KHẢO SÁT S ự ĐA DẠNG HÀM LƯỢNG ROTUNDIN TRONG MỘT SỐ LOÀI STEPHANIA LOUR VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẤC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO Pham Thi Viêt Hồng' HDKH: TS Nguyễn Quốc Huy^, DS Trần Kiều Duyên^ 'lớ p M2K65 - Trường Đại học Dược Hà Nội ^Bộ môn Thực vật - Trường Đại học Dược Hà Nội ^ Lớp CH17, Công ty Mediplantex Từ khoá: bình vôi, HPTLQ rotundỉn, sắc kỷ ỉớp mỏng hiệu cao, Stephania Lour Tóm tắt Xây dựng quy trĩnh định lượng rotundin số loài Stephania Lour lưu Việt Nam phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu cao (HPTLC) Thẩm định sổ tiêu phương pháp: độ đúng, độ lặp lại, độ đặc hiệu độ tuyến tỉnh Khảo sát hàm lượng rotundin sổ loài Stephania Lour lưu Việt Nam phương pháp xây dựng đánh giá đa dạng hàm lượng rotundin loài nghiên cứu Đặt vấn đề Rotundin alcaloid có số loài thuộc chi Stephania Lour Hàm lượng rotundin loài tương đối khác Dựa vào hàm lượng rotundin sơ phân loại loài với Có nhiều phương pháp định lượng rotvmdin nghiên cửu HPLC [2], phương pháp đo quang [7], đo diện tích vết [4] Trên sở sắc ký lớp mỏng hiệu cao HPTI.C có số ưu điểm phưong pháp HPLC thời gian ngắn phân tích song song nhiều mẫu giá thành thấp Vì vậy, nghiên cửu tiến hành nghiên cứu quy ừình định lượng nhanh hàm lượng rotundin phương pháp HPTLC số loài Stephania Lour lưu Việt Nam Qua đánh giá đa dạng hàm lượng rotundin ừong loài Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu Nguyên liệu Mau thử mẫu chuẩn Mau chuẩn: Chuẩn rotundin (Viện Kiểm Nghiệm Trung ương) Mau thừ: Bột thô củ loài Stephanỉa brachyandra Diels (Bl); Stephania dielsiana Y.C.Wu (B2); Stephanỉa sinica Diels (B3); Síephania gỉabra (Roxb) Miers (B4); Stephanỉa kwangsỉensis H.S.LO (B5); Síephania venosa (BIO) (TS Nguyễn Quốc Huy cung cấp) Thiểt bị hoá chất Thiết bị: Bộ dụng cụ chiết ngấm kiệt, dụng cụ khai triển HPTLC (gồm máy chấm mỏng Linomat 5, máy khai triển sắc ký Camag ADC2, máy soi UV), bình kliai triển sắc ký TLC Hoá chất: Methanol, Cloroform đạt tiêu chuẩn DĐVN IV Phương pháp nghiên cứu Quy trình định lượng - Lựa chọn điều kiện chiết mẫu; Lựa chọn phương pháp dung môi chiết phù hợp với dược liệu hoạt chất cần tách chiết [3] Xác định độ pha loãng phù họp cho mẫu thử: Các mẫu thử sau chiết cô tới cắn pha với thể tích Methanol khác Hiện màu vết máy soi u v Tiến hành khai triển sắc ký với hệ sắc ký phù hợp để kiểm tra khả tách vết độ đậm màu vết tỷ lệ pha loãng khác [4] Lựa chọn điều kiện khai triển HPTLC: Lựa chọn thông số máy HPTLC để phù hợp mẫu phân tích giảm thiểu sai số phương pháp [9] Thẩm định phương pháp nghiên cứu: Tiến hành triến khai sắc ký phương pháp HPTLC, định lượng hàm lượng mẫu phưong pháp so màu dựa vào phần mềm Videoscan Khảo sát, tính toán độ đặc hiệu, tính tuyến tínli, độ lặp lại độ phương pháp dựa vào thông số Idiai triển sắc ký thu [1], Khảo sát hàm lượng roíundỉn số loài Síephania Lour, Việt Nam Các mẫu bình vôi B l, B2, B3, B4, B5, BIO tiến hành chiết xuất, định lượng phưcmg pháp HPTLC với điều kiện đưa nghiên cứu Kết Xây dựng quy trình định lượng Lựa chọn điều kiện chiết mẫu Lựa chọn phương pháp chiết ngấm kiệt phương pháp đơn giản, thiết bị sẵn có, Idiả chiết kiệt tốt Dung môi chiết Methanol, Methanol dung môi có khả chiết tốt tất chất, khả chiết kiệt tốt, giá rẻ Xác định độ pha loãng phù hợp cho mẫu thử Cấc mẫu thử sau Idìi chiết cô tới cắn phalại Methanol với thể tíchkhác là: 100 ml; 125 ml; 150 ml So sánh khả tách, độ đậm màu độ pha loãng khác nhận thấy pha loãng với 125 ml cho kết tốt Lựa chọn điều kiện triển khai sắc ký Hệ dung môi khai ữiển chọn MeOH - Cloroform (9:1), lựa chọn điều kiện sắc ký bảng Bảng 1, Các điều kiện khai ừiển HPTLC máy Camag Thông số HPTLC Lượng mẫu chấm Pha tĩnh Thời gian bão hoà dung môi Thời gian bão hoà mỏng Thời gian sây khô bàn mỏng khai triên Chỉ tiêu 2\ủ Silicagel GF254 20 10 ’ ’ Kử Iv auả; Định Đinh lượng lươne băng phương Xử lý kêt quả; pháp xây dựng đưòfng chuấn, sử dụng phần mềm VideoScan Thẩm định phương pháp nghiên cứu Chuẩn bị mẫu Mầu chuẩn; Từ chuẩn rotundin, pha thành dung dịch chuẩn gốc mg/ml.Từ dung dịch chuẩn gốc pha thành dãy dung dịch chuẩn có nồng độ lần lưọt 0,6 mg/ml; 0,8 mg/ml; 1,0 mg/ml; 1,5 mg/ml; mg/ml; mg/ml Các chuẩn ký hiệu Cl; C l’; C2; C3; C4; C5 Mau thử: Thêm chuẩn có nồng độ 0,6 mg/ml; 0,8 mg/ml; 1,0 mg/ml vào dịch chiết mẫu thử B4 pha loãng, dịch chiết mẫu thử B4 Khảo sát độ đặc hiệu phương pháp Tiến hành khai triển sắc ký với mẫu trắng (dung dịch Methanol), mẫu thử (dịch chiết B4), mẫu chuẩn (C4) Kết quả; Mau thử B mẫu chuẩn C4 có giá ứị Rf đo 0,653 0,654 Giá trị Rf có độ lệch chuẩn RSD 0,1082% sắ c ký đồ mẫu trắng không xuất pick khoảng thời gian lưu tưcmg ứng với thời gian lưu chất chuẩn Khảo sát độ tuyển tỉnh Khảo sát với mẫu chuẩn có nồng độ lần 60000 lượt là: 0,6 mg/ml; 1,0 50000 mg/ml; 1,5 mg/ml; 3,0 40000 mg/ml; 4,0 mg/ml 30000 Hệ số tương quan r tính 20000 10000 toán là; 0,998957 Nhận xét: Phương pháp có hệ số tương quan khoảng giá trị chấp Hình Đô thị khảo sát độ tuyến tính phương pháp nhân 80000 70000 Khảo sát độ lặp lại phưomg pháp Mẩu khảo sát B4 chấm vết khác mỏng sắc ký Kết Rf, diện tích pick sắc ký Bảng Kết khảo sát độ lặp lại phương pháp Rf Diện tích pick 0,637 53968,9 0,640 53603,9 0,640 53636,8 0,643 55009,4 0,646 56426,0 0,649 57413,7 Trung bình 0,6425 55009,78 RSD (%) 0,687 2,90 v ế t số Nhận xét: Giá trị RSD tính theo số Rf mẫu nhỏ cho độ tin cậy cao, Giá trị RSD tính theo số diện tích pick sắc ký mẫu tương đối lón diện tích pick tính toán dựa ừình chọn độ rộng chân pick gây sai số lớn Khảo sát độ Sử dụng phương pháp thêm chuẩn Khảo sát mẫu thử có hàm lượng rotundin mức khoảng 80%, 100% 120 % so với mức hàm lượng lý thuyết Tại mức nồng độ, thực mẫu độc lập Xác định tỷ lệ thu hồi hoạt chất Bảng Kết khảo sát độ phương pháp Tỷ lệ thu hôi Nồng độ tìm lại Nồng độ chuẩn thêm vào vết số (mg/ml) (mg/ml) (%) 97,43 0,234 0,228 94,21 0,242 0,228 83,51 0,273 0,228 76,89 0,385 0,296 77,69 0,381 0,296 76,89 0,385 0,296 93,43 0,396 0,370 92,50 0,370 0,400 0,407 90,90 0,370 87,05 Trung bình 7,91 RSD (%) Nhận xét: Giá trị RSD phưong pháp cao, sai số lớn trình pha mẫu thử để khảo sát, mẫu sau Ichi pha không bảo quản điều kiện ứiích họp gây biến đổi rotvmdin Khảo sát hàm lượng rotundin số loài Stephanỉa Loiir Việt Nam I t â ả ậ ỉam pte â Các mẫu bình vôi tiến hành địnli lượng theo quy trìnli trình bày Kết khảo sát hàm lượng rotundin loài theo phương pháp hình 2; 3; bảng ị I - c A Ì l ' Ì *1' ỉ ' ỉí tĩ ỉi Hình2 Pick sắc ký mẫu thừ B sdv=3,12% area ỉí»« ỉcóỉií tí5 ĩíỉ iCKỄỈ Í5ÍCỈ ^ * C1 a ^ o C5 C3 C4 C5 B I B2 B3 B4 BS BÍQ Hình Sắc ký đồ mẫu bước sóng 366 nm ỉ ỉ! Hình Đường chuẩn thể mối quan hệ diện tích pick hàm lượng rotundin Mẩu Khối lưọng cân(g) Hàm ẳm(%) Nồng độ(%g/ml) Hàm Iưọ-ng(yo) B5 10,00 11,98 2,5 3,61 BIO 10,00 8,67 0,31 0,43 Nhận xét: Hàm lượng rotundin mâu khác tương đôi rõ rệt B loài có hàm lượng rotundin cao (6,25%), loài B3, B4, B5 có hàm lượng tương đồng (3,02% đến 4,53 %) Hai loài B2 BIO có hàm lượng rotundin tương đổi thấp so với loài lại Bàn luận Phương pháp HPLC có độ nhạy khả phân tích mẫu tốt so với phương pháp HPTLC, nhiên phương pháp HPTLC có khả bán định lượng nhanh nhiều mẫu lần triển khai, tiết kiệm thời gian, giá thành thấp ứng dụng khảo sát nhanh thay đổi hàm lượng mẫu Bên cạnh phương pháp HPLC, rotundin nghiên cứu định lượng phương pháp đo quang [7] phương pháp đo diện tích vết mỏng TLC [4], So với phương pháp trên, phương pháp HPTLC có cải tiến việc định lượng dựa khả hấp thụ ánh sáng vết bước sóng 366 nm, đo cường độ màu toàn diện tích vết đưa đường chuẩn chiều cao diện tích pic mẫu chuẩn để tính toán hàm lượng mẫu thử, phương pháp HPTLC sử dụng mỏng kính việc đưa mẫu lên mỏng triển khai sắc ký thực máy Linomat ADC có độ xác cao so với phương pháp đo diện tích vết Hàm lượng Rotundin loài khảo sát phương pháp HPTLC so với phương pháp HPLC có khác loài, nhiên khác hàm lượng rotundin tưang đối loài không thay đổi Bảng Ket định lượng hàm lượng rotundin phưong pháp HPLC Mâu Hàm lưọng rotundin (%) TLTK BI 3.71 [5] B2 0,40 [5] B3 2.43 [5] B4 2,1 [6] B5 1,8 [6] Căn vào kết khảo sát hàm lưọng rotundin phương pháp HPTLC, phân loại loài nghiên cứu thành hai nhóm Nhóm - gồm loài B l, B3, B4, B5 có hàm lượng rotudin tương đối cao Nhóm - gồm loài B2, BIO có hàm lượng rotundin thấp nhiều Ket phù hợp với nghiên cứu công bố trước loài Dựa vào phương pháp HPTLC, phân loại nhanh loài đồng thời sắc ký đồ hàm lượng rotundin loài Kết luận Nghiên cứu đưa quy trình định lượng hàm lượng rotundin phương pháp HPTLC; Chọn dung môi chiết; methanol, hệ dung môi khai triển sắc ký: Chloroform - Methanol (9:1), điều kiện sắc ký với thông số lượng mẫu chấm (2 thời gian bão hoà dung môi (20 phút), thời gian bão hoà mỏng (10 phút), thời gian sấy khô mỏng (5 phút); thẩm định độ với RSD 7,91%; độ lặp lại với RSD 2,9 %; độ tuyến tính với r 0,998957 Đã tiến hành khảo sát phương phápHPTLC đa dạng hàm lượng rotundin số loài Bình Vôi cho thấy hàm lượng chia nhóm: (i) Nhóml (có hàm lượng rotundin cao); Stephania brachyandra Diels (Bl); Stephania sinica Diels (B3); Stephania glabra (Roxb) Miers (B4); Stephania kwangsiensis H.S.LO (B5) với hàm lượng 6,25%; 3,05%; 4,03%; 3,61%; (ii) Nhóm (có hàm lượng rotundin thấp); Stephania dieỉsiana Y.C.Wu (B2); Stephania venosa (BIO) với hàm lượng 0,2%; 0,43% Tài liệu tham khảo I Bộ Y Tế (2012), Khoả đào tạo thẩm định quy trình phân tích SKLMvà HPLC thuốc Đông dược Bộ Y Tế (2009), Dược điển Việt Nam IV Phạm Thị Duyên (2004), Nghiên cứu định lượng L-tetrahydropalmatin dược liệu bình vôi chế phẩm viên nang cứng Heatos phương pháp sắc ký lóp mỏng hiệu cao (HPLC), Luận văn Thạc sĩ dược học Mai Thị Hằng (2008J, Xây dựng phương pháp định lượng nhanh Rotundin bán thành phẩm Sen vông - R, Khoá luận tốt nghiệp dược sĩ Nguyễn Quốc Huy (2010), Nghiên cứu thực vật, thành phần hoá học, số tác dụng sinh học số loài thuộc chi Stephania Lour, Việt Nam, Luận án tiến sĩ dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội Lã Đình MỠI, Trần Minh Hợi, Dương Đức Huyến, Trần Huy Thái, Ninh Khắc Bản (2005), Chi Bình vôi - Stephania Lour 1790, Tài nguyền thực vật Việt Nam (Những chứa hoạt chất có hoạt tính sinh học), tập I, tr 58-82 7 Nguyễn Tiến Vững (2000), Nghiên cứu thực vật, hoá học tác dụng sinh học số loài thuộc chi Stephania Lour, Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Dược học, Trường Đại Học Dược Hà Nội Biodiversity Conservation and Managerment Thematic Group (2010), Analysis o f Berberin Content using HPTLC fingerprinting o f root and Mark o f the Himalayan Berberis Species ManMohan Srivastasva (2011), High - Performance Thin - Layer Chromatography (HPTLC)  ... thử, phương pháp HPTLC sử dụng mỏng kính việc đưa mẫu lên mỏng triển khai sắc ký thực máy Linomat ADC có độ xác cao so với phương pháp đo diện tích vết Hàm lượng Rotundin loài khảo sát phương pháp. .. dụng khảo sát nhanh thay đổi hàm lượng mẫu Bên cạnh phương pháp HPLC, rotundin nghiên cứu định lượng phương pháp đo quang [7] phương pháp đo diện tích vết mỏng TLC [4], So với phương pháp trên, phương. .. xét: Phương pháp có hệ số tương quan khoảng giá trị chấp Hình Đô thị khảo sát độ tuyến tính phương pháp nhân 80000 70000 Khảo sát độ lặp lại phưomg pháp Mẩu khảo sát B4 chấm vết khác mỏng sắc ký