TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH- KTNN _*** _ LÊ THỊ MINH PHƢƠNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI TRƢỜNG ẢNH HƢỞNG TỚI KHẢ NĂNG SINH CELLULASE TỪ MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC ĐƢỢC PHÂN LẬP Ở VĨNH PHÚC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Chuyên ngành: Vi sinh vật học Ngƣời hƣớng dẫn khoa học TS Phƣơng Phú Công HÀ NỘI - 2010 Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới giảng viên - TS Phương Phú Công hướng dẫn, bảo tận tình, giúp đỡ, tạo điều kiện để em thực hoàn thành tốt luận văn Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô môn Vi sinh vật Đồng thời em xin cảm ơn Ban giám hiệu trường ĐHSP Hà Nội 2, khoa Sinh – KTNN, phòng thí nghiệm vi sinh, thư viện tạo điều kiện giúp đỡ để em hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp Ngoài ra, em xin cảm ơn giúp đỡ, động viên bạn bè, gia đình suốt trình làm đề tài Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2010 Sinh viên Lê Thị Minh Phương Lê Thị Minh Phương K32D – Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các kết nghiên cứu, số liệu trình bày khóa luận hoàn toàn trung thực không trùng với kết tác giả khác Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2010 Tác giả Lê Thị Minh Phương Lê Thị Minh Phương K32D – Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT CMC : Carboxylmethyl cellulose M3 : Mẫu M6-1 : Mẫu 6-1 M5-3 : Mẫu 5-3 Cx : Endoglucanase C1 : Exoglucanase CBH : Celobiohydrolase SSA : Vùng bề mặt đặc hiệu (SSA) cellulose Lê Thị Minh Phương K32D – Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội DANH MỤC HÌNH TRONG LUẬN VĂN Hình 1.1 Cấu trúc lập thể phân tử cellulose Hình 1.2 Cấu trúc cellulose Hình 1.3 Sơ đồ trình thủy phân cellulose theo Erickson,1973 Hình 3.1 Khả sinh cellulase số chủng nấm mốc phân lập 27 Hình 3.2 Đặc điểm hình thái chủng M3 M6-1 29 Hình 3.3 Ảnh hưởng pH đến khả sinh cellulase 30 Hình 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính cellulase 32 Hình 3.5 Khả sinh cellulase chủng M3 M6-1 250C 300C 33 Hình 3.6 Ảnh hưởng thời gian đến hoạt tính cellulase 34 Hình 3.7 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh cellulase 35 Hình 3.8 Khả sinh cellulase chủng Penicillium M3 Aspergillus M6-1 nguồn nitơ NaNO3 .36 Lê Thị Minh Phương K32D – Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội DANH MỤC BẢNG BIỂU TRONG LUẬN VĂN Bảng 1.1 Các thành phần ligno – cellulose enzyme phân giải nấm Bảng 1.2 Hàm lượng cellulose số nguyên liệu Bảng 3.1 Các chủng vi sinh vật có khả phân giải cellulose 26 Bảng 3.2 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính cellulase 30 Bảng 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính cellulase 31 Bảng 3.4 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh cellulase 33 Bảng 3.5 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh cellulase 35 Lê Thị Minh Phương K32D – Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp MỤC LỤC Lời cảm ơn Lời cam đoan Danh mục từ viết tắt Danh mục hình luận văn Danh mục bảng biểu luận văn Mở đầu CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cellulose 1.2 Hệ thống cellulase 1.3 Cơ chế phân giải cellulose 1.4 Ứng dụng cellulase 11 1.5 Các nhóm vi sinh vật phân giải cellulose 15 1.5.1 Nấm sợi 15 1.5.2 Vi khuẩn 16 1.6 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp cellulase vi sinh vật 17 1.6.1 Giống vi sinh vật 17 1.6.2 Nguồn dinh dưỡng 18 1.6.3 Điều kiện nuôi cấy 19 CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu vi sinh vật 21 2.1.1 Nguyên liệu 21 2.1.2 Môi trường 21 2.1.2.1 Môi trường bảo quản giữ giống 21 2.1.2.2 Môi trường nuôi cấy 21 2.1.2.3 Môi trường thử hoạt tính enzyme 22 2.1.3 Hóa chất- thiết bị 23 Lê Thị Minh Phương K32D – Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2.1.3.1 Hóa chất 23 2.1.3.2 Thiết bị 23 2.2 Phương pháp nghiên cứu 23 2.2.1 Phương pháp vi sinh 23 2.2.2 Phương pháp hóa sinh 24 2.2.2.1 Xác định hoạt tính enzyme phương pháp cấy chấm điểm 24 2.2.2.2 Xác định hoạt tính enzyme phương pháp khuếch tán môi trường thạch (William, 1983) 24 2.2.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố môi trường đến hoạt tính cellulase 25 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Tuyển chọn chủng nấm mốc có hoạt tính phân giải cellulose 26 3.2 Ảnh hưởng số điều kiện nuôi cấy đến khả sinh cellulase chủng M3 M6-1 30 3.2.1 Anh hưởng pH đến khả sinh cellulase 30 3.2.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh cellulase 31 3.2.3 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh cellulase 33 3.2.4 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh cellulase 34 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO Lê Thị Minh Phương K32D – Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Vi sinh vật đóng vai trò vô quan trọng tự nhiên sống người Nó tham gia vào tất vòng tuần hoàn vật chất tự nhiên, khâu quan trọng chuỗi, lưới thức ăn hệ sinh thái, có vai trò quan trọng trình tự làm môi trường tự nhiên Vi sinh vật tham gia vào trình phân hủy cellulose – hợp chất hữu có nhiều đất, thành phần cấu tạo nên thể thực vật Ở Bông cellulose chiếm 90% trọng lượng khô, loài gỗ khác cellulose chiếm 40-50% Có nhiều nhóm vi sinh vật có khả phân giải cellulose như: vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc, niêm vi khuẩn…Nhưng đáng ý nấm mốc Phân bố khắp nơi, có khả sinh cellulase phức hệ enzyme quan trọng trình phân giải cellulose tự nhiên ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực như: công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp dược phẩm, công nghệ môi trường… Đặc biệt cellulase sử dụng có hiệu chăn nuôi, số enzyme thường bổ sung vào thức ăn gia súc nhằm phân giải chất dinh dưỡng thức ăn giúp cho vật tiêu hóa tốt Tuy nhiên Việt Nam chế phẩm enzyme thường phải nhập với giá thành cao nên việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm enzyme để ứng dụng chăn nuôi vấn đề cần thiết Từ lý chọn đề tài “Nghiên cứu số yếu tố môi trƣờng ảnh hƣởng tới khả sinh cellulase từ số chủng nấm mốc đƣợc phân lập Vĩnh Phúc” Lê Thị Minh Phƣơng K32D Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Mục tiêu đề tài Mục tiêu đề tài “Nghiên cứu số yếu tố môi trƣờng ảnh hƣởng tới khả sinh cellulase số chủng nấm mốc đƣợc phân lập Vĩnh Phúc’’ nhằm tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy số chủng nấm mốc để sinh cellulase nhiều Nội dung đề tài - Phân lập, tuyển chọn số chủng nấm mốc có khả sinh cellulase huyện Yên Lạc, thành phố Vĩnh Yên, Xuân Hòa (Vĩnh Phúc) - Thử hoạt tính cellulase số chủng nấm mốc phân lập - Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố môi trường đến khả sinh tổng hợp cellulase số chủng nấm mốc + Anh hưởng pH đến khả sinh cellulase + Anh hưởng nhiệt độ đến khả sinh cellulase + Anh hưởng thời gian đến khả sinh cellulase +Anh hưởng nguồn nitoden khả sinh cellulase Ý nghĩa đề tài 4.1 Ý nghĩa lý luận Nghiên cứu nhằm sâu, tìm hiểu hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hoá số chủng nấm mốc có khả phân giải cellulose 4.2 Ý nghĩa thực tiễn Hi vọng chủng nấm mốc lựa chọn tạo cellulase nhiều ứng dụng phân giải phế thải công nghiệp thực phẩm bổ sung vào thức ăn gia súc, công nghiệp môi trường…Thủy phân cellulose tạo chất lên men để thu sản phẩm cuối khác Lê Thị Minh Phƣơng K32D Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.1 Khả sinh cellulase số chủng nấm mốc đƣợc phân lập Lê Thị Minh Phƣơng 27 K32D Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Từ bảng cho thấy tất 30 chủng có hoạt tính phân giải cellulose Chủng M1-3, M2-3, M8-1 có hoạt tính phân giải cellulose thấp (D-d= 0,5cm) Các chủng M3, M5-3, M6-1 có hoạt tính phân giải cellulose mạnh với D-d là: 2,2cm, 2,0cm, 1,8cm Chúng định lựa chọn chủng M3 M6-1 để tiếp tục nghiên cứu số yếu tố môi trường có ảnh hưởng đến khả sinh cellulase chúng Bằng phương pháp nhận diện truyền thống, bước đầu xác định số đặc điểm hình thái chủng nấm mốc M3 M6-1 Từ kết đem so sánh với đặc điểm chi, loài khóa phân loại thấy: - Chủng M3 có đặc điểm giống với chi Penicillium (Samson ctv, 1995) như: môi trường Crapek- Dox khuẩn lạc màu xanh lục, xanh đen, mặt sau khuẩn lạc có màu nâu tối, giá bào tử trần phân nhánh, nấm hình cột dạng xẻ thùy, thể bình thuộc dạng lưỡng tầng, bào tử có hình ovan đến hình cầu - Chủng M6-1 có đặc điểm giống với chi Aspergillus (Raper & Fennell, 1965) như: môi trường Crapek- Dox khuẩn lạc màu vàng hoa cau, màu đen nâu, mặt sau màu vàng tối, giá bào tử trần không phân nhánh, thẳng, nhẵn ráp, nấm màu đen nâu, hình bán cầu hình cầu, bọng đỉnh giá hình gần cầu, có lớp thể bình, bào tử trần hình cầu, elip, nhẵn nhẵn [18] Lê Thị Minh Phƣơng 28 K32D Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Mặt trước khuẩn lạc chủng M3 Mặt trước khuẩn lạc chủng M6-1 Bông nấm (X10) chủng M3 Bông nấm (X40) chủng M6-1 Bào tử (X40) chủng M3 Bào tử (X100) chủng M6-1 Hình 3.2 Đặc điểm hình thái chủng M3 M6-1 Lê Thị Minh Phƣơng 29 K32D Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 3.2 Ảnh hƣởng số điều kiện nuôi cấy đến khả sinh cellulase chủng M3 M6-1 3.2.1 Ảnh hƣởng pH đến khả sinh cellulase Tiến hành nuôi cấy chủng Penicillium M3, Aspergillus M6-1 môi trường Czapek- Dox thích hợp (phần 2.1.2.1) xác định hoạt tính phân giải cellulose theo phương pháp cấy chấm điểm (phần 2.2.2.1) Kết trình bày bảng 3.2 hình 3.3 Bảng 3.2 Ảnh hƣởng pH đến hoạt tính cellulase pH M3 (D-d, cm) 0,6 1,0 1,9 2,3 1,2 0,9 M6-1 (D-d, cm) 0,5 0,7 1,5 1,8 0,9 0,8 Hình 3.3 Ảnh hƣởng pH đến khả sinh cellulase Lê Thị Minh Phƣơng 30 K32D Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Từ kết cho thấy pH ảnh hưởng lớn đến khả sinh cellulase Khả sinh cellulase tăng dần từ pH= 2- pH= 5, sau giảm dần từ pH=5- pH= Cả chủng Penicillium M3 Aspergillus M6-1 sinh cellulase mạnh điều kiện môi trường pH= Tuy nhiên chủng M3 có khả sinh cellulase mạnh so với chủng M6-1 Khả sinh trưởng sinh cellulase hai chủng Penicillium M3 Aspergillus M6-1 tốt điều kiện môi trường axit, chúng có khả sinh cellulase pH= Kết phù hợp với số nghiên cứu trước đây, chủng nấm sợi sinh tổng hợp cellulase mạnh khoảng pH= 4,5-6,0 [11] 3.2.2 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến khả sinh cellulase Chúng tiến hành nuôi cấy hai chủng Penicillium M3 Aspergillus M6-1 môi trường Czapek- Dox thích hợp (phần 2.1.2.1) nhiệt độ chọn là: 250C, 300C, 350C, 400C Hoạt tính phân giải cellulose xác định theo phương pháp cấy chấm điểm (phần 2.2.2.1) Kết nghiên cứu trình bày bảng 3.3 hình 3.4 Bảng 3.3 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt tính cellulase 25 M3 (D-d, cm) 1,1 30 2,2 1,6 35 2,0 0,9 40 1,5 0,8 Nhiệt độ Lê Thị Minh Phƣơng 31 M6-1 (D-d, cm) 0,6 K32D Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.4 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt tính cellulase Kết cho thấy hai chủng Penicillium M3 Aspergillus M6-1 sinh tổng hợp cellulase dải nhiệt độ từ 250C- 400C Tuy nhiên khả sinh tổng hợp cellulase chủng mạnh 300C Khả phân giải cellulose chủng giảm dần từ 300C- 400C Chủng M3 sinh cellulase mạnh chủng M6-1 Các chủng nấm thường chủng ưa ấm nhiệt độ tối ưu cho khả sinh tổng hợp cellulase 300C nhiệt độ khảo sát Những nghiên cứu trước cho thấy, chủng nấm khác sinh tổng hợp cellulase mạnh dải nhiệt độ 31oC- 34oC [11] Lê Thị Minh Phƣơng 32 K32D Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.5 Khả sinh cellulase chủng M3 M6-1 250C 300C 3.2.3 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh cellulase Hai chủng M3 M6-1 nuôi cấy môi trường Czapek- Dox (phần 2.1.2.1) mức thời gian khác từ 1-5 ngày Sau xác định hoạt tính phân giải cellulose theo phương pháp cấy chấm điểm (phần 2.2.2.1) Kết nghiên cứu trình bày bảng 3.4 hình 3.6 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh cellulase Thời gian M3 M6-1 (ngày) (D-d, cm) (D-d, cm) Lê Thị Minh Phƣơng 33 K32D Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 0,41 0,35 0,8 0,6 0,9 0,68 1,2 0,9 0,7 0,63 1.4 1.2 D-d,cm 0.8 0.6 M3 0.4 M6-1 0.2 (ngày) Thời gian (ngày) Hình 3.6 Ảnh hƣởng thời gian đến hoạt tính cellulase Qua số liệu bảng 3.4 hình 3.6, cho thấy hoạt tính cellulase hai chủng tăng dần theo thời gian hai chủng đạt giá trị cực đại sau ngày nuôi cấy thứ 4, sau giảm dần ngày nuôi cấy Chủng M3 có hoạt tính phân giải cellulose mạnh so với chủng M6-1 Kết phù hợp với nghiên cứu trước chủng nấm sợi ưa ấm sinh tổng hợp cellulase mạnh sau 72 – 96 nuôi cấy Cả hai chủng Penicillium M3, Aspergillus M6-1 có thời gian khả sinh tổng hợp cellulase tương đương với chủng nấm sợi nghiên cứu Lê Thị Minh Phƣơng 34 K32D Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Như thời gian nuôi cấy có ảnh hưởng rõ rệt đến khả sinh tổng hợp cellulase hai chủng tuyển chọn 3.2.4 Ảnh hƣởng nguồn nitơ đến khả sinh cellulase Để phân giải polysaccarit khó phân giải cellulose tế bào vi sinh vật phải tổng hợp lượng lớn cellulase, trình sinh tổng hợp cần tới lượng lớn nitơ, có chủng sử dụng tới 60% nitơ tổng số cho việc sản xuất enzyme Vì vậy, việc nghiên cứu ảnh hưởng nguồn nitơ lên khả sinh tổng hợp cellulase chủng nấm mốc có ý nghĩa quan trọng Hai chủng nấm Penicillium M3, Aspergillus M6-1 nuôi cấy môi trường Czapek- Dox thích hợp (phần 2.1.2.1) với nguồn nitơ sử dụng là: NaNO3, NaNO2, NH4Cl, (NH4)2SO4 Sau đó, lấy dịch nuôi cấy đem li tâm loại bỏ sinh khối Xác định hoạt tính phân giải cellulose dịch nuôi cấy theo phương pháp khuếch tán môi trường thạch (phần 2.2.2.2) Kết trình bày bảng 3.5 hình 3.7 Bảng 3.5 Ảnh hƣởng nguồn nitơ đến khả sinh cellulase Nguồn nitơ NaNO3 NaNO2 NH4Cl (NH4)2SO4 Lê Thị Minh Phƣơng M3 (D-d, cm) 2,1 1,6 1,8 2,0 35 M6-1 (D-d, cm) 1,5 0,9 1,3 1,2 K32D Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.7 Ảnh hƣởng nguồn nitơ đến khả sinh cellulase Mức độ sinh trưởng sinh tổng hợp cellulase chủng nấm mốc nguồn nitơ khác Kết cho thấy chủng có khả sử dụng nhiều nguồn nitơ NaNO3 nguồn nitơ tốt cho hai chủng sinh tổng hợp cellulase Điều phù hợp với nhiều nghiên cứu cho nitrat nguồn nitơ thích hợp để tổng hợp cellulase nhiều nấm sợi Aspergillus, Trichoderma Khả sinh tổng hợp cellulase chủng M3 mạnh so với chủng M6-1 nguồn nitơ khác Lê Thị Minh Phƣơng 36 K32D Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.8 Khả sinh cellulase chủng Penicillium M3 Aspergillus M6-1 nguồn nitơ NaNO3 Lê Thị Minh Phƣơng 37 K32D Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 1.1 Từ 30 chủng nấm mốc có khả tổng hợp cellulase phòng thí nghiệm vi sinh, Khoa Sinh – KTNN, trường ĐHSP Hà Nội phân lập từ mẫu rác thải, cành gỗ, cây, rơm rạ mục, đất mùn Vĩnh Phúc, tuyển chọn chủng M3, M5-3 M6-1 có khả sinh tổng hợp cellulase cao 1.2 Chúng tiến hành nghiên cứu đặc điểm sinh lí, sinh hóa đặc tính sinh học hai chủng M3, M6-1 Định loại đến chi đặt tên Penicillium M3 (Samson ctv, 1995), Aspergillus M6-1 (Raper & Fennell, 1965) 1.3 Tiến hành nghiên cứu số yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp cellulase hai chủng M3, M6-1 rút điều kiện môi trường nuôi cấy tốt cho trình sinh tổng hợp cellulase hai chủng là: - pH thích hợp pH= - Nhiệt độ thích hợp 300C - Thời gian nuôi cấy: ngày - Nguồn nitơ tốt NaNO3 Kiến nghị Trên số kết nghiên cứu bước đầu việc tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy hai chủng M3 M6-1 nhằm sinh cellulase nhiều Để có chế phẩm cellulase ứng dụng vào thực tiễn cần giải vấn đề sau: 2.1 Tiếp tục nghiên cứu thêm số điều kiện nuôi cấy tối ưu hai chủng như: độ ẩm, nguồn cac bon tự nhiên… Lê Thị Minh Phƣơng 38 K32D Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 2.2 Tiếp tục nghiên cứu đặc tính cellulase hai chủng M3 M6-1 để định hướng cho ứng dụng Lê Thị Minh Phƣơng 39 K32D Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO A Tài liệu tiếng việt Chu Thị Thanh Bình, Nguyễn Lân Dũng, Lƣơng Thị Thùy Dƣơng, Phân lập, tuyển chọn nghiên cứu chủng nấm men có khả phân giải cellulose nhằm ứng dụng xử lý bã thải hoa làm thức ăn chăn nuôi Trung tâm Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng (1992), Hóa sinh học Nxb Giáo dục, tr 80 - 81 3.Tăng Thị Chính, Lý Kim Bằng, Lê Gia Hy (1999), Nghiên cứu sản xuất cellulase số chủng vi sinh vật ưu nhiệt phân lập từ bể ủ rác Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ sinh học Toàn quốc Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr 790 - 797 Nguyễn Lân Dũng (1976), Góp phần nghiên cứu cải tiến cấu thức ăn chăn nuôi lợn, Báo cáo Hội nghị Khoa Học, Trường Đại học Tổng Hợp Nguyễn Lân Dũng (1976), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật, tập 1-2-3 Nxb Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, tr 325 - 347 Nguyễn Lân Dũng (1994), Nghiên cứu khả phân giải cellulose số chủng vi sinh vật phân lập Việt Nam Báo cáo Hội nghị Khoa học ủy ban Khoa học Kỹ thuật nông nghiệp Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Thế Hòa, Nguyễn Anh Bảo (1991), Điều kiện sinh khối nấm sợi Aspergillus hennebergii TH 386 môi trường xốp sắn ngô, tạp chí nông nghiệp công nghiệp thực phẩm Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Thế Hòa, Nguyễn Anh Bảo, Lê Chí Công (1993), Nghiên cứu khả tích lũy sinh khối chủng Aspergillus hennbergii TH 386 môi trường nuôi cấy dịch thể chứa bột sắn sống, tạp chí Sinh học, tr 3-7 Nguyễn Thành Đạt (1999), Cơ sở sinh học vi sinh vật Nxb Giáo dục Lê Thị Minh Phƣơng 40 K32D Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 10 Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo, Vƣơng Trọng Hào (1990), Thực hành vi sinh vật Nxb Giáo dục 11 Đặng Minh Hằng (1999), Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp cellulase số chủng vi sinh vật để xử lý rác Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc Nxb Khoa học Kỹ thuật, tr 333 - 339 12 Nguyễn Đức Lƣợng, Cao Tƣờng, Nguyễn Ánh Tuyết, Lê Thị Thủy Tiên, Tạ Thu Hằng, Huỳnh Ngọc Anh, Nguyễn Thúy Hƣơng, Phan Thị Huyền, Công nghệ enzyme Nxb Đại học Quốc Gia Tp.Hồ Chí Minh 13 Th.s Đỗ Hữu Phƣơng, Đặc san khoa học kỹ thuật thức ăn chăn nuôi, số 3/2004 14 Nguyễn Xuân Thành, Lê Văn Hƣng, Phạm Văn Toản (2003), Công nghệ vi sinh vật sản xuất nông nghiệp xử lý môi trường Nxb Nông nghiệp 15 TS Trần Cẩm Vân, Giáo trình Vi sinh vật học môi trường Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội, tr - 63 B Tài liệu tiếng anh 16 Hrmova M, Fincher GB (2009), Plant and microbial enzymes involved in the depolymerisation of (1,3)-β-D-glucans and related polysaccharides In: Chemistry, Biochemistry and Biology of (1,3)-β-D-Glucans and Related Polysaccharides, Academic Press, Elsevier Inc., San Diego, USA, 677 pp, 16 color plates (Bacic T, Fincher GB, Stone BA, eds), pp 119-170 17 Robert A Samson, John I Pitt (2000), Integration of modern taxonomic methods for Penicillium and Aspergillus classification, p: 83- 113 18 Raper Fennell, (1965), The Genus Aspergillus, The williiams & Wikins Company 428 E Preston street Baltimore, Md 21202 U.S.A, 570pp Lê Thị Minh Phƣơng 41 K32D Sinh - KTNN [...]... nhiều chủng 1.6.3 Điều kiện nuôi cấy *Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ có ảnh hưởng tới sinh tổng hợp enzyme của các loài nấm khác nhau Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng của đa số nấm mốc trên môi trường Lê Thị Minh Phƣơng 19 K32D Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp rắn là 250C÷400C Nhiệt độ dưới 250C hoặc trên 400C nấm mốc phát triển chậm, thời gian nuôi kéo dài, giảm khả năng sinh. .. 0,5cm) Các chủng M3, M5-3, M6-1 có hoạt tính phân giải cellulose khá mạnh với D-d lần lượt là: 2,2cm, 2,0cm, 1,8cm Chúng tôi quyết định lựa chọn 2 chủng M3 và M6-1 để tiếp tục nghiên cứu một số yếu tố môi trường có ảnh hưởng đến khả năng sinh cellulase của chúng Bằng phương pháp nhận diện truyền thống, chúng tôi đã bước đầu xác định được một số đặc điểm về hình thái của 2 chủng nấm mốc M3 và M6-1 Từ kết... Hoạt tính STT 0,6 16 Chủng vi sinh vật M5-3 26 Hoạt tính 2,0 K32D Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.1 Khả năng sinh cellulase của một số chủng nấm mốc đƣợc phân lập Lê Thị Minh Phƣơng 27 K32D Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Từ bảng trên cho thấy tất cả 30 chủng đều có hoạt tính phân giải cellulose Chủng M1-3, M2-3, M8-1 có hoạt tính phân giải cellulose... trong khi tạo Cx ít hơn so với một số loại nấm khác 1.6 Một số yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp cellulase của vi sinh vật 1.6.1 Giống vi sinh vật Như chúng ta đã biết, có nhiều nhân tố ảnh hưởng đến sự tạo thành enzyme và hoạt tính của nó trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật Đặc tính sinh Lê Thị Minh Phƣơng 17 K32D Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp lí, sinh hóa và hoạt tính của nó... sinh tổng hợp enzyme *Ảnh hưởng của pH môi trường Khi nuôi cấy vi sinh vật bằng phương pháp bề mặt thì pH môi trường ít bị thay đổi trong quá trình nuôi do môi trường có dung lượng đệm cao và hàm ẩm thấp Tuy nhiên pH ban đầu của môi trường có ảnh hưởng không nhỏ đến sự phát triển của vi sinh vật cũng như sự tạo thành enzyme của vi sinh vật Trong một số trường hợp pH không chỉ ảnh hưởng đến lượng enzyme... lập được 30 chủng nấm mốc có khả năng tổng hợp cellulase, kết quả này cho thấy các chủng nấm mốc có khả năng phân giải cellulose ở Vĩnh Phúc khá là đa dạng Hoạt tính phân giải cellulose của các chủng nấm mốc được trình bày ở bảng 3.1 Bảng 3.1 Các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose (D-d, cm) 1 Chủng vi sinh vật M1-1 2 M1-2 1,3 17 M5-6 1,3 3 M1-3 0,5 18 M6-1 1,8 4 M1-4 1,1 19 M6-2 1,1... liệu và vi sinh vật Sử dụng một số chủng vi sinh vật phân hủy cellulose được phân lập từ lá cây mục, đất mùn, gỗ cây mục, rơm rạ mục [được lấy ở một số nơi như: Xuân Hòa, huyện Yên Lạc, thành phố Vĩnh Yên (Vĩnh Phúc) ] trong phòng thí nghiệm vi sinh, Khoa Sinh- KTNN, trường ĐHSP Hà Nội 2 2.1.1 Nguyên liệu - Lõi ngô,vỏ trấu, vỏ lạc được sấy khô và nghiền nhỏ - Carboxylmethyl cellulose (CMC) 2.1.2 Môi trƣờng... loại bỏ sinh khối Xác định hoạt tính cellulase trong dịch nuôi cấy theo phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch Lê Thị Minh Phƣơng 25 K32D Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Tuyển chọn các chủng nấm mốc có hoạt tính phân giải cellulose Theo các phương pháp nghiên cứu như trên chúng tôi đã phân lập được 30 chủng nấm mốc có khả năng tổng hợp cellulase, ... tán vào môi trường thạch sau đó cho vào tủ ấm ở 300C trong 24 giờ Hiện hình vòng phân giải Lê Thị Minh Phƣơng 24 K32D Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp bằng dung dịch thuốc thử lugon đỏ 1% Hoạt tính enzyme được xác định bằng hiệu số (D-d, cm) Với D: là đường kính vòng phân giải d: là đường kính lỗ đục 2.2.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố môi trường đến hoạt tính của cellulase. .. thành mà còn ảnh hưởng đến cả chủng loại enzyme được tổng hợp *Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy Thời gian nuôi cấy ảnh hưởng rất lớn đến sự tạo thành enzyme Thời gian thích hợp để tổng hợp cellulase của A.niger từ 4 đến 7 ngày, còn đối với T.reesei từ 5 đến 9 ngày Lê Thị Minh Phƣơng 20 K32D Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên ... phố Vĩnh Yên, Xuân Hòa (Vĩnh Phúc) - Thử hoạt tính cellulase số chủng nấm mốc phân lập - Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố môi trường đến khả sinh tổng hợp cellulase số chủng nấm mốc + Anh hưởng. .. chủng nấm mốc đƣợc phân lập Vĩnh Phúc ’ nhằm tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy số chủng nấm mốc để sinh cellulase nhiều Nội dung đề tài - Phân lập, tuyển chọn số chủng nấm mốc có khả sinh cellulase. .. việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm enzyme để ứng dụng chăn nuôi vấn đề cần thiết Từ lý chọn đề tài Nghiên cứu số yếu tố môi trƣờng ảnh hƣởng tới khả sinh cellulase từ số chủng nấm mốc đƣợc phân lập