NGHIÊN CỨU BÁN TỔNG HỢP TETRAHYDROCURCUMIN TỪ CURCUMIN Nguyễn Thi Vân', Nguyễn Thị Phượng ' HDKH: PGS.TS Nguyễn Đình Luyệĩi^; ThS Nguyễn Văn Giang^ ‘Lớp M1K64 - Trường Đại học Dược Hà Nội ^Bộ môn Công nghiêp Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội Từkhoả: curcumin, tetrahydrocurcumin Tóm tẳt Tetrahydrocurcumin bán tổng hợp từ curcumin phản ứng khử hỏa với hai tác nhân khử khác khỉ hydro với xúc tác Pd/C kẽm môi trường acid cẩu trúc sản phẩm khẳng định phương pháp phổ IR, 'H-NMR MS Đặt vấn đề Trong năm gần đây, với xu hướng quay trở sử dụng sản phẩm từ thiên nhiên, việc phát triển hoạt chất có nguồn gốc thảo dược ngày ứở thành mối quan tâm lớn ngành Dược Việt Nam Một hoạt chất có nguồn gốc thảo dược quan tâm nhiền curcumin Curcumin thành phần thân rễ Nghệ vàng (Curcuma longa) Curcumin nghiên cứu chứng minh với tác dụng dược lý như: chống oxy hóa, chống viêm, chống ung thư, làm lành vết thương [1, 5, 7] Tuy nhiên curcumin có màu vàng khó rửa sạch, nên nhu cầu sử dụng curcumin bị hạn chế, đặc biệt mỹ phẩm Với hạn chế curcumin việc sử dụng curcumin dần thay tetrahydrocurcumin, chất bán tổng hợp từ curcumin Tetrahydrocurcumin màu nên sử dụng rộng rãi, hon nghiên cứu cho thấy tetrahydrocurcumin có tác dụng chống oxy hóa, chống viêm chống ung thư tốt curcumin [3, 4, ], Để góp phần nghiên cứu tổng họp nguyên liệu làm thuốc, thực đề tài ‘‘‘'Nghiền cứu bán tổng hợp tetrahydrocurcumin từ curcumin” với mục tiêu: Bán tổng hợp tetrahydrocurcumin từ curcumin quy mô phòng thí nghiệm Nguyên liệu, thiết bị phương pháp nghiên cửu Nguyên liệu: Đề tài sử dụng curcumin sản xuất môn Công nghiệp Dược, số nguyên liệu, hóa chất, dung môi thiết bị phòng thí nghiệm Tổng hợp Hóa dược, Bộ môn Công nghiệp Dược, Trưòrng Đại học Dược Hà Nội Phương pháp nghiên cửu: Bản tổng hợp tetrahydrocurcumin từ curcumin theo sơ đồ sau: OCH, HjCO a/b T etrahydrocurcum in Curcum in b Zn/H* Tinh chế sản phẩm: Bằng phương pháp sắc ký cột silica gel - Pha tĩnh; silica gel 60 GF254 (Merck) - Pha động: CH2C 12 : MeOH = 20:1 - Đường kính cột: cm - Chiều cao cột: 30 cm - Các phân đoạn có kết SKLM giống gộp lại, cất quay chân không, sấy khô cân định lưọfng Kiếm tra độ tinh khiết: kiểm tra sơ độtinhkhiết sảnphẩm thuđược phương pháp SKLM với hệ dung môi thíchhợp vàphương pháp đo nhiệt độ nóng chảy Xác định cấu trúc sản phẩm: phương pháp phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng tò hạt nhân proton ('H-NMR), phổ khối lượng (MS) Kết Phản ứng khử hóa với tác nhân khử khí hydro có xúc tác Pd/C - Khảo sát dung môi phản ứng + Tiến hành phản ứng: Hoạt hóa xúc tác: cho 0,10 g Pd/C vào bình cầu ba cổ đáy tròn dung tích 250 ml, thêm 20 ml dimg môi khảo sát, khuấy từ nhiệt độ khoảng 0-5°C phút, đồng thời sục khí nitơ để đuổi hết không khí bình phản ứng Hòa tan ,0 g curcumin (2,71 mmol) 0 ml dung môi khảo sát, cho dung dịch thu vào bình phản ứng Tiếp tục khuấy hỗn hợp nhiệt độ phòng, đồng thời sục khí hydro liên tục trình phản ứng áp suất khí Theo dõi hỗn họp phản ứng SKLM với hệ dung môi ethyl acetat;n-hexan = 7:3 sau khoảng thời gian giờ, giờ, giờ, 1 giờ, để xác định thời gian phản ứng thích hợp Nhận thấy phản ứng kết thúc sau 12 + Xử lý phản ứng (1): Hỗn họp phản ứng đem lọc hút chân không để loại bỏ xúc tác Dịch lọc đem cất loại dung môi máy cất quay chân không nhiệt độ 50°c Tinh chế sản phẩm phương pháp sắc ký cột silica gel + Kết trình bày bảng Bảng Ket khảo sát ảnh hưởng dung môi đến hiệu suất phản ứng bán tổng hơp tetrahydrocurcumin từ curcumin với tác nhân khử H 2/Pd(C) Rf (ethyl acetat: KLsản Dung môi T vrc) n-hexan = 7:3) phẩm (g) phản ứng MeOH tuyệt đối 0,69 62,42 95,0-98,0 EtOH tuyệt đối 0,63 0,69 0,59 58,46 95,0 - 98,5 EtOH 96% Nhận xét: > Với ba dung môi sử dụng, nhiệt độ nóng chảy sản phẩm thu phù hợp với nhiệt độ nóng chảy sản phẩm dự kiến (T°nc 95,0 97,0°c [8 ]) > Dung môi EtOH 96% cho hiệu suất phản ứng thấp (58,46%) Khi sử dụng dung môi EtOH tuyệt đối cho hiệu suất phản ứng cao (62,42%) > Dung môi MeOH tuyệt đối cho hiệu suất phản ứng cao (64,41%), nhiên chênh lệch ko nhiều so với dùngEtOHtuyệt đối Mặt khác, MeOH lại độc nhiều so với EtOH > Từ liệu ưên cho thấy dung môi EtOH có nhiều ưu điểm hơn, lựa chọn EtOH tuyệt đối làm dung môi phản ứng - Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ xúc tác đến thời gian hiệu suất phản ứng Sau chọn dung môi tối ưu cho phản ứng EtOH tuyệt đối, tiếp tục khảo sát ảnh hưỏng tỷ lệ xúc tác đến thòi gian hiệu suất phản ứng + Tiến hành phản ứng: Cho lượng xúc tác Pd/C khảo sát vào bình cầu ba cổ đáy tròn dung tích 250 ml, thêm 20 ml EtOH tuyệt đối, khuấy từ nhiệt độ khoảng 0-5°C phút, đồng thời sục khí nitơ để đuổi hết không khí bình phản ứng Hòa tan 1,00 g curcumin (2,71 mmol) 100 ml EtOH tuyệt đối, cho dung dịch thu vào bình phản ứng Tiếp tục khuấy hỗn hợp nhiệt độ phòng, đồng thời sục khí hydro liên tục trình phản ứng áp suất khí Theo dõi hỗn hợp phản ứng SKLM với hệ dung môi ethyl acetat; n-hexan = 7:3 để xác định thời gian phản ứng thích họp stt T H C + Xử lý phản ứng tinh chế sản phẩm giống (1) + Kết ưình bày bảng Bảng Kết khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ xúc tác đến thời gian hiệu suất phản ứng với tác nhân khử H 2/Pd(C) Rf (ethyl Tỷ lệ KL KL sản KL T ° n c CQ acetat: H pư xúc tác xúc tác ^pư phẩm TT curcumin n-hexan Pd/C Pd/C (h) (g) (g) = 7:3) (%) (g) 0,69 56,48 95,0-98,0 24 0,57 0,02 1,00 0,69 65,40 95,0-98,0 18 0,66 0,05 1,00 0,69 61,43 96,0-98,5 0,62 15 0,08 1,00 0,69 62,42 96,0-98,0 12 0,63 1,00 0,10 10 Nhận xét: > Nhiệt độ nóng chảy giá trị Rf sản phẩm thu từ thí nghiệm khảo sát tỷ lệ xúc tác khác chênh lệch đáng kể > Khi tăng tỷ lệ xúc tác thời gian phản ứng giảm, hiệu suất phản ứng thay đổi Với tỷ lệ xúc tác 2%, thời gian phản ứng 24 giờ, hiệu suất phản ứng thấp (56,48%) Hiệu suất phản ứng đạt cao tỷ lệ xúc tác 5%, thời gian phản ứng 18 > Tử liệu trên, lựa chọn tỷ lệ xúc tác 5%, thời gian phản ứng 18 để thực phản ứng Phản ứng khử với tác nhân kẽm môi trường acid Hoạt hóa kẽm: Cho 10,00 g kẽm bột vào cổc có mỏ dung tích 250 m Ị thêm 100 ml dune dịch HCl 0,1 M, khuấy khoảng phút Sau lọc, rửa lần với nước cất, lần khoảng 15 ml, rửa với khoảng ml aceton sấy khô nhiệt độ 60“c 30 phút [9] - Kháo sát môi trường acid phản ứng + Tiến hành phản ứng: Hòa tan 1,00 g curcumin (2,71 mmol) vào 100 ml EtOH bình cầu hai cổ đáy tròn dung tích 250 ml, thêm tiếp 10 ml acid khảo sát Khuấy từ, nâng nhiệt độ hỗn hợp phản ứng lên 50°c Cân 1,50 g (23,08 mmol) bột kẽm hoạt hóa, thêm từ từ vào hỗn hợp phản ứng thành nhiều đợt thời gian khoảng 60 phút Đun hồi lưu, trì nhiệt độ phản ứng 50°c suốt trình phản ứng Theo dõi phản ứng SKLM với hệ dung môi ethyl acetat: n-hexan = 7:3 khoảng thời gian giờ, giờ, giờ, 4,5 giờ, giờ, so sánh với THC tinh khiết thu phản ứng Nhận thấy phản ứng kết thúc sau + Xử lý phản ứng (2): ■ Lọc loại kẽm dư ■ Trung hòa dịch lọc dung dịch NaOH 5M đến pH=7, chiết với dichloromethan lần, lần 20 ml ■ Lóp dung môi hữu gộp lại, thêm 5,00 g Na 2S0 , lắc đều, để yên khoảng để loại nước Sau lọc, dịch lọc đem cất loại dung môi máy cất quay chân không nhiệt độ 40°c ■ Tinh chế sản phẩm phương pháp sắc ký cột silica gel Kết trình bày bảng Bảng Kết khảo sát ảnh hưỏfng acid đến hiệu suất phản ứng bán tổng hợp tetrahydrocurcumin từ curcumin với tác nhân khử Zn/acid Rf(ethyi acetat: nKL sản Hpư Ghi Acid stt hexan = phẩm (g) 7:3) Acid acetic băng Không xuất vết THC Acid 0,55 54,50 95,0-98,0 0,69 hydrochloric đặc Acid sulfuric 0,50 49,54 95,0-98,5 0,69 đậm đặc Nhận xét: > Khi thực phản ứng với acid acetic, kiểm tra hỗn hợp phản ứng SKLM với hệ dung môi ethyl acetat; n-hexan so sánh với THC thu phản ứng hỗn họp phản ứng không thấy xuất vết THC > Thực phản ứng với acid hydrochloric (H=54,50%) cho hiệu suất phản ứng cao sử dụng acid sulfuric (H=49,54%) > Từ liệu trên, chọn acid hydrochloric để thực phản ứng - Khảo sát nhiệt độ phản ứng Sau chọn acid tối ưu cho phản ứng acid hydrochloric, tiếp tục khảo sát nhiệt độ phản ứng + Tiến hành phản ứng: Hòa tan 1,00 g curcumin (2,71 mmol) vào 100 ml EtOH bình cầu hai cổ đáy tròn dung tích 250 ml, thêm tiếp 10 ml acid hydrochloric bốc khói Cân 1,50 g (23,08 mmol) bột kẽm hoạt hóa, thêm từ từ vào hỗn họp phản ứng thành nhiều đợt thời gian khoảng 60 phút Nâng nhiệt độ phản ứng lên đến nhiệt độ khảo sát, trì nhiệt độ suốt trình phản ứng Theo dõi phản ứng SKLM với hệ dung môi ethyl acetat: n-hexan = 7:3, so sánh với THC tinh khiết thu phản ứng Tiến hành phản ứng + Xử lý phản ứng tinh chế sẳB phẩm giống (2) + Kết trình bày bảng Bảng Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất phản ứng bán tổng họp tetrahydrocurcumin từ curcumin với tác nhân khử Zn/HCl Rf (ethyl KL sản acetat: nstt r p u - r c ) T"„e CQ Hp„ (%) phẩm (g) hexan = 7:3) 95,0-98,0 0,69 37,65 25 0,38 0,69 95,5-97,0 0,45 44,59 30 95,0-98,0 0,69 47,56 40 0,48 95,0-98,0 0,69 54,50 0,55 50 96,0-97,5 0,69 52,52 60 0,53 Nhận xét > Nhiệt độ nóng chảy giá ừị Rf sản phẩm thu từ thí nghiệm khảo sát nhiệt độ khác chênh lệch đáng kế > nhiệt độ 25°c (nhiệt độ phòng), hiệu suất phản ứng thu thấp (37,65%) > Khi tăng dần nhiệt độ hiệu suất phản ứng tăng lên, đến 50°c, hiệu suất phản ứng cao (54,50%) Tiếp tục tăng nhiệt độ đến 60°c hiệu suất phản ứng lại giảm (52,52%) > Từ liệu trên, chọn nhiệt độ phản ứng tối ưu 50°c để thực phản ứng - Khảo sát tỷ lệ mol kẽm curcumỉn Sau lựa chọn điều kiện tối ưu cho phản ứng acid hydrochloric nhiệt độ tối ưu 50°c, tiếp tục khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ số mol kẽm số mol curcumin đến hiệu suất phản ứng + Tiến hành phản ứng: Hòa tan 1,00 g curcumin (2,71 mmol) vào 100 ml EtOH bình cầu hai cổ đáy ừòn dung tích 250 ml, thêm tiếp 10 ml acid hydrochloric bốc khói Cân lượng bột kẽm khảo sát hoạt hóa, thêm từ từ vào hỗn hợp phản ứng thành nhiều đợt thời gian khoảng 60 phút Nâng nhiệt độ phản ứng lên đến 50°c, trì nhiệt độ suốt trình phản ứng Theo dõi phản ứng SKLM với hệ dung môi ethyl acetat: n-hexan = 7:3, so sánh với THC tmh khiết thu phản ứng Tiến hành phản ứng + Xử lý phản ứng tinh chế sản phẩm giống (2) + Kết trình bày bảng Bảng Kết khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ mol kẽm/curcumin đến hiệu suất phản ứng với tác nhân khử Zn/HCl stt KL KL Tỷ lệ mol curcumin kẽm kẽm/ (g) 1,00 (g) curcumin 0,88 1,00 1,00 Rf (ethyl phẩm (g) Hp„ (%) 5/1 0,42 41,62 95,5-98,5 0,69 1,23 7/1 0,51 50,53 ,0 -9 ,0 0,69 1,50 8,5/1 0,55 54,50 ,0 -9 ,0 0,69 1,00 1,76 10/1 0,61 60,44 95,5-97,5 0,69 1,00 1,94 11/1 0,62 61,43 ,0-98,0 0,69 1,00 2,11 12/1 0,63 62,43 96,0-98,5 0,69 KL sản acetat: nhexan=7:3) Nhận xét: > Nhiệt độ nóng chảy giá trị Rf sản phẩm thu từ thí nghiệm ỉđiảo sát tỷ lệ mol khác chênh lệch đáng kể > Với tỷ lệ số mol Zn/curcumin 5/1 hiệu suất phản ứng thu thấp (41,62%) Khi tăng dần tỷ lệ số mol Zn/curcumin hiệu suất phản ứng tăng lên Khi tỷ lệ mol tăng đến 10/1 hiệu suất phản ứng tăng lên líhoảng 1,5 lần so với tỷ lệ mol 5/1 Tiếp tục tăng tỷ lệ mol Zn/curcumin lên 1 / , / hiệu suất tăng lên không đáng kể > Từ liệu trên, lựa chọn tỷ lệ mol Zn/curcumin tối ưu cho phản ứng / Kết xác định cấu trúc: IR (KBr) (cm'’): 3486 (-0H), 1608 (c = ceton), 1513 (-CHAr); ’H-NM R (500 MHz, DMSO-dó), ỗ (ppm): 2,56 (2H, t, -CH2), 2,66 (2H, t, -CH2), 2,74 (4H, t, -CH2), 3,73 (6 H, s, -CH3), 6,57 (2H, dd, - C H A r ) , ,6 (2H, d, - C H A r ) , 6,74 (2H, d, -CHAr), 8,69-8,71 (2H, s, 2-OH); ESI-MS (m/z): 373,9 [M+n]\ Bàn ỉuận Các phản ứng khử hóa curcumin không chọn lọc, sản phẩm phản ứng, tetrahydrocurcumin sản phẩm thường thu sản phẩm phụ sản phâm hydro hóa nối đôi sản phẩm khử hóa mức nhóm chức ceton không mong muốn Điều dẫn đến khó khăn việc tinh chế sản phẩm U m a x Trong phản ứng khử hóa với tác nhân kim loại kẽm môi trưòng acid, cần ý để ừánh làm giảm hoạt tính xúc tác bột kẽm, lượng kẽm nên cho vào ứiành nhiều đọt ừình phản ứng Phương pháp khử hóa curcumin với tác nhân khí hydro có xúc tác nhiều tác giả nghiên cứu Phương pháp có ưu điểm sản phẩm tưoTig đối sạch, điều kiện khử hóa ổn định; nhiên có nhược điểm khí hydro dễ gây nổ, cần ý vấn đề an toàn thực phản ứng Phương pháp khó ứng dụng quy mô lófn điều kiện Việt Nam Phương pháp khử hóa curcumin với tác nhâii kẽm môi ừường acid chưa có tài liệu công bố Phưcnig pháp có ưu điểm đơn giản, rẻ tiền, hiệu suất tốt, rág dụng ữong sản xuất quy mô công nghiệp Trên khảo sát bước đầu thực để lựa chọn phương pháp thích hợp ứng dụng cho sản xuất quy mô công nghiệp Chúng tiếp tục nghiên cứu phưomg pháp thích hợp để bán tổng họp tetrahydrocurcuminoids tìr hỗn họp curcuminoids chiết xuất từ nghệ ừong nước, tiến tới chủ động nguồn nguyên liệu teừahydrocurcumin cho sản xuất nước Kết luận Đã bán tổng hợp tetrahydrocurcumin từ curcumin quy mô phòng thí nghiệm với hai tác nhân khử hóa khí hydro có xúc tác Pd/C kẽm ừong môi trường acid khảo sát điều kiện phản ứng tối ưu Phản ứng khử hóa curcumin với tác nhân H 2/Pd(C) cho hiệu suất tối ưu thực phản ứng dung môi ethanol tuyệt đối, tỷ lệ xúc tác 5%, thời gian 18h (H=65,40%) Phản ứng khử hóa curcumin với tác nhân kẽm môi trường acid cho hiệu suất tối ưu thực phản ứng với acid hydrochloric 50°c, tỷ lệ số mol Zn/HCl 10/1 (H=60,44%) Tài ỉiệu tham khảo Nguyễn Gia Chấn (2006), “Những công trình nghiên cứu 2003-2004 tác dụng curcumin”, Tạp Dược liệu, tập 11, số 2, tr 88 - 95 Vũ Đình Hoàng, Hoàng Xuân Tiến, Trần Khắc Vũ (2011), “Phương pháp đơn giản tổng hợp tetrahydrocurcuminoid”, Tạp khoa học công nghệ trường đại học kỹ thuật Nguyễn Thị Những (2012), “Nghiên cứu bào chế tìiuốc dùng qua da chứa teừahydrocurcumin”, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Trưòfng Đại học Dược Hà Nội Ching-Shu Lai, Jia-Ching Wu, Shih-Feng Yu, Vladimir Badmaev, Kalyanam Nagabhushanam, Chi-Tang Ho and Min-Hsiung Pan (2011), “Tetrahydrocurcumin is more effective than curcumin in preventing azoxymethane-induced colon carcinogenesis”, Mol Nutr Food Res.2011,55, pp 1819-1828 Osawa T, Sugiyama Y, Inayoshi M, Kawakishi S (1995), “Antioxidative activity of tetrahydrocurcuminoids”, Biosci Biotechnol Biochem, 59(9), pp 16091612 Portes E., Gardrat C., Castellan A (2007), “A comparative study on the antioxidant properties of tetrahydrocurcuminoids and curcuminoid”, Tetrahedron, 63(37), pp 9092-9099 Simon A (1998), “Inhibitory effect of curcuminoids on mcf-7 cell proliferation and structure-activity relationsihp”, Cancer let, pp 111-116 Su-Lin Lee et al (2005), “Preparation and anti-flammatory activities of diarylheptanoid and diarylheptylamine analogs”, Bioorgnic & Chemistry 13, 2005, pp 6175-6181 Vogel’s, ''Textbook o f practical organic chemistry", pp 318  ... pháp thích hợp ứng dụng cho sản xuất quy mô công nghiệp Chúng tiếp tục nghiên cứu phưomg pháp thích hợp để bán tổng họp tetrahydrocurcuminoids tìr hỗn họp curcuminoids chiết xuất từ nghệ ừong... nghệ ừong nước, tiến tới chủ động nguồn nguyên liệu teừahydrocurcumin cho sản xuất nước Kết luận Đã bán tổng hợp tetrahydrocurcumin từ curcumin quy mô phòng thí nghiệm với hai tác nhân khử hóa khí... gel Kết trình bày bảng Bảng Kết khảo sát ảnh hưỏfng acid đến hiệu suất phản ứng bán tổng hợp tetrahydrocurcumin từ curcumin với tác nhân khử Zn/acid Rf(ethyi acetat: nKL sản Hpư Ghi Acid stt hexan