m Tài liệu tham khảo Bộ Nông nghiệp phát triển nông thôn (2001), Ngũ cốc-Phưong pháp xá c định alíatoxin, Tuyển tập tiéu chuẩn nôngnghiệpViệt Nam -Tập IV-tiêu chuẩn nông sản, Trung tâm thông tin nông nghiệp phát triển nông thôn, tr 51-58, Bọ Y tế (2009), D ược a é n Việt Nam IV, Nha xuất Y học, P L 9.6 Trần Việt Hùng (2005), Khảo sá t nghién cú u kiểm nghiệm só hóa chất báo vệ thục vật tồn d ừong du ọ c liệu, Luận án tiến sỹ dược học K.Arrus, G Blank, D.Abramson, R CIear, R.A.Holley (2004), AHatoxin production by Aspergillus flavus in Brazil nuts Journal of stored products Research, pp.513-527 International Conference on Harmonization (ICH ) of Technical Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use, Validation of Analytical Procedurei.Text and Methodology (1996) ICH-Q2B, Geneva, International Conference on Harmonization (ICH) of Technical Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use, Valida­ tion of Analytical Procedures-.Text and Methodology (1996) ICH-Q2B, Geneva, NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỐNG PHÂN CỦA OFLOX­ ACIN BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO • Nguyễn Thị Kiều Anh, Quách Ngọc Luyến, Vũ Thị Minh Quỳnh Trường Đại học Dược Há Nội SU M M ARY A rapid, sim ple a n d accurate high - perfo rm a nce liquid chrom a tog rap hic m etho d with uv d e tecto r has been developed an d validated fo r separation, identification a n d quan titation o f ofloxacin enantiom ers in finished products The chrom atographic codltions a re a s fo llo w s: Phenom enex C Í (250X 6m m ; 5ụm ) colum n ; m obile ph a se: m ethanol/w ater 14:86 v/v, containing 2,0 m m ol/l L-leudne a n d 0,6 m m ol/l Cu^* a t flow rate o f 0.9 m l/m ln; u v detection a t 293 nm ; in ject volum e: ụl Baseline separation o f the tw o enantiom ers w as o bta in ed with resolution o f 4,63 w ithin ab ou t 17 m ins o f an alytical time The m etho d was u sed to analyze the ofloxacin enantlom ers In m edicines T k h ó a : định lượng, levo flo xad n , sá c k ý lỏng hiệu n ăng cao, tách đô n g phân Đặt vấn để Ofloxacin (OFL) kháng sinh quinolon hệ 2, có carbon bất đói nén ofloxacin có đóng phân đói quang (S)-ofloxacin (Levofloxacin) (R)-ofloxacin (dextrofloxacin) OFL lưu hành thị trường dạng đơn thành phẩn Levofloxacin (LEV) dạng hỗn hợp racemic Ngày nhiéu dược phẩm chứa dạng đơn đống phân LEV sử dụng hiệu lực kháng khuẩn chứng minh mạnh gấp 8-128 lần so với dạng R [2] Việc xác định đơn đóng phân nói chung đóng phân OFL nói riêng chưa có nhiéu nghiên cứu Việt Nam, LEV sử dụng dạng thuốc viên, thuốc tiêm, thuốc nhỏ mắt, Tuy nhiên, việc kiểm tra chất lượng dạng thuóc nhỏ mát khó khản phải chiết tách lấy lượng hoạt chất lớn để xác định vé mặt định tính, định lượng tién hành phép phân tích riéng Trong báo cáo này, xin trình bày kết nghiên cứu phương pháp định tính định lượng đóng thời phân ofloxacin sắc ký lỏng hiệu cao Đối tượng phương pháp nghiên cứu Máy móc, thiết bị Máy sắc ký lỏng hiệu cao - HPLC Agilent 1260 detectơ u v (Mỹ), Cân phân tích Mettler Toledo AB 204, d = 0,1 mg; e = 1mg (Thụy sĩ), Hóa chất, chất chuẩn - Methanol loại tinh khiết dùng cho HPLC (Merck - Đức), S6 2/2012 Nghiên cúu dượcThỏng tin thuỗc 55 - Các hóa chất, thuóc thử Natri hydroxyd, kẽm Sul­ fat (ZnSO^JHp); đóng Sulfat (CuSO^.SHjO); nhôm clorid (AICụôH^O); L-leucin; L-lsoleucin; L-phenylalanin, L- valin, L- methionin, L-lysin, L- asparagin, L-threonin (đạt độ tinh khiết phân tích) Chất đối chiếu: Ofloxacin chuẩn, hàm lượng 99,99%; levofloxacin chuẩn, hàm lượng 100% Viện Kiểm nghiệm thuốcTW cung cấp Đối tượng nghiên cứu Thuốc nhỏ mắt Oflovid, số lô TR3114, HD: 200513; Thuốc nhỏ mát Cravit, số lô CV1251, HD: 130413 Thuốc nhỏ mắt Lecinflox, só lô E101905; HD 15/11/2013 Thuốc nhỏ mát Levoquin, số 10^10209, HD: 02.2012 Phương pháp nghiên cứu Dùng phương pháp HPLC pha đảo với detectơ uv, tiến hành: - Khảo sát, lựa chọn tối ưu hóa điều kiện phân tích: Chất chọn lọc đóng phân đối quang (ion kim loại, acid amin), cột sắc ký (loại cột, kích cỡ, ), thành phẩn pha động, lựa chọn điều kiện phân tích khác: thể tích tiêm mẫu, bước sóng -Thẩm định phương pháp phân tích với tiêu: độ chọn lọc, khoảng nóng độ tuyến tính, độ đúng, độ xác Kết nghiên cứu Khảo sát lựa chọn điều kiện phán tích Tiến hành khảo sát điểu kiện phân tích lựa chọn chương trình sác ký phù hợp để tách, định tính định lượng phân O FL Cụ thể sau; - Cột sác ký: dùng loại cột Hypersil C18 BDS (4,6x250mm, 5nm); Zorbax C18 (3x150mm; 3,5|jm); Phenomenex C18 (250x4,6mm, 5|im) - Lon kim loại tạo phức: AP+, - Chất chọn lọc phân: acid amin L-leucin, L-lsoleucin, L-valine, L-phenylalanin, Lmethionin, L-lysin, L-asparagin, L-threonin - Pha động: tỷ lệ pha hữu pha nước, lưu lượng dòng - Nồng độ chất phân tích thể tích tiêm mẫu - Bước sóng phát hiện: lựa chọn bước sóng cực đại - Và xác định điều kiện phân tích cụ thể là: - Cột sắc ký: Phenomenex C18 (250 X 4,6mm; 5|im) - Pha động; MeOH:Hp=14:86 (tt/tt) chứa 0,6 mmol/L Cu^'^va 2mmol/L L-leucin - Lưu lượng dòng: 0,9 ml/phút - Detector UV bước sóng: 293 nm - Thể tích tiêm mẫu: 5|jl Thẩm định phương pháp phán tích Độ phù hợp hệ thống sốc ký Tiến hành sác ký lặp lại lần dung dịch OFL chuẩn dung dịch LEV chuẩn đểu nóng độ 0,05mg/ml theo điểu kiện sắc ký lựa chọn Kết sau: Sau lẩn tiêm lặp lại dung dịch LEV chuẩn dung dịch OFL chuẩn, cho thấy giá trị RSD diện tích pic thời gian lưu có độ lặp lại tốt (RSD < 2%), thời sắc đồ dung dịch OFL hai pic (S)-ofloxacin (R)-ofloxcin tách rời khỏi (R khoảng 4,20), chứng tỏ điều kiện hệ thống HPLC ổn định phù hợp để định tính định lượng LEV Bàng Kẽtqmâánhýáíộĩhiihợpcũahệtììỗagsòckị O floxacin Levofloxacin STT s (m AU.s) (phút) S jim A U s) ‘ r -s (phút) 1779,8 17,317 950,2 17,121 1778,0 17,297 963,7 17,092 1764,4 17,303 968,1 17,214 1756,7 17,389 942,5 17,033 1807,9 17,250 956,8 17,365 1786,5 16,898 959,0 17,196 TB 1778,88 17,24 956,72 17,20 RSD% ,0 ,0 0,96 0,74 1Nghiên CỨU dược Thòng tỉnthuõc: Số2/2012 *R-R (phút) 19.46 19.17 19 Í8 19.20 19.52 19.36 19.35 0,72 R 4,20 4,25 4,18 4,15 4,28 4,23 4,22 m B Độ Tiến hành theo phương pháp thêm chuẩn (thêm 10% so với nồng độ mẫu thử) Kết trình bày bảng Tính chọn lọc Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn LEV 0,05mg/ ml; dung dịch chuẩn OFL 0,05mg/ml mẫu trắng dung môi pha mẫu.Tỉến hành sắc ký theo điếu kiện lựa chọn, kết trình bày hình 1: Kết hình cho thấy, sắc đổ mẫu trắng, vị trí tương ứng xuất pic đóng phân OFL pic LEV không thấy xuất pic lạ Đổng thời sắc ký đổ hình 1C xuất pic phân OFL Như phương pháp phân tích có độ chọn lọc cao Khoáng nồng độ tuyến tính Chuẩn bị dây dung dịch chuẩn LEV có nổng độ 0,04-0,06mg/ml Tiến hành sắc ký, kết thu sau: STT S,^,;(m AU.s) ^chuín«mlại^^9^ mi) % tìm lại 1680,4 0,00518 100,5 1680,7 0,00519 100,7 1679,3 0,00514 99,8 1680,3 1681,2 Bảng Kết đáp ứng diện tích pic theo nỗng độ Levofloxacin 0,00517 c (mg/ml) 0,040 0,045 0,050 0,055 0,060 s (mAU.s) 1543,3 1647,1 1764,4 1877,9 1982,7 Phương trình hói quy Y = 22192X + 654,4 = 0,999 Kết bảng cho thấy nồng độ khảo sát, độ lặp lại phép thử song song tốt, với RSD 0,45% ( ... L-threonin (đạt độ tinh khiết phân tích) Chất đối chiếu: Ofloxacin chuẩn, hàm lượng 99,99%; levofloxacin chuẩn, hàm lượng 100% Viện Kiểm nghiệm thuốcTW cung cấp Đối tượng nghiên cứu Thuốc nhỏ mắt Oflovid,... tốt (RSD < 2%), thời sắc đồ dung dịch OFL hai pic (S)-ofloxacin (R)-ofloxcin tách rời khỏi (R khoảng 4,20), chứng tỏ điều kiện hệ thống HPLC ổn định phù hợp để định tính định lượng LEV Bàng Kẽtqmâánhýáíộĩhiihợpcũahệtììỗagsòckị... chứa L-leucin Cu^+để tiến hành nghiên cứu xây dựng phương pháp hướng nghiên cứu nhận thấy cho kết tốt nghiên cứu [5], [6] với hệ só tương quan cao 0,999) Kết thẩm định phương pháp độ chọn lọc,