NGHIÊN CỬU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ Đ ộ c TÍNH CỦA DƯỢC LIỆU HOÀNG KINH iVìtex negundo Linn.) Nguyễn Tiến Tiẽp' HDKH: TS Đỗ Quyên^ ThS Phạm Tuấn Anh^ ThS Lê Thanh Bình^ ThS Nguyễn Thị Thanh Tú^ ’lớ p A3K64 - Trường Đại học Dược Hà Nội ^Bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội ^Khoa YHCT- Đại học Y H Nội Từ khóa: Vitex negundo Linn., Hoàng kinh, độc tính Tóm tắt Định tính nhóm chất hữu phân đoạn dịch chiết n-hexan, methanol nước phản ứng hóa học đặc trưng xác định Hoàng kinh có chứa tinh dầu, sterol, Aavonoid, alcaloid, iridoid, đường khử, acid hữu cơ, triterpenoid gôm (chất nhầy) Đã phân tích thành phần tinh dầu Hoàng Kinh GC-MS Tinh dầu thời điểm mùa đông mùa hè khác hàm lượng thành phần cấu tử Cao Hoàng kinh độc tính cấp chuột liều cao chuột dung nạp (620g/kg) chưa phát thấy độc tính bán trường diễn thỏ liều 3,2g/kg 9,6g/kg Đặt vấn đề Cây Hoàng kinh có tên khoa học Vitex negundo L., gọi Mầu kinh, Ngũ trảo, Chân chim thuộc họ c ỏ roi ngựa (Verbenaceae) Đây gỗ nhỏ hay bụi thơm, trồng mọc hoang nhiều tỉnh thành nước ta [4], Những nghiên cứu nước cho thấy Hoàng kinh có nhiều tác dụng dược lý kháng khuẩn, chống nấm, chống oxy hóa, chổng dị ứng, hạ sốt [6 ], bật tác dụng chống viêm, giảm đau [7] vùng Nam trung nước ta, người dân thường dùng tươi giã nhỏ đắp vào chỗ sưng đau sắc nước uống để chữa bệnh lý khớp cho kết tốt Tuy nhiên đến chưa có đề tài nước nghiên cứu hóa học tính an toàn hoạt tính sinh học dược liệu Do thực báo cáo với hai mục tiêu: (1) Nghiên cứu thành phần hóa học; (2) đánh giá tính an toàn Hoàng kinh Vitex negundo L Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu Nguyên liệu Nguyên liệu nghiên cứu: Lá Hoàng kinh thu hái Hà Nội vào tháng 11 năm 2013 Mau tiêu lưu phòng tiêu Bộ môn Thực Vật, trường Đại học Dược Hà Nội (Mã số HNIP/18050 A/13) Mầu dược liệu sau rửa sạch, đem cắt nhỏ, phần dùng tươi để cất tinh dầu; phần sấy khô tủ sấy (50°C) nghiền thành bột, bảo quản túi nilon kín, dùng để định tính nhóm chất - Cao Hoàng Kinh (CHK) để đánh giá tính an toàn chuẩn bị sau: 1000 gam dược liệu (hàm ẩm 10%) chiết hồi lưu với dung môi EtOH 70° 5h, trình chiết lặp lại lần Gộp dịch chiết, cất thu hồi dung môi áp suất giảm thu cao Hoàng Kinh tỷ lệ 10:1 - Động vật thỉ nghiệm: Chuột nhắt trắng chủng Swiss, thỏ đạt tiêu chuẩn cung cấp Viện Vệ sinh dịch tễ Phương pháp nghiên cứu - Định tính số nhóm chất hữu cơ: Chiết xuất Hoàng Kinh thành phân đoạn dịch chiết có độ phân cực tăng dần theo phương pháp trưÒTig Đại học Dược Rumani: bột (50g) chiết hồi lưu với dung môi n- hexan, methanol, nước Mỗi dung môi tiến hành lần, lần 30 phút Bã dược liệu sau chiết làm khô dung môi trước, chiết dung môi Gộp, lọc cất thu hồi dung áp suất giảm riêng dịch chiết phân đoạn đến lại khoảng lOOml dịch chiết loại Xác định nhóm hợp chất dịch chiết phản ứng hóa học đặc trưng [ ], [2 ], + Phân đoạn dịch chiết n-hexan: xác định chấtbéo, tinh dầu, carotenoid, sterol, alcaloid, coumarin, anthraquinon flavonoid + Phân đoạn dịch chiết MeOH: xác định alcaloid, coumarin, glycosid tim, anthranoid, flavonoid, iridoid, triterpenoid, tanin, saponin, đưÒTig khử, acid hữu + Phân đoạn dịch chiết nước: xác định alcaloid, anthraglycosid, ílavonoid, glycosid tim, tanin, saponosid, iridoid, đường khử, acid hữu cơ, gôm (chất nhầy) - Nghiên cứu tinh dầu phương pháp cất kéo nước, sử dụng dụng cụ cất cải tiến Thực lần, lần 180g tươi (độ ẩm 63%) Thời gian cất: 2,5 giờ/lần Sau cất kéo, đọc thể tích tinh dầu thu loại nước Na S0 khan, sau pha loãng với dung môi CHCI3 đến nồng độ thích hợp (10'^) Phân tích thành phần chất bay tinh dầu GC-MS (tiến hành hệ thống GC Agilent 7890A Cột sắc kí Agilent 19091 s - 433 có kích thước 30 m X 250 |im, độ dày phim 0.25 Ịim Nhiệt độ bắt đầu 45°c giữ phút, sau tăng dần 5°c/phút đến 200°c, tăng 10°c/phút đến 250°c, giữ vòng phút Khí mang Heli, tốc độ dòng Iml/phút Detector MS Agilent 5975C) - Nghiên cứu độc tính cấp xác định LD 50 cao Hoàng Kinh: Tiến hành chuột nhắt trắng đường uống theo phương pháp Litchfield - Wilcoxon hướng dẫn WHO [9, 10], Chuột nhắt chia thành lô, lô 10 con, uống mẫu thuốc nghiên cứu lần /24h theo liều tăng dần từ 124 g/kg đến 620 g/kg (liều tối đa chuột dung nạp được) Theo dõi tình trạng chung số lượng chuột chết lô 72 Tiếp tục theo dõi tình trạng chuột đến hết ngày thứ sau uống thuốc thử lần đầu - Nghiên cứu độc tính bán trường diễn: Thỏ chia làm lô, lô 10 Lô chứng: uống nước cất 2ml/kg/ngày Lô trị 1: uống Cao Hoàng kinh liều 3,2 g dược liệu/kg (liều có tác dụng tương đương liều dùng người, tính theo hệ số 4) Lô trị 2; uống Cao Hoàng kinh liều 9,6 g dược liệu/kg (gấp lần lô trị 1) Thỏ uống nước cất thuốc ngày lần vào buổi sáng liên tục tuần Đánh giá thời điểm trước uống thuốc (To), sau tuần (T 4), sau tuần (Tg) tình trạng chung, thể trọng, chức tạo máu, chức gan, chức thận [9, 10] Kết Bàn luận Định tính nhóm chất hữu phản ứng hỏa học Phân đoạn dịch chiết n-hexan cho kết dương tính với nhóm tinh dầu, sterol Phân đoạn dịch chiết MeOH cho kết dương tính với alcaloid, ílavonoid, iridoid, triterpenoid, đường khử, acid hữu Phân đoạn dịch chiết nước cho kết dương tính với flavonoid, iridoid, đường khử, acid hữu gôm (chất nhầy) Nhận xét: Bằng phản ứng hóa học xác định Hoàng kinh có tinh dầu, sterol, flavonoid, alcaloid, iridoid, đưòng khử, acid hữu cơ, triterpenoid, gôm (chất nhày) Các nhóm flavonoid, iridoid, đường khử, acid hữu cho kết dương tính hai phân đoạn dịch chiết MeOH nước Trong đáng ý flavonoid, nhóm chất quan trọng thực vật, sở hữu nhiều tác dụng chống oxy hóa, chống viêm, chống gốc tự d o Hàm lượng tinh dầu lả Hoàng Kinh phân tích thành phần Bảng Kết phân tích tinh dầu Hoàng kinh thu hái mùa hè mùa đông s„ M ùa hè M ùa đông (% ) (% ) 0,21 a - Pinene 0,81 Sabinene 12,14 Nội dung Hàm lượng tinh dầu (theo dược liệu khô) 1,17 ß - Pinene Thành phần tinh dầu - Terpinene ¥ 0,94 a - Terpinene ß - Caryophyllene 3,34 40,60 a - humulene 0,25 3,04 2,88 Valencene 21,95 Caryophyllene oxide 23,36 3,18 Cadinol 2,17 Dehydroabietan 4,14 0 Germacrene - D !- Kết nghiên cứu cho thấy lượng tinh dầu mẫu thu hái vào mùa hè (0,81%) cao nhiều so với mùa đông (0,21%) Tiến hành phân tích tinh dầu từ hai mẫu nghiên cứu GC - MS thu kết quả; mẫu mùa đông phát 47 chất có 21 chất xác định cấu trúc, số đó, tỷ lệ sesquiterpen 61.84%; mẫu mùa hè tương ứng 48 chất - 15 chất - 51.07% Trong mẫu thu hái mùa hè xác định Dehydroabietan - diterpen Tỷ lệ thành phần tinh dầu hai mẫu khác đáng kể mẫu mùa đông, ß - Caryophyllen thành phần chiếm 40.60% (mùa hè 3.34%, thấp) Trong đó, mẫu mùa hè, Caryophyllene oxide chiếm tỉ lệ cao với 23.36% (mùa đông 3.18%) /3-Caryophyllen, Caryophyllene oxide valencene thành phần tinh dầu chứng minh có tác dụng chống viêm giảm đau hiệu Ket thử độc tỉnh cấp Sau liều thở, uống cao Hoàng kinh, tất lô chuột chết vòng 72 lô từ lô 1- lô (tương ứng liều Hoàng kinh 124g dược liệu khô/kg đến 372g dược liệu khô/kg), chuột ăn uống, vận động bình thường, không bị khó phân khô lô lô (tương ứng với liều 496g dược liệu khô đến 620g dược liệu khô) số chuột có tưọng ỉa chảy vòng 24 sau uống, ngày sau bình thường Hoàng kinh dược liệu đề cập tới y văn trước Xác định độc tính cấp liều chết 50% để đánh giá mức độ độc có sở chọn liều thử tác dụng cho bước nghiên cứu Chuột nhắt uống cao lỏng Hoàng kinh nồng độ đậm đặc nhất, thể tích tối đa 0,25 ml/lOg số lần tối đa lần 24 giờ, tương đương 620 g dược liệu/kg thể trọng chuột Tính theo kinh nghiệm dân gian chuột nhắt uống gấp 64,61 lần liều người (tính hệ số ngoại suy chuột nhắt 10) Theo hướng dẫn WHO hưóng dẫn nghiên cứu thuốc Hoàng kinh dược liệu an toàn [7 Kết thử độc tỉnh bán trường diễn Tinh trạng chung thay đổi thể trọng thỏ: Tình írạng chung; Trong thời gian thí nghiệm, thỏ lô hoạt động bình thường, nhanh nhẹn, mắt sáng, lông mượt, ăn uống tốt, phân khô Sự thay đổi thể trọng thỏ: biểu đồ la Đánh giả chức tạo máu: Theo WHO, tinh trạng chung, trọng lượng thể số huyết học xét nghiệm bắt buộc đánh giá độc tính thuốc thử Vì vậy, xét nghiệm công thức máu thỏ thí nghiệm xác định Sau tuần tuần uống cao Hoàng kinh, số máu thỏ (cả hàm lượng huyết sắc tố, hematocrit, thể tích trung bình hồng cầu, công thức bạch cầu) hai lô trị thay đổi ý nghĩa thống kê so với trước dùng (p >0,05) so với lô chứng thời điểm Như Hoàng kinh độc tính với quan tạo máu Đánh giá chức gan: Trong thể gan quan đảm nhận nhiều chức quan trọng Khi đưa thuốc vào thể gây độc với gan, làm ảnh hưởng đến chức gan Vì vậy, đánh giá độc tính thuốc nghiên cứu ảnh hưởng thuốc chức gan cần thiết [5] Để đánh giá mức độ tổn thương tế bào gan, người ta thường định lượng nồng độ enzym có nguồn gốc gan có huyết Trong nghiên cứu này, sau tuần tuần uống thuốc hoạt độ ALT, AST số đánh giá chức gan (bilirubin toàn phần, albumin cholesterol máu) lô nghiên cứu nằm giới hạn bình thường (p>0.05) Đánh giá chức thận: Thận quan tiết Khi vào thể thuốc gây độc, làm tổn thương thận Đánh giá chức thận thường dùng xét nghiệm định lượng creatinin máu Creatinin thành phần đạm máu ổn định nhất, phụ thuộc vào khả đào thải thận Khi cầu thận bị tổn thương, nồng độ creatinin máu tăng Nồng độ creatinin máu thỏ sau uống cao Hoàng kinh thay đổi khác biệt với lô chứng so sánh hai thời điểm trước sau uống thuốc thử (p>0,05) Thay đổi mô bệnh học sau tuần dùng thuốc: - Đại thể: Trên tất thỏ thực nghiệm không quan sát thấy thay đổi bệnh lý mặt đại thể quan tim, phổi, gan, lách, tụy, thận hệ thống tiêu hóa - Vi thể: + Hình thái vi thể gan: Lô chứng: hình ảnh gan bình thường, có số vị trí bị thoái hóa nhẹ Lô trị 1; hình ảnh gan bình thường, vài vị trí bị thoái hóa nhẹ Lô trị : hình ảnh gan gần bình thường + Hình thái vi thể thận: Tất lô có hình ảnh thận bình thường Giải phẫu đại thể vi thể gan thận số bắt buộc idii đánh giá độc tính bán trường diễn theo hướng dẫn WHO [9] Hơn xét nghiệm vi thể tiêu chuẩn vàng để đánh giá tổn thương quan chịu trách nhiệm chuyển hóa thải trừ thuốc Theo kểt trên, giải phẫu mô bệnh học quan thỏ bình thường so với thời điểm trước dùng thuốc Kết luận Lá có chứa nhóm chất: tinh dầu, sterol, flavonoid, alcaloid, iridoid, đường khử, acid hữu cơ, triterpenoid, gôm (chất nhầy) Có khác hàm lượng tỷ lệ chất tinh dầu hai mẫu thu hái vào hai thời gian khác Hàm lượng tinh dầu mùa hè cao so với mùa đông Cao Hoàng kinh dược liệu an toàn, độc tính cấp theo đường uống chuột nhắt trắng Cao Hoàng kinh liều 3,2g dược liệu/kg/ liều 9,6g dược liệu/kg uống gây độc tính bán trường diễn thỏ tuần liên tục không Tài liệu tham khảo Trần Hùng, Nguyễn Viết Kình, Bùi Mỹ Linh (2012), Phương pháp nghiên cứu dược liệu, Bộ môn Dược liệu, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh Võ Văn Chi (1997), Hoàng kinh, ’T điển thuốc Việt Nam ”, Nhà xuất Y học, tr 564 PL.Ladda CS.Magdum “Vitex negundo Linn.: Ethnobotany, Phytochemistry and Pharmacology- A R eview ” World Health Organization (2000), “Working group on the safety and efficacy o f herbal medicine Report o f regional office for the western pacific of the World Health Organization Litchfield J T& Wilcoxon F A (1949^, “A simplified method o f evaluating doseeffect experiments" J Pharmacol Exp Ther 96:99-113  ... pháp nghiên cứu dược liệu, Bộ môn Dược liệu, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh Võ Văn Chi (199 7), Hoàng kinh, ’T điển thuốc Việt Nam ”, Nhà xuất Y học, tr 564 PL.Ladda CS.Magdum “Vitex negundo. .. liều Hoàng kinh 124g dược liệu khô/kg đến 372g dược liệu khô/kg), chuột ăn uống, vận động bình thường, không bị khó phân khô lô lô (tương ứng với liều 496g dược liệu khô đến 620g dược liệu kh ). .. thường Hoàng kinh dược liệu đề cập tới y văn trước Xác định độc tính cấp liều chết 50% để đánh giá mức độ độc có sở chọn liều thử tác dụng cho bước nghiên cứu Chuột nhắt uống cao lỏng Hoàng kinh