THĂM DÒ C CHẾ HẠ GLUCOSE HUYẾT CỦA PHÂN ĐOẠN N-HEXAN RẺ CÂY CHÓC MÁU NAM TRÊN TÉ BÀO c VÂN C2C12 Trần Thi Lĩnh' Nguyễn Thu Hằng’, HDKH: Đỗ Thị Nguyệt Quế', Trần Thị Oanh^ ‘Trường Đại học Dược Hà Nội, ^Vụ Khoa học Đào tạo Từ khóa: AMPK, friedeỉan-3l3-oỉ; 21 a,30-dihydroxyfriedelan-3-on; j3-sitosíerol, phân đoạn n-hexan rễ Chóc máu Nam, s cochinchinensis Lour., thu nhận glucose, tế bào C2 Cj2Tóm tắt Trong thể, vân nơi tiêu thụ glucose chính, tăng đưa glucose từ máu vào vân mục đích quan trọng điều trị đái thảo đường Cắn dịch chiết n-hexan rễ Chóc máu Nam (PĐ) với nồng độỉ25,00 250,00 ịxg/mL gây chết 21,82% 28,74% tế bào C2 CJ2 PĐ 20,00 50,00 ịxg/mL không gây chết tế bào C2 CJ2, làm tăng thu nhận glucose vào tế bào C2C¡2- Trong chất chiết tách từ PĐ có P-sitosterol (50,00 Mg/mL) có tác dụng hoạt hóa AMPK, friedeỉan-3ậ-ol 21 a,30-dỉhydroxyfriedelan-3-on tác dụng Đặt vấn đề Đái tháo đường rối loạn chuyến hóa dẫn đến tăng glucose huyết, nhiều biến chứng xem vấn đề cấp bách thời đại Đã có số thuốc điều ứị đái tháo đường (ĐTĐ) hiệu nhiều hạn chế Một số loài thuộc chi Salada sử dụng để điều trị béo phì đái tháo đường số nước giới, Việt Nam, Salada cochinchinensis Lour.(Chóc máu Nam) đồng bào Kata sử dụng để tiêu khát, chống viêm Đỗ Thị Nguyệt Quế cs chứng minh tác dụng hạ glucose huyết dịch chiết methanol toàn phần phân đoạn n-hexan rễ s cochinchinensis Lour, ứên động vật thỉ nghiệm số đích tác dụng thuốc điều trị ĐTĐ đồng thời chiết tách xác định cấu trúc chất có phân đoạn n-hexan friedelan-3/3-ol; 21a,30-dihydroxyfriedelan-3-on Ị5-sitosterol [2], Để tiếp tục tìm hiểu chế tác dụng phân đoạn n-hexan rễ Chóc máu Nam chất tách chiết từ phân đoạn thực nghiên cứu “Thăm dò chế tác dụng hạ đường huyết phân đoạn n-hexan rễ Chóc máu Nam (PĐ) tế bào vân C2 CJ2 ” với mục tiêu: - Thăm dò khả gây độc tế bào C2C 12 PĐ - Đánh giá tác dụng tăng thu nhận glucose tế bào vân C2C 12 PĐ - Đánh giá tác dụng hoạt hóa AMPK chất chiết tách từ PĐ Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu Nguyên liệu Rễ Chóc máu Nam, tên khoa học s cochinchinesỉs Lour Mau tiêu số 9694 lưu Phòng tiêu bản, Viện Dược liệu, cắn phân đoạn nhexandịch chiết methanol toàn phần rễ Chóc máu Nam (PĐ) Các chất chiết tách từPĐ; friedelan-3|í3-ol (SCCl); P-sitosterol (SCC2); 21a,30-dihydroxyfriedelan3-on (SCC3) Tế bào dùng nghiên cứu: Tế bào vân nguyên phát chuột nhắtC2Ci2 cung cấp American Type Culture Collection (clone CRI.1772) Phương pháp nghiên cứu Thăm dò khả gây độc tế bào C2 C12 PĐ Sử dụng kỹ thuật định lượng MTT (MTT assay) [9] Gồm bước sau: - Hoạt hoá nuôi cấy tế bào C2C 12 môi trường DMEM bổ sung 10% huyết bò, penicillin 100 ưl/ml; sứeptomycin 0,1 mg/ml 37°c, 5% CO2 Cấy chuyển vào đĩa 96 giếng Biệt hóa tế bào huyết ngựa 5% 72h - Chia giếng tế bào thành lô, lô giếng, ủ với PĐ (hòa tan DMSO) với nồng độ 20,00 - 50,00 - 125,00 250,00 ^g/niL 48 Tiến hành song song với giếng chứng (chỉ bổ sung DMSO) Thêm 20 ml dung dịch MTT (5 mg/ml) vào giếng, ủ 5h Hút bỏ phần dung dịch thêm 200 fiL DMSO, ừộn để 15 phút Đo quang bước sóng 540 nm máy ELISA Thí nghiệm lặp lại lần điều kiện So sánh mật độ quang lô ủ với PĐ lô chứng để đánh giá ảnh hưởng PĐ đến chức sống tế bào % gây chết tế bào PĐ so với lô chứng tính theo công thức: ^ _ 0 X (OD O D , h^) Trong đó: X: Phần trăm tế bào chết lô thử so với lô chứng (%) ODchứng: mật độ quang lô chứng ODthử: mật độ quang lô ủ mẫu thử Đánh giá ảnh hưởng PĐ đến khả thu nhận glucose tế bào C2C 12 Các bước tiến hành: Hoạt hóa, nuôi cấy biệt hóa tế bào C2C 12 (giống trên) Hòa tan PĐ vào DMSO Chia giếng tế bào thành lô, lô giếng; Lô (lô chứng): bổ sung DMSO; Lô (lô insulin): ủ với insulinO,! ỊiM Lô 2: ủ với PĐ nồng độ 20,00 Mg/mL; Lô 5: ủ PĐ 20,00 /ig/mL; insulin 0,1 liM- Lô 3: ủ với PĐ nồng độ 50,00 ptg/mL; Lô 6: ủ PĐ 50,00 jug/mL; insulin 0,1 ịiM Tiến hành ủ tế bào với mẫu thử ừên Ih 37°c môi trường DMEM chứa mM glucose 0,1% albumin bò Hút 10 /iL môi trưòng giếng tế bào cho vào đĩa 96 giếng có chứa sẵn 200 ¡iL glucose oxydase, trộn ủ tiếp 15 phút 37°c Đo quang bước sóng 492 nm So sánh mật độ quang lô ủ với mẫu thử với lô chứng để đánh giá tác dụng mẫu thử Đánh giả tác dụng hoạt hóa AMPK chất chiết tách từ PĐ Đánh giá khả hoạt hóa AMPK mẫu thử thông qua đánh giá mức độ biểu AMPK phosphoryl hóa phân tử threonin 172 (viết tắt pAMPK) kỹ thuật Western blot Các bước tiến hành sau: Hoạt hóa, nuôi cấy biệt hóa tế bào C2Ci2trong đĩa giếng, ủ tế bào với mẫu thử SCCl, SCC2 SCC3 nồng độ 20,00 50,00 /xg/ml Xác định mức độ biểu p-AMPK iS-actin (protein đối chứng) kỹ thuật Western blot [7] Xử lý số liệu: Số liệu xử lý thống kê theo phần mềm Microsoft Excel 2007 Sự khác có ý nghĩa thống kê p 0,05 > 0,05 Nhận xét: Giá trị mật độ quang đo lô tê bào ủ với insulin lô tế bào ủ với mẫu thử PĐ nồng độ 20,00 50,00 ịig/m\ thấp đáng kể so với lô chứng (p0,05) Tác dụng hoạt hóa AMPK chất chiết tách từ PĐ xế bào sau ủ với SCCl, SCC2, SCC3 nồng độ 20,00 50,00 /xg/ml giờ, thu protein tiến hành western blot, hình ảnh mức độ biểu p-AMPKvà j(3-actin (protein đối chứng) sau: /3 - A c tin : -P-AMPK DMSO Metfor SCCl SCC2 SCC3 SCCl SCC2 SCC3 50 50 50 20 20 20 |ag/mL )ag/mL |ig/mL |ig/mL Ịig/niL |ag/mL Hình Hình ảnh mức độ biểu p-AMPK /3-actin Tỷ lệ mức độ biểu p-AMPK so với |3-actinvà số lần tăng mức độ biểu p-AMPK lô thử so với lô chứng sau: Bảng Phân trăm mức độ biêu 1,60 0,82 1, 11 0,96 1,15 1,40 p-AMPK so với 18-actin 1,20 1,00 % mức độ biểu pAMPK so vói /ỉ-actin Mẩu Lô chứng 128,91 ± 59,05 SCCl 50 ịig/mL 122,51 ± 89,74 SCCl 20 lag/mL 152,07 ±88,47 SCC2 50 ng/mL 148,63 ± 63,00* SCC2 20 p.g/mL 135,18 ±85,01 SCC3 50 ng/mL 92,16 ± 67,79 : p ... chuột nhắt gây ĐTĐ streptozocin, c n ph n đo n n- hexan ph n đo n ethylacetat có tác dụng hạ glucose huyết c n ph n đo n n- hexan có tác dụng mạnh (p