NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP L-DOPA LÀM THUÓC ĐIÈU TRỊ PARKINSON Vũ Đức Hoàn*' Phạm Thị Hiền^ HDKH; PGS.TS Thái Nguyễn Hùng Thu^ PGS.TS Nguyễn Đình Luyện^ 'Abbott laboratories ^Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia - Trường Đại học Dược Hà Nội Từ khóa: 3,4-dihydroxyphenyl-L-alanin, L-dopa, levodopa, L-íyrosin, parkinson Tóm tắt L-dopa thuổc chủ yếu dung điều trị bệnh Parkinson Hiện L-dopa nằm nhóm thuốc chưa sản xuất nước Mục tiêu nghiên cứu tổng hợp L-dopa từ L-tyrosin đạt tiêu chuấn hàm lượng theo Dược điển Anh 2009 Quá trình tổng hợp L-dopa gồm bước sau: Ester hóa L-tyrosin(l) thu L-tyrosỉn methyl ester (9), acyl hóa (9) pyridìn thu 0,N-dỉacyl-L-tyrosin methyl ester (10), thực phản ứng chuyển vị (10) với xúc tác AlClỉ nitrobenzen thu (3-acetyl-4hydroxyphenyl)-N-acetyl-L-alanin (11), thực phản ứng oxy hóa thủy phân (11) thu L-dopa cẩu trúc sản phẩm chất trung gian xác định phương pháp đo phổ ^H-NMR, MS, IR Đặt vấn đề Bệnh Parkinson bệnh lý thoái hóa thần kinh trung ương thường gặp bệnh nhân 60 tuổi Bệnh gây nơron chất đen thân não, nơron chứa chất dẫn ưuyền thần kinh dopamin Nguyên nhân: độc chất, môi trường L-dopa tiền chất chuyển hóa thành dopamin nhờ enzym dopa-decarboxylase Việt Nam L-dopa coi thuốc chủ chốt điều trị Parkinson Do nhu cầu sử dụng L-dopa cao Tuy nhiên, doanh nghiệp nước chưa thể sản xuất L-dopa Nhóm nghiên cứu tiến hành tổng hợp L-dopa từ L-tyrosin (một sản phẩm thu từ trình thủy phân nguồn keratin khác nhau; sừng, tóc, móng ) Đó nguồn nguyên liệu có sẵn Việt Nam Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu Nguyên liệu: L-tyrosin sản phẩm trình thủy phân nguồn keratin khác (lông, sừng, tóc, móng ) Hóa chất: Aceton, acid hydrocloric, acid sunfuric, ethanol tuyệt đối, ether dầu hỏa, ethyl acetat, methanol, natri hydroxid, ninhydrin, pyridin (tinh khiết hóa học - Trung Quốc), anhydrid acetic, hydro peroxid, natri carbonat klian, nhôm clorid khan, nitrobenzen (Merck-Đức), giấy thị màu, nước cất (Tiêu chuẩn sở Việt Nam) Phương pháp nghiên cứu Tổng hợp L-dopa từ L-tyrorin qua giai đoạn sơ đồ sau [1, 2, 5]: ,C O O H COOM e A c ị O / pyridin MeOHmzSq^ 70-80°C /12h (2 ) l0 -4 “C /4h AcO HO (9) (10) A lC lj/nitrobenzen 100 - 125°C/4-6h ,C O O H CO O H H C I/C H C O O H CO O H HjOî/NaOH NHAc -OH (1) HO HO OH COM e - Sử dụng phương pháp hóa học, vật lý, hóa lý để tinh chế thu lấy chất trung gian sản phẩm - Theo dõi phản ứng kiểm tra độ tinh khiết sản phẩm sắc ký lóp mỏng (bản mỏng silicagel GF254 với hệ dung môi n-butanol: acid acetic: nước = 9:2:2,5) - Xác định cấu trúc chất trung gian sản phẩm phương pháp đo phổ hồng ngoại (IR) ghi máy Perkin Elmer (Mỹ) Phổ khối lượng (MS) ghi máy máy Agilent 6310 lon Trap (Đức) Phổ khối lượng phân giải cao ghi máy FT-ICR-MS-Varian 910MS (Đức) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ('H-NMR) ghi máy ghi máy Bruker AV-500 (Mỹ) - Kiểm tra hàm lượng L-dopa theo tiêu chuẩn Dược điển Anh 2009 Kết Tổng họp L-dopa từ L-tyrosin Tông hợp L-tyrosin methyl ester (9) Thực phản ứng ester hóa với 15g (0,083 mol) L-tyrosin với 400 ml methanol, xúc tác acid H 2S0 đặc Hỗn hợp phản ứng hồi lưu 12 Theo dõi phản ứng sắc ký lóp mỏng Phản ứng kết thúc, hỗn họp phản ứng làm mát nhiệt độ phòng, cất thu hồi dung môi Phần lại hòa tan nước, điều chỉnh pH 8-9 dung dịch NaaCOa bão hòa, xuất tủa Lọc thu tủa thô Tinh chế tủa thô 9: hòa tan dung dịch HCl IM, làm lạnh điều chỉnh pH 8-9 dung dịch Na2CƠ3 bão hòa, xuất tủa Lọc, rửa sản phẩm thu 10,86g (2) H=67,2% Sản phẩm; Nhiệt độ nóng chảy 134-136°c, Rf=0,45, IR (KBr, cm“'): 3208 (-NH 2), 3100-3010 (-CHthơm), 2833 (H 3C-), 1731 (-C=0 ester) Tổng hợp o, N-diacetyl-L-tyrosin methyl ester (10) Lấy 18,0 ml pyridin cho vào bình cầu cổ dung tích 100 ml Nghiền nhỏ 5,85g (30,0 mmol) cho vào dung môi chuẩn bị Sau nhỏ từ từ 8,5 ml anhydrid acetic (90,0 mmol) vào hỗn hợp nguyên liệu tan hết cho nhiệt độ không 25°c Khuấy tiếp khối phản ứng nhiệt độ Khi phản ứng kết thúc, thêm vào hỗn hợp phản ứng 100,0 ml ethyl acetat Khuấy chiết với dung dịch HCl IM (3 lần, lần 70,0 ml) để loại pyridin Cuối cùng, rửa nước thu pha hữu chứa sản phẩm Làm khan 10,0g natri Sulfat khan Sau đó, cất thu hồi dung môi đến thu dạng siro Thêm 10 ml ethylacetat khuấy cho tan hoàn toàn, sau thêm 10 ml ether dầu hỏa, khuấy thu kết tủa Lọc, sấy thu 6,2g tủa thô 10 Tủa thô 10 tinh chế sau: Hòa tan hoàn toàn 6,2g tủa thô 10 50 ml ethanol 50% sôi, khuấy 15 phút, sau làm lạnh Để kết tinh lạnh qua đêm, xuất tinh thể màu trắng Lọc, sẩy tới khối lượng không đổi thu 4,2g 10 tinh khiết Sản phẩm 10: Nhiệt độ nóng chảy 105-107°c, Rf=0,88, IR (KBr, cm’’): 3256 (-NH -amid), 1745 (-C=0 ester), 1633 (-C=0 amid), 1558 (-C=C- thơm), ESI - MS (m/z): 301,6 ([M+Na]-") Tổng hợpß-(3-acetyl-4-hydroxyphenyl)-N-acetyl-L-alanin Cho vào bình cầu cổ, dung tích 100 ml: 3,0g (10,75 mmol) nguyên liệu 10 36,0 ml nitrobenzen Khuấy cho tan hết Sau đó, thêm vào bình cầu 3,6g (26,96 mmol) AICI3 khan, hỗn họp đun khoảng nhiệt độ 100130T Hỗn họp phản ứng làm lạnh, thêm 60,0 ml nước đá Khuấy 15 phút tạo hỗn dịch Thêm tiếp 6,0 ml HCl đặc Khuấy 30 phút Chiết hỗn hợp lần ethyl acetat (lần với 100,0 ml, lần với 70,0 ml) Thu lẩy dịch chiết pha hữu Chiết pha hữu NaOH 2N hai lần (lần 11,0 ml, lần 3,0 ml) Thu lấy dịch chiết pha nước Loại nitrobenzen lẫn pha nước 30,0 ethyl acetat Sau pha nước làm lạnh 5°c điều chỉnh pH HCl đặc Để lạnh giờ, 11 bắt đầu kểt tinh Lọc, rửa với nước lạnh thu tủa 11 sấy khô tủa thu l,25g hợp chất 11 Hiệu suất 43,87% Sản phẩm 11: nhiệt độ nóng chảy 146-148°c, Rf=0.61; IR (KBr, cm''): 3355 (-NH-amid), 1726 (-C=0 ester), 1641 (-C=0 amid), 1554 (-C=C- thơm), ESI-MS (m/z): 263,9 ([M-H]') ’H-NMR (500 MHz, DMSO) ô (ppm): 11,82 (IH, s, HO), 8,19 (IH, d (J = 8,0), HN), 7,75 (IH, d (J = 2,0), H Q.), 7,39 (IH, dd (J = 8,0, 2,0), H-Cß.), 6,87 (IH, d (J = 7, 5), H -C O , 4,39 (IH, m, HC - COOH), 3,02 (IH, dd (J = 13,5, 4,5), Hb-Ca), 2,82 (IH, m, Ha-Cj), 2,62 (3H, s, HjC-CO-Ar), 1,78 (3H, s, H 3C-CO-NH) Tổng hợp L-dopa Hòa tan 1,5g (5,66 mmol) nguyên liệu 11 13,0 ml dung dịch NaOH IN Thêm từ từ dung dịch H 2O2 7,1% Phản ứng trì nhiệt độ phòng 24 Hỗn họp phản ứng acid hóa 2,16 ml dd HCl IN, sau cất đến kiệt Chất rắn hoà tan với aceton nóng, phần muối vô không tan lọc qua phễu lọc thủy tinh Dịch lọc cất đến kiệt lần thu tủa thô Hợp chất 12 hòa tan 12,0 ml hỗn hợp HCl đặc acid acetic băng với tỷ lệ thể tích CH 3COOH băng/HCl đặc = 2/1 Hỗn hợp phản ứng đun hồi lưu 118°c vòng cất loại bỏ bớt acid thêm phần nước sôi Dung dịch thêm 0,1 g NaaSaOs 0,3g than hoạt để tẩy màu vòng 30 phút Lọc loại bỏ than hoạt, dịch lọc làm lạnh 0°c đưa pH 5,5 dung dịch NaOH 2N thu Tủa thô lọc rửa với nước lạnh, sau với aceton Sản phẩm sấy khô chân không đến nhiệt độ không đổi Tinh chế sản phẩm: tủa thô hòa tan acid HCl 32%, sau hỗn hợp làm nóng tẩy màu Ig than hoạt Lọc nóng, làm lạnh dịch lọc 5°c điều chỉnh pH 5,5 dung dịch NaOH 2N thu 0,9g Hiệu suất 80,6% L-dopa: nhiệt độ nóng chảy 275-276°C, Rf "= 0,45, IR (KBr, em '): dải hấp thụ 3600-3000 (phenol-OH -NH2), 3076 (-CH thơm), 1730 (-C=0 acid), 1570 (-C=C- thơm), 1254 (-C0- phenol); ESI-MS (m/z): 198 ([M+H]"^); Công thức phân tử: C 9H 11N O Phổ cộng hưởng tò hạt nhân proton: ’H-NMR (500MH z, DíO+CFjCOOD)! ỏ (ppm )ĩ6,65 (1H, d (J = 8,0), H-C 5O, 6,57 (IH, d (J = 1,5), HC 2.), 6,49 (IH, dd (J = 8,0, 1,5), H-CôO, 4,04 (IH, dd (J = 7,0, 5,5), H -C 2), 3,00 (IH, dd (J = 14,5, 5,0), Hb-Ca), 2,87 (IH, dd (J = 14,5, 11,5) Ha-Cj) Giá trị ỗ (ppm) đồng phân D-dopa phổ 'H- NMR [3]: 6,99 (d, J = 8,0), 6,93 (s), 6,83 (d, J = 8,0), 4,43 (dd, J = 7,2, 5,6), 3,32 (dd, J = 14,4, 5,6) and 3,20 (dd, J = 14, 4, 7,2) Từ liệu thu sau phân tích phổ hồng ngoại, phổ khối lượng, phổ cộng hưỏTig từ hạt nhân khẳng định sản phẩm thu LD hay (S)-2-amino-3-(3,4-dihydroxyphenyl)propanoic Kiểm tra L-dopa đạt tiêu chuẩn Dược điển Anh 2009 Kết quả: Hàm lưọng L-dopa đạt 99,4% (đạt tiêu chuẩn Dược điển Anh 2009 từ 99,0- 101,0%) Bàn luận - Phản ứng tổng hợp diacyl từ L-tyrosin methyl ester; Khi tỷ lệ mol anhydrid acetic: L-tyrosin methyl ester tăng hiệu suất phản ứng tăng Nguyên nhân do: phản ứng diacyl nên tỷ lệ mol tối thiểu / , tăng tỷ lệ mol lên 2,25/1 hiệu suất tăng lên, thời gian phản ứng giảm xuống Tăng tiếp tỷ lệ này, hiệu suất phản ứng thay đổi không đáng kể - Phản ứng tổng họp 11 rtr nguyên liệu diacyl: Phản ứng xúc tác lượng thừa acid Lewis (AICI3), có hình thành phức với nguyên liệu sản phẩm Một điều kiện để acid Lewis phát huy tác dụng phản ứng phải thực điều kiện khan nước Sự diện lưọng nhỏ nước làm ngưng phản ứng acid Lewis tác dụng với nước bị phân hủy Vì vậy, phản ứng cần thực dung môi hữu khan nước, dung môi sử dụng nitrobenzen, xúc tác AICI3 khan, hóa chất thiết bị cần làm khô trước phản ứng [4], - Trong nghiên cứu phản ứng thủy phân 12 đến 1, tác giả sử dụng tác nhân HBr 48% Tuy nhiên, sử dụng tác nhân phản ứng xảy mãnh liệt, dung dịch hóa đen nhanh, gây khó khăn tinh chế sản phẩm Vì thay HBr hỗn hợp acid với tỷ lệ thể tích HCl đặc: acid acetic băng ( :2 ) phản ứng xảy tốt, hiệu suất cao, sản phẩm dễ tinh chế Kết luận Đã xây dựng quy trình tổng họp L-dopa từ L-tyrosin đạt tiêu chuẩn định tính định lưọng theo Dược điển Anh 2009 Hiệu suất chung quy trình đạt khoảng 18,37%, phản ứng chuyển vị Fries để tổng họp có hiệu suất thấp (50,7%) Quá trình phản ứng racemic hóa Trong nghiên cứu này, tổng hợp L-dopa từ L-tyrosin Quá trình tổng hợp L-dopa gồm giai đoạn: Ester hóa L-tyrosin với methanol thu L-tyrosin methyl ester (9); Acyl hóa pyridin thu 0,Ndiacetyl-L-tyrosin methyl ester (10); Thực phản ứng chuyển vị 10 với xúc tác AICI3 thu (3-acetyl-4-hydroxyphenyl)-N-acetyl-L-alanin (11); oxy hóa thủy phân 11 thu L-dopa cấu trúc cùa sản phẩm chất trung gian khẳng định phương pháp đo phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân ’H-NMR L-dopa tổng hợp có hàm lượng 99,4% (đạt tiêu chuẫn Dược điển Anh 2009) Tài liệu tham ỉdiảo Bemardi L., Golfredo o (1973), Process fo r the preparation o f L-dopa., The Unites States Patent and Trademark Office, us 3717673 Brady w T (1957), The synthesis of 0-methyl-N-acetyl-L-tyrosine, California Institute o f Technology Chen F Y., Uang B J (2001), "Enantioselective Synthesis of (R)-3-(3, 4Dihydroxyphenyl) alanine from tert-Butyl Glycinate", The Journal o f Organic Chemistry, 66(10), pp 3650-3652 Ogata Y Tabuchi H (1964), "A study on the mechanism of Fries reaction", Tetrahedron, 20(7), pp 1661-1666 Wolcke u., Bretschneider H Hohenlohe-Oehringen K., Kaiser A., (1973), "Eine neue Synthese des 3-[3,4-Dihydroxy-phenyl]-L-alanins (L-DOPA) aus LTyrosin", Helvetica chimica acta, 56(8), pp 2857-2860  ... này, tổng hợp L- dopa từ L- tyrosin Quá trình tổng hợp L- dopa gồm giai đoạn: Ester hóa L- tyrosin với methanol thu L- tyrosin methyl ester (9); Acyl hóa pyridin thu 0,Ndiacetyl -L- tyrosin methyl ester... acetat (l n với 100,0 ml, l n với 70,0 ml) Thu l y dịch chiết pha hữu Chiết pha hữu NaOH 2N hai l n (l n 11,0 ml, l n 3,0 ml) Thu l y dịch chiết pha nước Loại nitrobenzen l n pha nước 30,0 ethyl acetat... hàm l ợng L- dopa theo tiêu chuẩn Dược điển Anh 2009 Kết Tổng họp L- dopa từ L- tyrosin Tông hợp L- tyrosin methyl ester (9) Thực phản ứng ester hóa với 15g (0,083 mol) L- tyrosin với 400 ml methanol,