NGHIÊN CỨU S ự THAY ĐỎI HÀM LƯỢNG OXOSTEPHANIN TRONG MỘT SỐ MẪU CỦ VÀ LÁ LOÀI STEPHANIA DIELSIANA Y c w u TRỒNG TẠI BA v ì, HÀ NỘI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẤC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO Nguvễn Thi Thùv Linh* HDKH: TS Nguyễn Quốc Huy^ DS Nguyễn Vũ Minh^ ‘Lớp A2K64 - Trường Đại học Dược Hà Nội ^Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội ^HV cao học 17, Trung tâm kiểm nghiệm nghiên cứu dược quãn đội Từ khóa: Ba Vĩ, HPTLC, oxostephanin, Stephania dielsiana Y c wư Tóm tẳt Nghiên cứu xãy dựng quy trình định lượng oxostephanin loài Stephania dielsiana Y c wu (S dielsỉana) phương pháp HPTLC Các mẫu nghiên cứu chiết phương pháp ngẩm kiệt dung môi MeOH acid acetic 5% (6:4)., Hệ dung môi khai triển CHCls-MeOH (9:1) cho kết tách tốt Thẩm định quy trình định lượng: tính đặc hiệu, độ tuyến tỉnh, độ thích hợp hệ thống Dựa vào quy trình định lượng để đảnh giá thay đổi hàm lượng oxostephanin kết cho thấy hàm lượng oxostephanin mẫu cao so với mẫu củ Đặt vấn đề Stephania dielsiana Y c Wu loài (trong Sách Đỏ Việt Nam) thuộc chi Bình vôi (Stephania Lour.), nghiên cứu trồng Ba Vì (Hà Nội) Oxostephanin alcaloid loài, có khả gây độc dòng tế bào ung thư gan (Hep-2), phổi (LU) màng tim (RD) [4], Người dân địa phương Ba Vì thường dùng củ để điều trị phong thấp đau nhức, đau dày [4] nên cần nghiên cứu đánh giá hàm lưọTig alcaloid phận khác Đây hoạt động quan trọng trình tiêu chuẩn hóa dược liệu rộng quy trình “Trồng trọt thu hái thuốc tốt (GACP)” mà Bộ Y x ế triển khai thực Sắc ký lớp mỏng hiệu cao (HPTLC) phương pháp phân tích định tính định lượng đại Kỹ thuật có nhiều ưu điểm độ nhạy, tính xác, độ tin cậy, dễ thực hiện, chi phí thấp, nhanh Tuy nhiên ứng dụng kỹ thuật HPTLC định tính, định lưọBg oxostephanin chưa tìmg tiến hành trước Trong khuôn khổ nghiên cứu này, đưa quy trình định lượng oxostephanin HPTLC, thẩm định quy trình áp dụng để địiứi lưọ-ng đánh giá hàm lượng hợp chất ừong số mẫu củ mẫu Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu Nguyên liệu Nguyên liệu mẫu củ mẫu trồng loài s dielsỉana thu hái Ba Vì (Hà Nội), TS Nguyễn Quốc Huy giám định tên khoa học [4], sấy Iđiô 60°c xay thành bột thô Thiết bị hóa chất Thiết bị phân tích: Hệ thống máy sắc ký lớp mỏng hiệu cao Camag, máy đo hàm ẩm Precisa, cân phân tích, tủ sấy, thiết bị chiết ngấm kiệt, bình ừiển khai sắc ký, mỏng Silicagel Gp 254 (MERCK) mỏng dành cho HPTLC Dung môi hóa chất: MeOH, acid acetic, nước cất, ammoniac đậm đặc đạt tiêu chuẩn Dược Điển Việt Nam IV Chất chuẩn: Oxostephanin tmh thể (do TS Nguyễn Quốc Huy cung cấp) Phương pháp nghiên cứu Xây dựng quy trĩnh định lượng - Lựa chọn điều kiện chiết mẫu [1, 2, 4, 5] - Lựa chọn điều kiện HPTLC [1,7, 8] - Thẩm định phương pháp: tính đặc hiệu, độ tuyến tính, độ thích hợp hệ thống [1,3, 6, 7] Kết Xây dựng quy trình định lượng Lựa chọn điều kiện chiết mẫu xử lý dịch chiết Dung môi chiết mẫu: Dung môi MeOH đă chọn Các mẫu chiết xuất dung môi MeOH pH Idiác Điều chỉnh pH dung môi chiết xuất acid acetic 5% ammoniac đậm đặc Cô cách thủy dịch chiết đến cắn, cắn sấy đến khối lưọTig (KL) không đổi, sau đem cân Bảng Khối lượng cắn mẫu dịch chiết pH khác TT pH Khôi lưọng dưọc liệu (g) Khối lưọng cắn (g) 4-5 10.43 0.72 5-6 10.02 0.43 10.07 0.41 8-9 10.13 0.4 9-10 10.02 0,55 Nhận xét: Khối lưọng cắn cốc thứ (pH=4-5) lớn Vì hệ dung môi lựa chọn MeOH : Acid acetic 5% (6:4) Phương pháp chiết xuất xử lý dịch chiết: Lựa chọn phương pháp chiết xuất ngấm kiệt phương pháp chiết xuất đan giản, hiệu suất chiết tương đối tốt Lựa chọn điều kiện HPTLC chuẩn bị dung dịch chuẩn Bản mỏng: Bản mỏng hiệu cao tráng sẵn Silicagen GF254, hoạt hóa 110°c 30 phút (loại thường loại dùng cho HPTLC) Kích thước mỏng 20 cm X 10 cm Hệ dung môi khai triển; Tiến hành triển khai mỏng sổ hệ dung môi: Chloroform : MeOH (5:5; 6:4; 7:3; 8:2; 9:1) Kết quan sát cho thấy hệ Chloroform : MeOH (9;1) cho kết tốt Các vết tách được, gọn đều, vết phụ, vết oxostephanin phát huỳnh quang rõ nét ánh sáng tử ngoại 366 nm Đưa mẫu lên mỏng; Sử dụng máy TLC tự động hóa Camag Linomat với lượng khí nitơ cung cấp tốc độ phun cho tiêm 150 riL/s Thể tích vết 2.0 |il, cách mép mép bên mỏng miTi 15 mm Các thông số giữ định ừình phân tích mẫu Điều kiện chạy HPTLC - Điều kiện chạy HPTLC; nhiệt độ 28°c độ ẩm tương đối 55% - Thể tích dung môi bão hòa: 25 ml; dung môi khai triển: 10 ml - Thời gian bão hòa dung môi: 20 phút - Thời gian bão hòa mỏng: phút - Thời gian sấy khô mỏng: phút - Khoảng cách dịch chuyển pha động: 80 tnm Bản mỏng sau khai triển sấy khô soi u v bước sóng 366 nm Phân tích định lượng oxostephanin thực nhờ phần mềm VideoScan Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn: Pha dãy dung dịch chuẩn có giới hạn nồng độ khác để khảo sát khoảng nồng độ oxostephanin mẫu thử: Dãy 1: gồm nồng độ 0,01; 0,02; 0,03; 0,04; 0,05 (mg/ml) Dãy 2; gồm nồng độ 0,02; 0,05; 0,08; 0,1; 0,12; 0,15 (mg/ml) Kết khảo sát cho thấy nồng độ dãy phù hợp để xây dựng đường chuẩn Khảo sát tính đặc hiệu phương pháp Chuẩn bị mẫu: Mầu trắng: dung môi MeOH pha mẫu Mầu thử: dịch chiết có nồng độ khoảng 0,0265 mg/ml Mầu chuẩn: chất chuẩn oxostephanin pha MeOH có nồng độ 0,02 mg/ml Tiến hành: Triển khai sắc ký dung môi pha mẫu, dưng dịch mẫu thử dung dịch mẫu chuẩn đối chiếu Kết quả: Sắc ký đồ mẫu thử cho vết có hình dạng giá trị Rf so với vết có sắc ký đồ mẫu chuẩn Sắc ký đồ mẫu trắng Iđiông xuất vết tương ứng với vết sắc ký đồ mẫu chuẩn A -X;: Hình Kết chồng peak mẫu thử, mẫu chuẩn mẫu ữắng Trị số Rf mẫu thử mẫu chuẩn 0,429 0,427, độ lệch chuẩn 0,4662%, nằm giới hạn chấp nhận Khảo sát độ tuyến tính Chuẩn bị dãy mẫu chuẩn với nồng độ: 0,02; 0,05; 0,08; 0,1; 0,12; 0,15 (mg/ml) Phương trình đường chuẩn theo diện tích peak làY = 14511X + 41809 với hệ số tương quan r = 0,9877 (tương ứng với giá trị = 0,97), nồng độ X tính theo đơn vị mg/ml Kết khảo sát cho thấy khoảng nồng độ khảo sát có tưong quan tuyến tính nồng độ oxostephanin diện tích peak 300000 Seriesl - Linear (Series 1) - Linear (Seriesl) 10 15 20 ETinh Mối liên hệ nồng độ diện tích peak Khảo sát độ thích hợp hệ thống Chuẩn bị mẫu chuẩn oxostephanin có nồng độ 0.03 mg/ml Tiêm lần dung dịch chuẩn, tiến hành sắc ký, ghi nhận sắc ký đồ, giá trị Rf ,diện tích peak Bảng Kết đo độ lặp lại lần tiêm mẫu L ầnl Lần Lần Lần Lần Lần Giá trị Rf 0.429 0.426 0.426 0.424 0.425 0.424 51308.4 51261.4 51523.4 51137.0 52723.6 53285.6 Diện tích RSD giá ừị Rf 0.44%, RSD diện tích peak 1.74% Giá trị RSD tính theo diện tích peak hay Rf nằm giới hạn chấp nhận Kết định lượng Oxostephanin dược liệu định lượng kỹ thuật HPTLC theo phương pháp xây dựng đường chuẩn Đường chuẩn xây dựng dựa cường độ màu vết sắc ký oxostephanin mẫu chuẩn bước sóng 366 nm Từ xác định hàm lượng oxostephanin (O) dịch chiết dược liệu: (%) = 1250 x c m x(iOO—a) X 100 (%) mm ^ mề mm 1KB (B PôLVrK!l,1l-4 R ESRES3‘£(f Cs.!Bfaíicití ríssir.aa T1IS ^ a lfb lio ft is ũ s s e ii o fl õ s tìis a ỉd s CeSfcraiiM « 3UỄÊ0 ftrV = h s ig h ta tó a A « a rn o t'it đ a te de a ire j.r, Y = 1.Í1Ì-ÍKỈ4 » ỉ-ẵ ‘ -583 * * ‘ &ứv=ỉ.'í1 Hình Đường chuẩn ửieo diện tích peak Dựa vào đường chuẩn, phần mềm VideoScan cho kết nồng độ (% g/ml) dung dịch thử Từ thông số khối lượng, hàm ẩm mẫu thử, nồng độ dung dịch thử, kết định lượng thu bảng Bảng Hàm lượng oxostephanin củ tính theo diện tích peak Mâu Khối lưọ-ng Hàm ẩm (g) (%) Hàm lưọTig tính theo diện tích peak (%) 5.0178 8.44 0.1823 Cù năm tuôi 5.0247 8.78 0.1282 Củ nàm tuôi 5.0313 9.18 0.2052 Lá non tuổi trồng từ hạt 5.0845 6.93 0.3422 Lả bánh tẻ cãy tuổi trồng từ hạt Lá già tuổi trồng từ hạt 5.0579 5.0817 5.94 6.17 0.2909 0.2671 Lá non cãy tuổi trổng từ hom 5.0164 5.81 0.3936 Lả bánh tẻ tuổi trồng từ hom 5.0381 6.68 0.2977 Lả già tuổi trồng từ hom 5.1168 5.58 0.3230 Lá bảnh tẻ cãy tháng tuổi tr từ hom 5.0314 6.17 0.2357 Lá bánh tẻ năm tuôi tr từ hom 5.0313 7.01 /\ Củ trưởng thành (>3 năm) 0.3286 1r củ, cao tới lần Trong mẫu lá, non có hàm lượng oxostephanin cao bánh tẻ già (khoảng 0,05 - 0,09%) Hàm lượng oxostephanin mẫu trồng từ hom cao trồng từ hạt Bàn luận Đây lần đưa quy ừình định lượng oxostephanin (là chất mới) HPTLC, nhiều yếu tố cần nghiên cứu hoàn thiện hooi lựa chọn dung môi, phương pháp chiết xuất, tiêu chuẩn thẩm định kỹ thuật HPTLC HPTLC kỹ thuật bán tự động, việc xây dựng đường chuẩn định lượng dựa cường độ màu vết sắc ký bước sóng tử ngoại 366nm nên sai số phưong pháp cao, thích họp ứng dụng bán định lượng, làm nhanh Khi cần xác cần xây dựng quy trình định lượng HPLC Kết thực nghiệm cho thấy hàm lượng oxostephanin mẫu cao hẳn mẫu củ Bên cạnh đó, thòd gian cần thiết để thu hái thấp nhiều so với thời gian cần để thu hái củ, việc thu hái không làm ảnh hưởng tới thu hái củ Kết hàm lượng oxostephanin mẫu trồng từ hom cao hon mẫu trồng từ hạt, việc nhân giống vô tính có nhiều ưu điểm hon sinh khối thân lớn, thu hoạch thân quanh năm Qua nghiên cứu thấy hướng phát triển loài thuốc phương pháp vô tính khả thi Kết phân tách vết ừên mỏng cung cấp thông tin để xây dựng tiêu chuẩn dược liệu góp phần sơ xác định nhanh loài dựa vào hình ảnh HPTLC dịch chiết toàn phần (dịch chiết chuẩn) chất chuẩn (oxostephanin) Kết luận Đã xây dựng quy trình định lượng oxostephanin HPTLC: + Hệ dung môi chiết xuất nguyên liệu hệ dung môi MeOH : Acid acetic 5% (6:4), lượng dung môi sử dụng 300 ml cho mẫu thử + Hệ dung môi triển khai mỏng C H C I3 : MeOH (9:1) + Đã lựa chọn điều láện HPTLC chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn, khoảng nồng độ tuyến tính mẫu chuẩn từ 0,02 đến 0,15 mg/ml + Đã khảo sát tính đặc hiệu độ thích họp phương pháp đạt yêu cầu Đã định lượng hàm lượng oxostephanin mẫu củ thử nghiệm cho thấy nồng độ oxostephanin mẫu cao nồng độ oxostephanin mẫu củ Tài liệu tham khảo Nguyễn Vân Chi (2010), Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học thăm dò khả tái sinh, phát triển loài Stephania dielsiana Y.C.Wu, Khóa luận tổt nghiệp thạc s ĩ khỏa 2009 - 2010, TrưÒTig Đại học Dược Hà Nội Mai Thị Hằng (2008), Xây dựng phương pháp định lưọng nhanh Rotundin bán thành phẩm viên Sen vông - R, Khóa luận tốt nghiệp dược s ĩ khóa 2003 - 2008, Trường Đại học Dược Hà Nội 3 Nguyễn Thị Thu Hằng (2012), Nghiên cứu tính đa dạng di truyền định lượng Berberin số loài thuộc chi Berberin L Việt Nam, Khóa luận tốt nghiệp dược s ĩ khỏa 2007 - 2012, Trường Đại học Dược Hà Nội Đặng Văn Hòa, Vĩnh Định (2011), Kiểm nghiệm thuốc, NXB Giáo dục Việt Nam Nguyễn Quốc Huy (2010), Nghiên cứu thực vật, thành phần hóa học, sổ tác dụng sinh học số loài thuộc chi Stephania Lour, Việt Nam, Luận án Tiến s ĩ Dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội Phạm Thanh Kỳ (2007), Dược liệu học, tập 2, NXB Y học Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương (2012), Khỏa đào tạo thẩm định quy trình phân tích SKLMvà HPLC thuốc đông dược Man Mohan Srivastava (2011), High - Performance Thin - Layer Chromatography, Springer Harish C.Andola, R.S.Rawal, M.S.M.Rawal (2010), Analysis of Berberin Content using HPTLC fingerprinting of Root and Bark of three Himalayan Berberin Species, Asian Journal o f Biotechnology, pp 240-243  .. .oxostephanin HPTLC, thẩm định quy trình áp dụng để địiứi lưọ-ng đánh giá hàm lượng hợp chất ừong số mẫu c mẫu Nguyên liệu phương pháp nghiên c u Nguyên liệu Nguyên liệu mẫu c mẫu trồng loài. .. hái Ba Vì (Hà Nội) , TS Nguyễn Qu c Huy giám định tên khoa h c [4], s y Iđiô 60 c xay thành bột thô Thiết bị hóa chất Thiết bị phân tích: Hệ thống m y s c ký lớp mỏng hiệu cao Camag, m y đo hàm. .. đ c hiệu độ thích họp phương pháp đạt y u c u Đã định lượng hàm lượng oxostephanin mẫu c thử nghiệm cho th y nồng độ oxostephanin mẫu cao nồng độ oxostephanin mẫu c Tài liệu tham khảo Nguyễn