TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM NGUYỄN THỊ BỬU CHÂU MSSV 2071796 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC CÓ TÍNH KHÁNG KHUẨN TỪ CẢI BẸ MUỐI CHUA LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Mã ngành: 08 NĂM 2011 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Luận văn tốt nghiệp Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Tên đề tài: PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC CÓ TÍNH KHÁNG KHUẨN TỪ CẢI BẸ MUỐI CHUA Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực TS LÊ NGUYỄN ĐOAN DUY NGUYỄN THỊ BỬU CHÂU MSSV: 2071796 Lớp: CNTP K33 NĂM 2011 Luận văn Tốt nghiệp Khóa 33 Trường Đại học Cần Thơ Luận văn đính kèm theo đây, với đề tài “Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lactic có tính kháng khuẩn từ cải bẹ muối chua” sinh viên Nguyễn Thị Bửu Châu thực báo cáo hội đồng chấm luận văn thông qua Giáo viên hướng dẫn Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2011 Chủ tịch hội đồng Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp SHƯD Trang i Luận văn Tốt nghiệp khóa 33 2011 Trường Đại học Cần Thơ LỜI CẢM TẠ Hoàn thành luận văn tốt nghiệp điểm kết cho trình học tập Sau tháng nghiên cứu đề tài phòng thí nghiệm môn Công Nghệ Thực Phẩm, khoa Nông Nghiệp Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại học Cần Thơ, dù gặp không khó khăn trình thực hoàn thành nghiên cứu Để có kết nhờ giúp đỡ tận tình gia đình, thầy cô bạn bè Con kính dâng đến cha mẹ lòng biết ơn sâu sắc suốt đời tận tụy tương lai nghiệp Chân thành cảm ơn Ts Lê Nguyễn Đoan Duy dù bận rộn công việc, Thầy tận tình hướng dẫn, quan tâm động viên, cung cấp tài liệu, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm, để hoàn thành tốt nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô môn Công Nghệ Thực Phẩm, khoa Nông Nghiêp Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại Học Cần Thơ cho kiến thức quý báu trình học tập Chân thành cảm ơn tập thể cán phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Thực phẩm tạo điều kiện cho hoàn thành đề tài nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn bạn nhóm bạn sinh viên môn Công Nghệ Thực Phẩm, khoa Nông Nghiệp Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại Học Cần Thơ giúp đỡ động viên tinh thần nhiều trình nghiên cứu đề tài Cần Thơ, ngày tháng năm 2011 Sinh viên thực Nguyễn Thị Bửu Châu Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp SHƯD Trang ii Luận văn Tốt nghiệp khóa 33 2011 Trường Đại học Cần Thơ TÓM TẮT Phân lập tuyển chọn vi khuẩn từ nguyên liệu cải bẹ muối chua, nhằm tìm dòng vi khuẩn lactic có khả tiết chất kháng khuẩn gọi bacteriocin Để sử dụng việc bảo quản, ức chế, tiêu diệt loại vi khuẩn gây hại thực phẩm thức ăn gia súc Chính vậy, chọn nguyên liệu cải bẹ muối chua thị trường để tìm dòng vi khuẩn mong muốn Để thực trình nuôi cấy, sử dụng môi trường thạch MRS có pH cuối 6,5 ± 0,2 làm môi trường dinh dưỡng Tỉ lệ agar thích hợp cho vào 1,5%, 0,5% CaCO3 chế độ trùng 1210C thời gian 15 phút Sau đó, tiến hành thử với dòng vi khuẩn khác để biết đặc tính kháng khuẩn Kết sau trình phân lập tuyển chọn, thu 22 dòng vi khuẩn lactic chọn ngẫu nhiên từ nguyên liệu cải bẹ muối chua ban đầu Trong đó, thu ba chủng kháng bốn dòng khuẩn chuẩn Lactobacillus sakei TISTR 890, Bacillus coagulans JCM 2257T, Lactobacillus sakei subsp sakei JCM 1157T, Lactobacillus plantarum ATCC 14917T, chủng kháng ba dòng Lactobacillus sakei TISTR 890, Bacillus coagulans JCM 2257T, Lactobacillus sakei subsp sakei JCM 1157T chủng kháng hai dòng Lactobacillus sakei TISTR 890, Bacillus coagulans JCM 2257T Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp SHƯD Trang iii Luận văn Tốt nghiệp khóa 33 2011 Trường Đại học Cần Thơ MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ ii TÓM TẮT iii MỤC LỤC iv DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu nguyên liệu cải bẹ 2.2 Sơ đồ quy trình sản xuất cải bẹ muối chua 2.2.1 Quy trình sản xuất 2.2.2 Thuyết minh quy trình 2.3 Cơ chế trình lên men lactic 2.4 Vi sinh vật trình lên men lactic 2.4.1 Vi khuẩn lactic .7 2.4.2 Vi sinh vật khác 2.5 Tổng quan bacteriocin 2.5.1 Nguồn gốc chất kháng sinh .9 2.5.2 Khái niệm bacteriocin 10 2.5.3 Phân loại bacteriocin 10 2.5.3 Tính chất bacteriocin 11 2.5.4 Hoạt động bacteriocin 11 2.5.5 Sinh tổng hợp bacteriocin 12 2.5.6 Phương pháp chiết tách bacteriocin 13 2.6 Tổng quan vi khuẩn lactic 13 2.6.1 Đặc tính chung 13 2.6.2 Sinh lý vi khuẩn lactic 15 2.6.3 Các sản phẩm trao đổi chất vi khuẩn lactic 16 2.6.5 Những yếu tố ảnh hưởng đến phát triển vi khuẩn lactic .21 2.7 Các vấn đề liên quan đến việc tuyển chọn phân lập vi khuẩn lactic 22 2.7.1 Tiệt trùng dụng cụ môi trường làm việc .22 2.7.2 Tiệt trùng môi trường nuôi cấy 23 CHƯƠNG III PHƯƠNG TIỆN PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 24 3.1 Phương tiện thí nghiệm .24 3.1.1 Thời gian, địa điểm 24 3.1.2 Hóa chất sử dụng 24 3.1.3 Nguyên liệu 24 Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp SHƯD Trang iv Luận văn Tốt nghiệp khóa 33 2011 Trường Đại học Cần Thơ 3.1.4 Thiết bị, dung cụ .24 3.2 Phương pháp chuẩn bị dịch tăng sinh môi trường nuôi cấy 25 3.2.1 Dung dịch pha loãng 25 3.2.2 Môi trường tăng sinh dung dịch MRS 25 3.2.3 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn lactic 25 3.3 Nội dung 26 3.4 Bố trí thí nghiệm .26 3.4.1 Thí nghiệm 1: Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lactic từ nguyên liệu cải bẹ muối chua 26 3.4.2 Thí nghiệm 2: Xác định hoạt tính kháng khuẩn (bacteriocin) dòng vi khuẩn vừa tìm 30 CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 CHƯƠNG VI KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ 36 6.1 Kết luận 36 6.2 Đề nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO .37 PHỤ LỤC THÀNH PHẦN HÓA CHẤT SỬ DỤNG viii Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp SHƯD Trang v Luận văn Tốt nghiệp khóa 33 2011 Trường Đại học Cần Thơ DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Một số vi khuẩn lactic lên men đồng hình dị hình Bảng 2: Các dòng vi khuẩn dùng để kiểm tra tính kháng khuẩn .30 Bảng 3: Đặc điểm hình dạng 22 chủng lactic tuyển chọn 33 Bảng 4: Thành phần môi trường MRS viii Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp SHƯD Trang vi Luận văn Tốt nghiệp khóa 33 2011 Trường Đại học Cần Thơ DANH MỤC HÌNH Hình 1: Quy trình chế biến cải bẹ muối chua Hình 2: Cây cải bẹ Hình 3: Một số giống vi khuẩn lactic .20 Hình 4: Nguyên liệu cải bẹ muối chua 24 Hình 5: Môi trường MRS bột agar 25 Hình 6: Đĩa sau ủ 48 điều kiện yếm khí 27 Hình 7: Đĩa sau cấy chuyền ủ 24 28 Hình 8: Ống nghiệm sau tăng sinh 28 Hình 9: Chủng vi khuẩn lactic sau thử tính kháng khuẩn 32 Hình 10: Khuẩn lạc lactic 34 Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp SHƯD Trang vii Luận văn Tốt nghiệp Khóa 33 Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG I 1.1 TỔNG QUAN Đặt vấn đề Một mối quan tâm công nghiệp thực phẩm nhiễm bẩn thực phẩm tác nhân gây bệnh từ vi sinh vật Trong thập niên qua, bùng nổ có định kỳ bệnh tiêu chảy, kết hợp với tượng kháng cự tự nhiên tác nhân gây bệnh đến thuốc kháng sinh ngày trở nên trầm trọng, dẫn đến mối nguy hiểm cho sức khỏe người động vật Bên cạnh tình trạng nhiễm khuẩn thực phẩm ngày phổ biến gây thiệt hại lớn cho công ty thực phẩm Nhiều lô hàng thực phẩm công ty Việt Nam xuất sang Mỹ bị từ chối, phần lớn hàng trả mặt hàng thủy sản lạnh đông, nhiều lô bị nhiễm salmonella (loại vi khuẩn gây tiêu chảy) Vì thế, chất bảo quản hóa học sử dụng vào thực phẩm để bảo quản đồng thời tiêu diệt loài vi sinh vật diện thực phẩm Vấn đề tìm loài vi khuẩn có khả chống lại vi khuẩn gây bệnh yêu cầu ngày cao cho an toàn thực phẩm Với vắng mặt chất bảo quản hóa học thêm vào thực phẩm, tạo nên mối quan tâm việc thay hợp chất sản phẩm tự nhiên mà không làm nguy hiểm đến người tiêu dùng hay môi trường sống chúng Nên lựa chọn hợp lý ứng dụng số protein vi khuẩn thuốc kháng sinh Vì vậy, tiếp tục tìm chất kháng vi khuẩn quan tâm trở nên quan lĩnh vực thuốc Ngành công nghệ sinh học lĩnh vực chế biến thực phẩm cố gắng phân lập, tìm ra, sản xuất, cải thiện vi sinh vật có lợi sản phẩm chúng để ứng dụng việc nâng cao chất lượng thực phẩm Việc sử dụng vi sinh vật không gây bệnh chất chuyển hóa chúng để cải thiện an toàn vi sinh học, đồng thời tăng thời gian bảo quản thực phẩm xem chất bảo quản sinh học Đặc tính vi khuẩn lactic công nhận an toàn để sử dụng trình lên men thực phẩm truyền thống Vì vậy, sử dụng chất bảo quản sinh vật Bacteriocin phân tử sinh học với đặc tính kháng vi khuẩn sinh từ vi khuẩn lactic, xem lựa chọn tốt cho việc thay loại kháng sinh hóa học sử dụng thực phẩm thức ăn gia súc Bacteriocin có điểm đặc biệt chúng hoạt tính kháng sinh điển hình, nghĩa chúng kiềm hãm không trực tiếp làm chết vi sinh vật Bên cạnh đó, việc tìm chất kháng sinh sinh học có ý nghĩa tình hình thực phẩm nước ta tương lai Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp SHƯD Trang Luận văn Tốt nghiệp khóa 33 2011 CHƯƠNG III 3.1 Trường Đại học Cần Thơ PHƯƠNG TIỆN PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM Phương tiện thí nghiệm 3.1.1 Thời gian, địa điểm Thời gian thực từ ngày 03/01/2011 đến ngày 22/04/2011 Địa điểm: Tiến hành thí nghiệm, phòng thí nghiệm thuộc Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông nghiệp Sinh học ứng dụng – Trường Đại học Cần Thơ 3.1.2 Hóa chất sử dụng - Môi trường MRS - NaOH 0,1N - Cồn 950, cồn 700 3.1.3 Nguyên liệu Nguyên liệu cải bẹ muối chua thu mua chợ An Nghiệp, quận Ninh Kiều, TP Cần Thơ Nguồn: http//files.myopera.com/minhnhim/blog/DSC07075.JPG Hình 4: Nguyên liệu cải bẹ muối chua 3.1.4 Thiết bị, dung cụ - Nồi tiệt trùng áp lực - Tủ cấy vi sinh Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp SHƯD Trang 24 Luận văn Tốt nghiệp khóa 33 2011 Trường Đại học Cần Thơ - Máy ly tâm, ống ly tâm - Cân điện tử, vortex - Đĩa petri, ống nghiệm, eppendorf - Que chang, que cấy, đèn cồn, dao mổ - Bếp điện, bếp gas - Một số dụng cụ khác cần dùng thí nghiệm 3.2 Phương pháp chuẩn bị dịch tăng sinh môi trường nuôi cấy 3.2.1 Dung dịch pha loãng Tiến hành cân 8,5g NaCl tinh khiết, cho vào lít nước cất, sau khuấy để NaCl hòa tan vào nước cất Khi hòa tan hoàn toàn mang tiệt trùng nhiệt độ 1210C thời gian 15 phút để tiêu diệt vi sinh vật bên dung dịch 3.2.2 Môi trường tăng sinh dung dịch MRS Tiến hành cân 26,1g MRS pha vào 500ml nước cất Khuấy cho MRS hòa tan hết vào nước (có thể khuấy cá từ), sau mang tiệt trùng nhiệt độ 1210C thời gian 15 phút 3.2.3 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn lactic Tiến hành cân 26,1g môi trường MRS, bột agar 7,5g, CaCO3 2,5g pha 500ml nước cất Sau khuấy cho hỗn hợp tan hoàn toàn vào nước, khuấy đũa thủy tinh cá từ Khuấy dung dịch bếp điện bếp từ để agar hòa tan hoàn toàn Có thể đun dung dịch đến sôi để tránh tượng vón cục hay môi trường không đặc sau đổ đĩa Sau môi trường thạch MRS mang tiệt trùng nhiệt độ 1210C thời gian 15 phút Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp SHƯD Trang 25 Luận văn Tốt nghiệp khóa 33 2011 Trường Đại học Cần Thơ Hình 5: Môi trường MRS bột agar 3.3 Nội dung Nhằm tìm dòng vi khuẩn lactic có tính kháng khuẩn có mặt cải bẹ muối chua, tách riêng dùng vi khuẩn lactic từ quần thể vi khuẩn ban đầu nguyên liệu 3.4 Bố trí thí nghiệm 3.4.1 Thí nghiệm 1: Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lactic từ nguyên liệu cải bẹ muối chua Mục đích: Tìm dòng vi khuẩn lactic để xác định hoạt tính kháng khuẩn Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm tiến hành bước cấy mẫu, cấy chuyền, tăng sinh bảo quản vi khuẩn lactic thu (i) Cấy mẫu Cần tiệt trùng môi trường làm việc (đặc biệt tủ cấy vi sinh) trước sử dụng, để tránh nhiễm vi sinh vật lạ vào mẫu Tủ cấy cần được bật UV khoảng 15 phút để tiệt trùng môi trường bên tủ, sau sát trùng lại cồn 700 sử dụng Môi trường sau tiệt trùng làm nguội sử dụng Trong trình làm nguội môi trường bị đặc, agar tạo gel nhiệt độ khoảng 38 – 400C nên cần ý phải giữ cho môi trường không bị đặc suốt trình đổ đĩa Nếu môi trường ban đầu dạng đặc phải đun cách thủy để tan hoàn toàn sử dụng Sau đổ đĩa petri cho môi trường đặc lại cấy mẫu Đối với nguyên liệu cải bẹ, sau mua cân 10g mẫu điều kiện vô trùng, cắt nhỏ cho vào bình tam giác 90ml nước muối sinh lý tiệt trùng Chuẩn bị trước ống nghiệm thể tích 10ml có chứa sẵn 9ml nước muối để tiến hành pha loãng mẫu Trong trình chuẩn bị pha loãng, cần phải lắc bình tam giác chứa mẫu, để hệ vi sinh vật bên mẫu phân bố vào nước muối Mẫu pha loãng thành dãy nồng độ thập phân 1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000, 1/10000 Ở bậc pha loãng ta tiến hành lấy 1ml dịch mẫu bình tam giác cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối chuẩn bị trước, lắc ta bậc pha loãng 1/10 Mỗi bậc pha loãng tiếp sau thực tương Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp SHƯD Trang 26 Luận văn Tốt nghiệp khóa 33 2011 Trường Đại học Cần Thơ tự lấy 1ml dung dịch có độ pha loãng trước cho vào ống nghiệm tương ứng thu bậc pha loãng 1/100, 1/1000, 1/10000 1/10000 Sau đó, dùng pipetman đầu tip vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 0,1ml dịch chứa giống vi sinh vật lên bề mặt môi trường đĩa thạch MRS chứa 0,5% CaCO3 Nhúng đầu que trải thủy tinh vào cồn 700C, hơ lửa đèn cồn để khử trùng Để đầu que chang (thanh gạt) nguội không gian vô trùng lửa Mở đĩa petri, đặt nhẹ nhàng que trải lên bề mặt thạch đĩa petri Dùng đầu gạt xoay, trải dịch giống lên bề mặt thạch Trong trải, thực xoay đĩa vài lần, lần khoảng 1/2 chu vi đĩa tạo điều kiện cho gạt trải dịch giống khắp bề mặt môi trường Sau rút gạt khỏi đĩa, đậy đĩa Mỗi bậc pha loãng cấy lặp lại hai lần Đĩa ủ tủ ấm chứa CO2 nhiệt độ 370C, thời gian ủ 48 Nhưng nhiệt độ phát triển vi khuẩn lactic tương thích với nhiệt độ môi trường (khoảng 30 – 400C) nên sử dụng bình hút ẩm để ủ Trong bình có đốt nến nhằm tạo điều kiện yếm khí cho vi khuẩn lactic phát triển Chỗ tiếp xúc nắp bình bình sử dụng vazơlin để tránh không khí lọt vào Sau ủ 48h thấy xuất đĩa khuẩn lạc có dạng hình tròn nhỏ, màu trắng đục, đồng thời có quầng trống xung quanh khuẩn lạc vi khuẩn lactic Do vi khuẩn có khả sinh acid, acid tác dụng với CaCO3 pha môi trường thạch, nên làm cho xung quanh khuẩn lạc xuất vùng trống Hình 6: Đĩa sau ủ 48 điều kiện yếm khí (ii) Cấy chuyền Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp SHƯD Trang 27 Luận văn Tốt nghiệp khóa 33 2011 Trường Đại học Cần Thơ Các đĩa sau xác định có diện LAB (Lactic Acid Bacteria) tiến hành cấy chuyền để thu dòng vi khuẩn mà diện vi khuẩn khác Trước tiên, cần tiệt trùng môi trường làm việc theo bước cấy chuyền, sau lấy môi trường nấu chảy đổ đĩa petri Khi môi trường đĩa đặc khô, ta tiến hành chia đĩa làm tám làm bốn để tiết kiệm đĩa, môi trường nuôi cấy Tiếp dùng que cấy phải hơ đỏ, làm nguội lấy vòng que cấy đầy hỗn hợp vi sinh vật cần phân lập Nghiêng mở nắp đĩa petri dùng que cấy zíc zắc lên phần môi trường chia Que cấy phải hơ đỏ, làm nguội lấy hỗn hợp vi sinh vật cấy lên phần môi trường Thực tương tự với đĩa lại Môi trường sử dụng MRS có 1,5% bột agar 0,5% CaCO3 Đĩa ủ nhiệt độ môi trường, có bình nến (có thể sử dụng tủ ấm) để tao yếm khí, thời gian 24giờ Nhằm mục đích tách LAB khỏi khỏi hỗn hợp vi sinh vật môi trường cấy mẫu ban đầu Hình 7: Đĩa sau cấy chuyền sau ủ 24 (iii) Tăng sinh Sau thời gian ủ 24 lấy đĩa xem, khuẩn lạc có xuất vùng trống (clear zone) xung quanh lấy khuẩn lạc mang tăng sinh dung dịch MRS Quá trình tăng sinh thực tủ cấy vi sinh Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp SHƯD Trang 28 Luận văn Tốt nghiệp khóa 33 2011 Trường Đại học Cần Thơ Hình 8: Ống nghiệm sau tăng sinh Tủ cấy tiệt trùng trước sử dụng Sử dụng ống nghiệm để đựng vi khuẩn tăng sinh Mục đích tăng sinh vi khuẩn phát triển mạnh tăng nhanh mật số Thao tác thực sau: sử dụng que cấy hơ đỏ lửa đèn cồn, để nguội dùng que cấy để lấy vi khuẩn đĩa cho vào ống nghiệm có chứa dung dịch MRS Các ống nghiệm có chứa vi khuẩn cần ghi số tương ứng với số vi khuẩn ghi đĩa Sau ống nghiệm đem ủ tủ ấm nhiệt độ 370C thời gian 24 (iv) Bảo quản Đối với chủng vi khuẩn dùng để xác định hoạt tính kháng khuẩn Chuẩn bị dung dịch MRS cho vào ống nghiệm 5ml dung dịch Sử dụng que cấy (đã hơ đỏ, để nguội) lấy vi khuẩn từ ống eppendorf cho vào dung dịch MRS NB (Nutrition Broth) chuẩn bị Sau lần lấy que cấy cần hơ đỏ, để nguội sử dụng tiếp Sau đem ủ nhiệt độ tối thích Lactobacillus sakei TISTR 890, Bacillus coagulans JCM 2257T 370C 300C Lactobacillus sakei subsp sakei JCM 1157T, Lactobacillus plantarum ATCC 14917T Chuẩn bị dung dịch glycerol 30% vô trùng (glycerol 30 : nước 70) Lấy 500µl dung dịch vi sinh vật nuôi cấy vào 500µl dung dịch glycerol vô trùng cho vào ống eppendorf (đã tiệt trùng), lắc vortex Mỗi loài vi sinh vật thực bốn ống Sau mang trữ đông nhiệt độ 200C -800C Tất bước thực tủ cấy vô trùng Đối với chủng LAB thu Sau tăng sinh 24 tủ ấm, trước làm bước trữ lại bảo quản để sử dụng cho bước tiếp hay nghiên cứu khác Các bước thực tương tự bảo quản khuẩn chuẩn, lấy 500µl dung dịch Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp SHƯD Trang 29 Trường Đại học Cần Thơ Luận văn Tốt nghiệp khóa 33 2011 lactic ống nghiệm sau tăng sinh cho vào eppendorf có chứa 500µl glycerol vô trùng Vortex lên để tế bào vi khuẩn bao bọc glycerol Các eppendorf trữ tủ đông nhiệt độ -200C Các chủng vi khuẩn sử dụng để kiểm tra đặc tính kháng khuẩn thể bảng Bảng : Các dòng vi khuẩn dùng kiểm tra tính kháng khuẩn Môi trường Nhiệt độ Lactobacillus plantarum ATCC 14917 Lactobacillus sakei subsp Sakei JCM 1157T Lactobacillus sakei TISTR 890 MRS MRS MRS 300C 300C 370C Vi khuẩn gram dương khác Môi trường Nhiệt độ Bacillus coagulans JCM 2257T TSB-YE(0,6%) 370C Vi khuẩn sinh acid lactic T NB TSB (Tryptic Soy Broth) chứa 0,6% YE (Yeast extract) Khi cần sử dụng Lấy mẫu trữ đông ra, rã đông, lắc Sau đó, lấy khoảng 100 - 200µl cho vào 5ml môi trường nuôi cấy lỏng (dung dịch MRS) tiệt trùng Các vi khuẩn đem ủ nhiệt độ tối thích vi khuẩn lactic thu được, Lactobacillus sakei TISTR 890, Bacillus coagulans JCM 2257T 370C 300C Lactobacillus sakei subsp sakei JCM 1157T, Lactobacillus plantarum ATCC 14917T tủ ấm với thời gian 24 Nhằm giúp cho vi khuẩn hoạt động lại sau thời gian trữ đông Tiếp tục lấy 200µl, cho vào 5ml môi trường nuôi cấy lỏng Đem ủ nhiệt độ tối thích vi khuẩn tăng sinh khối trở lại Đối với vi khuẩn lactic thu thu ủ nhiệt độ 370C Tất dụng cụ môi trường làm việc khử trùng trước sử dụng 3.4.2 Thí nghiệm 2: Xác định hoạt tính kháng khuẩn (bacteriocin) dòng vi khuẩn vừa tìm Mục đích: Chọn lọc chủng có đặc tính kháng khuẩn Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp SHƯD Trang 30 Luận văn Tốt nghiệp khóa 33 2011 Trường Đại học Cần Thơ Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm thực qua bước chuẩn bị supernatant (phần bên trên), xác định tính kháng khuẩn (i) Chuẩn bị supernatant (phần nổi) Supernatant phần bên phần dịch không cặn Lấy vi khuẩn lactic thu được tăng sinh dung dịch MRS cho vào ống ly tâm mang ly tâm, lấy phần bên (supernatant) Ly tâm tốc độ 7500 vòng/phút, nhiệt độ ly tâm 120C thời gian 10 phút Khi ly tâm xong dùng pipetman để lấy phần dịch ra, lấy lượng vừa đủ để chỉnh pH (khoảng 1ml) Dùng NaOH 0,1N để đưa pH dịch supernatant đến Lấy 1ml dung dịch chỉnh pH xong cho vào ống eppendorf Đem eppendorf đun nhiệt độ 1000C thời gian phút Mục đích việc đun để trích ly bacteriocin có tế bào vi khuẩn Chú ý phải ghi thật rõ ký hiệu ống (ii) Xác định tính kháng khuẩn Chuẩn bị MRS hay NB chứa 1,5% agar tiệt trùng Đổ khoảng 15ml vào đĩa petri, đợi cho khô Sau đó, chuẩn bị 5ml MRS hay NB chứa 1% agar cho vào ống nghiệm Tiếp theo cho 30ml vi khuẩn chuẩn vào dung dịch agar này, vortex hỗn hợp đổ lớp thứ hai vào đĩa petri Làm khô không khí thổi Eppendorf sau đun xong tiến hành: - Lấy 10µl dung dịch eppendorf nhỏ lên bề mặt agar khô - Phần lại để qua đêm cho thành phần dịch supernatant sau đun ổn định lấy 10µl dung dịch nhỏ lên môi trường agar khô Chú ý cầm pipetman thẳng đứng nhỏ lên bề mặt agar phải vị trí nhỏ lên khô hoàn toàn, nhằm tránh tượng bị lan Ủ qua đêm nhiệt độ tối thích 370C khuẩn chuẩn Lactobacillus sakei TISTR 890, Bacillus coagulans JCM 2257T 300C Lactobacillus sakei subsp sakei JCM 1157T, Lactobacillus plantarum ATCC 14917T Nếu thấy vùng trống (clear zone) nghĩa có tác dụng kháng khuẩn Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp SHƯD Trang 31 Luận văn Tốt nghiệp khóa 33 2011 Trường Đại học Cần Thơ Chủng Lactobacillus sakei TISTR 890 Chủng Lactobacillus plantarum ATCC 14917T Hình 9: Chủng vi khuẩn lactic sau thử tính kháng khuẩn Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp SHƯD Trang 32 Trường Đại học Cần Thơ Luận văn Tốt nghiệp khóa 33 2011 CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Từ nguyên liệu cải bẹ muối chua tiến hành phân lập chủng vi khuẩn lactic môi trường MRS Kết thu sau: Thu 22 dòng vi khuẩn lactic chọn ngẫu nhiên từ nguyên liệu cải bẹ muối chua ban đầu, khuẩn lạc chủng có kích thước lớn bé khác Sau đặc điểm hình dạng chủng thu bảng mô tả sau Bảng 3: Đặc điểm hình dạng 22 chủng khuẩn lactic tuyển chọn Chủng vi khuẩn Hình dạng khuẩn lạc Hoạt tính ức chế vi khuẩn H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 H10 H11 H12 H13 H14 H15 H16 H17 Tròn, trắng, nhỏ, lồi Tròn, trắng đục, nhỏ Tròn, trắng, lớn H18 H19 Tròn, trắng, vừa Tròn, trắng sữa, nhỏ H20 H21 H22 Tròn, vàng kem, nhỏ Tròn, trắng đục, lớn Tròn, trắng, vừa II, IV I, II, III, IV I, II, III, IV I, II, III, IV II, III, IV - Tròn, trắng sữa, vừa Tròn, trắng, nhỏ Tròn, đục, nhỏ, bóng Tròn, đục, vừa, lồi Tròn, vàng kem, nhỏ Tròn, trắng, vừa Tròn, trắng sữa, lớn, lồi Tròn, trắng đục, vừa Tròn, trắng, nhỏ Tròn, trắng, lớn Tròn, trắng đục ngà, nhỏ Tròn, trắng đục, lớn, lồi Tròn, trắng, vừa, lồi Tròn, trắng sữa, nhỏ Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp SHƯD Trang 33 Luận văn Tốt nghiệp khóa 33 2011 Trường Đại học Cần Thơ Với: I: Lactobacillus plantarum ATCC 14917T III: Lactobacillus sakei TISTR 890 II: Lactobacillus sakei subsp sakei JCM 1157T IV: Bacillus coagulans JCM 2257 Qua thống kê thu từ bảng 3, có kết sau: - Phần supernatant sau đun nóng nhỏ liền lên bề mặt agar khô không cho kết mong muốn Do thành phần bacteriocin bên dịch chưa kích hoạt ổn định nên không thấy đặc tính kháng khuẩn - Phần supernatant để ổn định qua đêm nhỏ: Kết thu gồm có chủng H1, H3, H4, H7, H10 có hoạt tính kháng khuẩn Chủng số H3, H4, H7 kháng bốn dòng khuẩn chuẩn Lactobacillus sakei TISTR 890, Bacillus coagulans JCM 2257T, Lactobacillus sakei subsp sakei JCM 1157T Lactobacillus plantarum ATCC 14917T Chủng số H10 kháng ba dòng Lactobacillus sakei TISTR 890, Bacillus coagulans JCM 2257T, Lactobacillus sakei subsp sakei JCM 1157T Chủng số H1 kháng hai dòng Lactobacillus sakei TISTR 890, Bacillus coagulans JCM 2257T Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp SHƯD Trang 34 Luận văn Tốt nghiệp khóa 33 2011 Trường Đại học Cần Thơ Hình 10: Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn lactic Trong nguyên liệu thu 22 chủng LA, có chủng có khả tiết hoạt tính kháng khuẩn Mỗi chủng lại có hoạt tính tính chất kháng khuẩn khác Từ chủng có chủng H3, H4, H7 kháng bốn dòng khuẩn chuẩn, chủng H10 kháng ba dòng, chủng H1 kháng hai dòng, nguyên nhân hoạt tính kháng khuẩn (bacteriocin) H3, H4, H7 mạnh, ổn định tiết nhiều nên kháng chủng vi khuẩn dùng để thử Các chủng lại H10, H1 chất kháng khuẩn tiết hoạt tính kháng khuẩn yếu nên tính kháng nhiều dòng vi khuẩn Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp SHƯD Trang 35 Luận văn Tốt nghiệp khóa 33 2011 CHƯƠNG VI Trường Đại học Cần Thơ KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ 6.1 Kết luận Theo kết nghiên cứu ta có kết luận sau: Phân lập tuyển chọn 22 chủng vi khuẩn lactic từ nguyên liệu ban đầu Đặc tính kháng khuẩn thể rõ môi trường thạch MRS LAB thu (sau đun) để ủ qua đêm Trong nguyên liệu cải bẹ muối chua có diện dòng vi khuẩn có đặc tính kháng khuẩn Có chủng tiết chất kháng khuẩn (hay kháng sinh sinh học) bacteriocin thay thể cho thuốc kháng sinh hay chất bảo quản hóa học mà không làm ảnh hưởng đến sức khỏe người 6.2 Đề nghị Do thời gian nghiên cứu bị giới hạn nên không đề tài tiến sâu đặc tính tính chất dòng vi khuẩn tiết chất kháng sinh Vì có điều kiện nên thực nghiên cứu tiếp yếu tố: - Định danh cho dòng vi khuẩn có tính chất kháng khuẩn vừa tìm - Tiến hành nghiên cứu khảng kháng vi khuẩn có bacteriocin phổ rộng Trên nhiều loại vi khuẩn có hại khác : E.coli, listeria… Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp SHƯD Trang 36 Luận văn Tốt nghiệp khóa 33 2011 Trường Đại học Cần Thơ TÀI LIỆU THAM KHẢO Quách Đĩnh, Nguyễn Vân Tiếp, Nguyễn Văn Thoa, 1996, Công nghệ sau thu hoạch chế biến rau quả, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Ts Nguyễn Thị Bích Thủy, Trần Thị Lan Hương, Nhữ Thị Nhung, 2007, Giáo trình Công nghệ bảo quản chế biến rau quả, Nhà xuất Hà Nội Lê Mỹ Hồng, 2000, Kỹ thuật chế biến sản phẩm rau muối chua, Trường Đại học Cần Thơ Ts Nguyễn Đức Thạch, 2000, Những nghề gắn với nông thôn, Nhà xuất Tổng hợp Đồng Nai PGS TS Lương Đức Phẩm, 2006, Nấm men công nghiệp, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Nguyễn Đức Lượng, 2004, Công nghệ vi sinh vật tập - Cơ sở vi sinh vật công nghiệp, Nhà xuất Đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết, 2003, Thí nghiệm công nghệ sinh học tập - Thí nghiệm vi sinh vật học, Nhà xuất Đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Lê Văn Việt Mẫn, 2006, Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm, Nhà xuất Đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh http//www.svdanang.com/@pbkok/showthread.phpt=26867 Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp SHƯD Trang 37 Luận văn Tốt nghiệp Khóa 33 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC THÀNH PHẦN HÓA CHẤT SỬ DỤNG (1) Môi trường MRS Thành phần môi trường MRS (Man, Rogosa, Sharpe) thể bảng Bảng 4: Thành phần môi trường MRS Thành phần Khối lượng (g) Proteose pepton No.3 Beef extract Yeast extract Dextrose Polysorbate 80 Ammonium citrate Sodium acetate Magnesium sulfate Manganese sulfate Dipotassium phosphate 10 10 5,0 20,0 1,0 2,0 5,0 0,1 0,05 2,0 pH cuối 6,5 ± 0,2 (2) Thành phần bổ sung vào môi trường - Bột agar: Bổ sung với tỉ lệ 1,5% vào 500ml môi trường MRS Đây bột tinh khiết , có chứa hợp chất đạm, muối vô cơ, vitamin môi trường lý tưởng để nuôi cấy vi sinh vật - Bên cạnh bổ sung CaCO3 hàm lượng 0,5% cho 500ml môi trường (3) Nước muối sinh lý cân 8,5g NaCl (0,85%) pha lít nước cất Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp SHƯD Trang viii [...]... khuẩn có mặt trong cải bẹ muối chua, tách riêng dùng vi khuẩn lactic từ quần thể vi khuẩn ban đầu trong nguyên liệu 3.4 Bố trí thí nghiệm 3.4.1 Thí nghiệm 1: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic từ nguyên liệu cải bẹ muối chua Mục đích: Tìm ra các dòng vi khuẩn lactic để xác định hoạt tính kháng khuẩn của nó Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được tiến hành các bước là cấy mẫu, cấy chuyền, tăng sinh và. .. ở trực khuẩn thường có hoạt tính cao hơn, nhất là các chủng phân lập được từ ruột non bê nghé Protease của vi khuẩn lactic gồm cả proteinase, peptinase Hoạt tính lipase của vi khuẩn lactic có ở nhiều chủng thuộc cầu khuẩn, trực khuẩn Chế phẩm lipase thu nhận được từ dịch chiết không có tế bào vi khuẩn dễ dàng phân hủy những triglyxerit đơn giản Hoạt tính hóa sinh của vi khuẩn lactic phụ thuộc vào đặc... lactic có khả năng tiết ra loại chất kháng sinh có khả năng kháng, ức chế sự phát triển của các loại vi khuẩn là bacteriocin để ứng dụng vào trong vi c bảo quản thực phẩm, nhưng không gây hại đến sức khỏe con người Đề tài tiến các nghiên cứu sau: - Phân lập và tuyển chọn dòng vi khuẩn lactic từ nguyên liệu cải bẹ muối chua - Xác định hoạt tính kháng khuẩn của dòng vi khuẩn lactic vừa tìm ra Ngành Công nghệ... quan về vi khuẩn lactic 2.6.1 Đặc tính chung Vi khuẩn lactic đã được Pasteur tìm ra từ sữa chua Thuộc vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, có khả năng lên men đường để tạo acid lactic Nhóm vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacteriaccae và được xếp vào bốn chi: Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus và Leuconostoc Nhóm vi khuẩn này có rất nhiều hình dạng khác nhau: có dạng hình que và hình... Thị Bích Thủy, 2007) 2.4.2 Vi sinh vật khác Trong quá trình muối chua rau, ngoài vi khuẩn lactic còn có các vi khuẩn khác cùng phát triển Các vi khuẩn này cũng phân hủy đường, như vi khuẩn butyric, vi khuẩn acetic, vi khuẩn gây thối, nấm men, nấm mốc… làm cho sản phẩm kém chất lượng hoặc làm hư hỏng sản phẩm a) Vi khuẩn butyric Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và SHƯD Trang 8 Luận văn Tốt... đường có sẵn trong nguyên liệu chuyển hóa thành acid lactic, do quá trình lên men lactic bởi các vi khuẩn lactic (một số vi khuẩn khác và nấm men) Acid lactic và các sản phẩm khác của quá trình lên men tạo thành làm cho sản phẩm có hương vị đặc trưng Ngoài ra, acid lactic có tính sát trùng, có khả năng ức chế hoạt động của các loại vi khuẩn gây hư hỏng Quá trình lên men lactic trong rau quả muối chua. .. trình chuyển hóa đường thành acid lactic trong điều kiện yếm khí Dựa vào sản phẩm cuối cùng của quá trình chuyển hóa đường mà Kluyver chia các vi khuẩn sinh acid lactic làm hai nhóm: vi khuẩn lactic lên men đồng hình và vi khuẩn lactic lên men dị hình Nhóm vi khuẩn lên men lactic đồng hình Nhóm vi khuẩn này có nhiệm vụ chính là lên men đường và cho sản phẩm chủ yếu là acid lactic (khoảng 90 ÷ 98%) của quá... lý vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic hoạt động sống ở điều kiện kỵ khí, vì vậy đặc điểm cơ bản của vi khuẩn này là không có catalase Song, những năm gần đây có một số thông báo tìm thấy hoạt tính enzyme này ở một số chủng vi khuẩn lactic ở dạng Pseudocatalase Pseudocatalase thấy ở một số loài thuộc các giống Leuconostoc và Lactobacillus Hoạt tính protease thấy ở cầu khuẩn, trực khuẩn và liên cầu khuẩn. .. Đông Xuân Cải bẹ có thể dùng để nấu canh khi còn non, sau khi trồng 3 – 4 tháng, cây cải có bắp thì có thể thu hoạch làm dưa, khối lượng mỗi cây từ 1 – 3kg Năng suất các giống cải bẹ ở Vi t Nam có thể đạt 30 – 70 tấn/ha (Mai Thị Phương Anh, 1996) 2.2 Sơ đồ quy trình sản xuất cải bẹ muối chua 2.2.1 Quy trình sản xuất Nguyên liệu Lựa chọn, phân loại Rửa Tạo hình, xếp vào thùng, bể muối Rót nước muối Lên... vi khuẩn tách từ rượu vang có thể chịu được pH 3 ÷ 3,5 hoặc thấp hơn, các chủng tách từ dưa, mắm chua chịu được pH 3,7 trở lên…Chịu được acid nhiều hơn cả các cầu khuẩn lên men dị hình, ít hơn là các trực khuẩn lên men dị hình Các trực khuẩn lên men đồng hình chiếm vị trí trung gian 2.7 Các vấn đề liên quan đến vi c tuyển chọn và phân lập vi khuẩn lactic 2.7.1 Tiệt trùng dụng cụ và môi trường làm vi c ... dòng vi khuẩn lactic có tính kháng khuẩn có mặt cải bẹ muối chua, tách riêng dùng vi khuẩn lactic từ quần thể vi khuẩn ban đầu nguyên liệu 3.4 Bố trí thí nghiệm 3.4.1 Thí nghiệm 1: Phân lập tuyển. .. TẮT Phân lập tuyển chọn vi khuẩn từ nguyên liệu cải bẹ muối chua, nhằm tìm dòng vi khuẩn lactic có khả tiết chất kháng khuẩn gọi bacteriocin Để sử dụng vi c bảo quản, ức chế, tiêu diệt loại vi khuẩn. .. liệu cải bẹ muối chua tiến hành phân lập chủng vi khuẩn lactic môi trường MRS Kết thu sau: Thu 22 dòng vi khuẩn lactic chọn ngẫu nhiên từ nguyên liệu cải bẹ muối chua ban đầu, khuẩn lạc chủng có