicum ISOLATED FROM SOIL NGUYEN THI HA SUMMARY This paper present results of the research aimed at isolating fungi strains which exposed high chitinase activity and at studying the medium conditions affecting chitinase production of a chosen fungi strain By determination of the halo’s diameters of colonies on culture medium with chitin as a specific substrate, ten fungi strains with high chitinase activity were isolated Among isolated, one strain with highest chitinase production was selected This strain was morphologically and biomolecularly determined as Penicillium oxalicum The suitable conditions for high chitinase production of Penicillium oxalicum were as follows: Humidity of 80%, chitin of 10%, sodium chloride of 2%, 48 h incubation, pH of 4,5 and o temperature of 40 C Also, the interaction of three factors such as pH, temperature, and incubation time were studied The optimum conditions were defined as follows: Humidity of 84%, pH of 4,1 and o temperature of 36 C 1007 ... tổng hợp enzyme đạt hiệu cao (hoạt tính riêng enzyme cao 1,65 U/mg) nuôi cấy 40oC Quy hoạch thực nghiệm tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy chủng Nấm sợi P oxalicum sinh tổng hợp chitinase cao Từ kết... 2%, thời gian nuôi cấy 48h III KẾT LUẬN Trong 70 chủng Nấm sợi phân lập từ đất thành phố Cần Thơ có 10 chủng thể hoạt tính chitinase, Penicillium oxalicum có khả sinh tổng hợp enzyme chitinase cao... nuôi c y n kh inh hi ina e a P oxalicum Biểu đồ thể ảnh hưởng yếu tố nhiệt độ môi trường nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp enzyme chitinase chủng Nấm sợi P oxalicum (hình 7) cho thấy sinh tổng hợp