BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP NESTED RT-PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP (PRRSV) TRÊN HEO Ngành học: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2005 – 2009 Sinh viên thực : LĂNG VĂN ĐỨC Tháng 8/2009 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP NESTED RT-PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP (PRRSV) TRÊN HEO Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực PGS.TS NGUYỄN NGỌC HẢI LĂNG VĂN ĐỨC Tháng 8/2009 LỜI CẢM ƠN  Chân thành cảm ơn: Ban giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Mơn Công Nghệ Sinh Học tất quý Thầy Cô truyền đạt kiến thức cho suốt trình học tập trường Các Thầy Cơ anh chị Viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học Mơi Trường Trường Đại Học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh tận tình bảo tạo điều kiện tốt cho tơi suốt q trình thực tập tốt giúp Chị Đặng Ngọc Thuỳ Dương chị Lê Thị Kim Phượng tận tình bảo hướng dẫn tơi q trình thực đề tài Các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học 31 động viên giúp đỡ tơi suốt q trình học tập thực khoá luận  Đặc biệt xin chân thành cảm ơn: PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải tận tình dạy bảo, hướng dẫn, giúp đỡ động viên suốt q trình nghiên cứu thực khóa luận Ba mẹ người thân gia đình tạo điều kiện động viên suốt trình học tập trường Thủ Đức, tháng 08 năm 2009 Lăng Văn Đức iii TÓM TẮT Đề tài : “Ứng dụng phương pháp nested RT – PCR để phát virus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp (PRRSV) heo” thực từ ngày 16/2/2009 đến ngày 16/7/2009, Viện Nghiên Cứu Công nghệ Sinh Học Môi Trường Trường Đại Học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh nhằm đánh giá khả phát virus PRRS huyết heo phương pháp RT-PCR nested RT-PCR để lựa chọn phương pháp thích hợp xét nghiệm virus PRRS Mẫu máu thu thập heo có dấu hiệu nghi ngờ nhiễm bệnh PRRS chiết lấy huyết để ly trích RNA virus Quy trình RT-PCR dùng để phát RNA virus PRRS mẫu thu thập Sử dụng quy trình nested RT-PCR phát RNA virus PRRS phân biệt hai kiểu gene virus mẫu vắc-xin mẫu thu thập Thiết lập quy trình so sánh khả phát RNA virus PRRS hai phương pháp Khi sử dụng phương pháp RT-PCR phát 12/20 mẫu có kết dương tính 8/20 mẫu có kết âm tính Với phương pháp nested RT-PCR phát 18/20 mẫu có kết dương tính 2/20 mẫu có kết âm tính mẫu xét nghiệm Trong đó, có 2/18 mẫu nhiễm dịng châu Âu, 10/18 mẫu nhiễm dòng Châu Mỹ 6/18 mẫu nhiễm hai dòng Khi so sánh độ nhạy hai phương pháp mẫu huyết pha lỗng phương pháp RT-PCR phát RNA virus độ pha lỗng từ 100 đến 10 -5, cịn phương pháp nested RT-PCR phát độ pha loãng từ 100 đến 10 -8 Tám mẫu âm tính với phương pháp RT-PCR, kiểm tra nested RT-PCR cho kết 6/8 mẫu dương tính Độ nhạy phương pháp nested RT-PCR phát virus PRRS cao hẳn phương pháp RT-PCR Những mẫu âm tính với phương pháp RT-PCR nên kiểm chứng lại phương pháp nested RT-PCR iv SUMMARY Thesis: “Using the nested RT-PCR method to detect Porcine reproduction and respiratory syndrome virus (PRRSV) in swine” had been done from 16/2/2009 to 16/7/2009, at Insitute of Biotechnological and environmental research of Nong Lam university Ho Chi Minh city to compare of possibility to detect PRRSV in blood swine between RT-PCR and nested RT-PCR methods to select a suitable method in diagnostic PRRSV Blood samples taken from swine suspected of PRRSV infection was extracted to serum to prepare RNA of virus The RT-PCR protocol was used to determine RNA of PRRSV in collecting samples The nested RT-PCR protocol was used to determine RNA of PRRSV and distinguish between the European and the American genotypes of the virus in collecting samples and vaccine samples The comparison procedure was carried out for testing the possibility in detection RNA of PRRSV between these two methods The RT-PCR method could determine 12 positive samples in 20 samples, whereas the nested RT-PCR method could determine 18 positive samples in 20 samples In the results, there were 2/18 samples infected European strain only, 10/18 samples infected American strain only and 6/18 samples infected boths In compairing the sensitivity of two methods, the RT-PCR method could determine virus RNA from 100 to 10 -5 RNA extract dilution, the nested RT-PCR method could determine virus RNA from 100 to 10 -8 RNA extract dilution Eight negative samples of the RT-PCR method were tested again by the nested RT-PCR method and the results showed 6/8 positive samples In this research, the sensitivity of the nested RT-PCR method was higher than that of the RT-PCR method to detect RNA of PRRSV The negative samples of the RT-PCR method should be tested again by the nested RT-PCR method v MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN iii TÓM TẮT iv SUMMARY v MỤC LỤC vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH SÁCH CÁC BẢNG ix DANH SÁCH CÁC HÌNH x Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích – yêu cầu 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn .3 2.1.1 Giới thiệu 2.1.2 Lịch sử bệnh .3 2.1.3 Phân loại, đặc điểm hình thái cấu trúc virus PRRS .4 2.1.3.1 Phân loại virus PRRS .4 2.1.3.2 Một số đặc điểm hình thái cấu trúc virus PRRS 2.1.4 Phân kiểu gene virus 2.2 Chẩn đoán 2.2.1 Chẩn đoán lâm sàng 2.2.2 Chẩn đoán phi lâm sàng 2.3 Phương pháp RT-PCR 10 2.3.1 Nguyên tắc phản ứng RT-PCR 10 2.3.2 Các enzyme sử dụng phiên mã ngược 10 2.3.3 Các primer phiên mã ngược .11 2.4 Phương pháp nested-PCR 11 2.4.1 Giới thiệu chung nested-PCR .11 vi 2.4.2 Các bước nested-PCR 12 2.5 Những nghiên cứu giới Việt Nam 13 2.5.1 Trên giới .13 2.5.2 Tại Việt Nam 14 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .15 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 15 3.2 Đối tượng số lượng mẫu 15 3.3 Nội dung nghiên cứu 15 3.4 Thiết bị, dụng cụ, vật liệu hóa chất sử dụng 15 3.4.1 Thiết bị dụng cụ sử dụng 15 3.4.2 Vật liệu, kit hóa chất sử dụng cho RT-PCR nested RT-PCR 16 3.4.3 Vật liệu hóa chất sử dụng cho điện di 17 3.4.4 Phương pháp lấy mẫu xét nghiệm .17 3.4.5 Ly trích RNA 17 3.4.6 Điện di sản phẩm PCR .18 3.5 Các bước nội dung thực 18 3.5.1 Các bước thực 18 3.5.2 Nội dung tiến hành thí nghiệm 19 3.5.2.1 Xác định nhiễm virus PRRS phương pháp RT-PCR 19 3.5.2.2 Xác định nhiễm virus PRRS phân biệt dòng nested RT-PCR 20 3.5.2.3 So sánh độ nhạy phương pháp RT-PCR nested RT-PCR .22 3.6 Xử lý số liệu 22 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 4.1 Kết xác định nhiễm virus PRRS heo phương pháp RT-PCR 23 4.2 Kết nhiễm phân biệt hai dòng virus PRRS nested RT-PCR 24 4.3 Kết so sánh độ nhạy đặc hiệu RT-PCR nested RT-PCR 26 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 29 5.1 Kết luận .29 5.2 Đề nghị 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO 30 PHỤ LỤC vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT - dNTP: Deoxynucleotide triphosphate - EDTA: Ethylene diamine tetra acetid acide - ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay - EMEM: Eagle Minimum Essential Medium - FA: Formaldehyde agarose - FITC : Fluorescein isothiocynate - HRPO: Horseradish Peroxidase - IFA: Immuno Peroxidase Monolayer Assay - IHC: Immunohistochemistry Staining - IPMA: Immuno peroxidase Monolayer Assay - Lad: Ladder - MSD: Mystery Swine Disease - nested RT-PCR: Reverse transcriptase - nested - polymerase chain reaction - OIE: Office International Epizooties - ORF: Open reading frame - PAMs: Pulmonary alveolar macrophage - PEARS: Porcine Epidemic Abortion and Respiratory Syndrome - PRRS: Porcine reproduction and respiratory syndrome - PRRSV: Porcine reproduction and respiratory syndrome virus - RNA: Ribonucleotide Acid - RT- PCR: Reverse transcriptase polymerase chain reaction - SIRD: Swine Infertility and Respiratory Disease - SNV: Serum neutralization virus - TBE: Tris borate EDTA - μl: Micro lit viii DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Trình tự mồi sử dụng phương pháp RT-PCR để phát virus 16 Bảng 3.2 Trình tự nucleotide cặp primer dùng cho phản ứng 17 Bảng 3.3 Thành phần phản ứng RT-PCR .20 Bảng 3.4 Quy trình nhiệt theo kit Qiagen OneStep RT-PCR ……20 Bảng 3.5 Liều lượng cho thành phần phản ứng nested-PCR (Promega) 21 Bảng 3.6 Chu kì nhiệt cho nested-PCR (Promega) .21 Bảng 4.1 Kết phát RNA virus PRRS RT-PCR .24 Bảng 4.2 Kết phát RNA virus PRRS nested RT-PCR 26 Bảng 4.3 Kết phân biệt hai kiểu gene virus PRRS nested RT-PCR .26 Bảng 4.4 Kết so sánh độ nhạy hai phương pháp 26 Bảng 4.5 Kết phát virus PRRS hai phương pháp 28 ix DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 2.1 Virus PRRS Hình 2.2 Cấu trúc gene virus PRRS .6 Hình 2.3 Các bước phản ứng nested-PCR 12 Sơ đồ 3.1 Quy trình điện di chụp gel 18 Hình 4.1 Kết phát virus PRRS huyết RT-PCR 23 Hình 4.2 Kết phát virus PRRS mẫu vaccine nested RT-PCR 24 Hình 4.3 Kết phát virus PRRS nested RT-PCR 25 Hình 4.4 Độ nhạy hai phương pháp với virus PRRS huyết heo 27 Hình 4.5 Độ nhạy nested RT-PCR phát virus PRRS mẫu 28 Sơ đồ 3.2 Cách thực chạy RT-PCR nested RT-PCR nội dung 18 Sơ đồ 3.3 Sử dụng RT-PCR phát virus PRRS heo .19 Sơ đồ 3.4 Cách thực so sánh độ nhạy hai phương pháp …… 22 Sơ đồ 3.5 Cách thực kiểm tra độ nhạy phương nested RT-PCR 22 x khuếch đại đặc hiệu đoạn gene có kích thước khoảng 241 bp 337 bp nhóm virus PRRS kiểu gene Châu Âu Châu Mỹ tương ứng Thực phản ứng PCR theo kit Promega Taq (Promega) với thành phần phản ứng bảng 3.5 chu kì nhiệt bảng 3.6 Bảng 3.5 Liều lượng cho thành phần phản ứng nested-PCR Thành phần Liều lượng cho phản ứng (µl) Nồng độ đầu Nồng độ cuối PCR buffer (5X) PCR buffer (1X) MgCl2 (25 mM) MgCl2 (2,5 mM) dNTP’s(10mM cho loại) dNTP’s(0,2 mM loại) Primer F2 F3 (10 µM) Primer F2 F3(0,5 µM) Primer R2 R3 (10 µM) Primer R2 R3 (0,5 µM) Taq enzyme (0,5 U) Taq enzyme (5U/l ) Mẫu RNA sản phẩm RT-PCR H2O Tổng 1 0,1 8,9 20 Kiểu gene Châu Mỹ: Dùng cặp primer F2 R2; Kiểu gene Châu Âu: Dùng cặp primer F3 R3 Chu kì nhiệt cho phản ứng nested-PCR: Bảng 3.6 Chu kì nhiệt cho nested-PCR (Promega) Bước Hoạt động Nhiệt độ (oC) Thời gian Tiền biến tính 95 phút Biến tính 95 20 giây Bắt cặp 58 40 giây 21 giây Kéo dài 72 Lặp lại bước đến bước 25 chu kì Hoàn thành Giữ sản phẩm 72 phút Điện di sản phẩm gel agarose (1,5 %) với hiệu diện 85 V 35 phút Sau nhuộm, rửa gel chụp gel phần mềm Quality One Biorad So sánh kết với ladder 100 bp mẫu đối chứng Mẫu có băng 433 bp có thêm băng 241 bp nhiễm virus PRRS kiểu gene Châu Âu Cịn mẫu có băng 433 bp 337 bp mẫu nhiễm virus PRRS kiểu gene Châu Mỹ Mẫu có băng 433 bp có thêm băng 241 bp 337 bp mẫu nhiễm hai kiểu gene Mẫu không xuất hay xuất băng không phù hợp với mẫu đối chứng mẫu âm tính Chỉ tiêu theo dõi: Kết xuất băng hai mẫu vaccine Tỉ lệ nhiễm virus PRRS kiểu gene mẫu huyết heo thu thập 21 3.5.2.3 So sánh độ nhạy đặc hiệu phương pháp RT-PCR nested RT-PCR phát virus PRRS heo Lấy mẫu có kết dương tính nội dung pha lỗng thành nồng độ khác sử dụng cho phản ứng RT-PCR với cặp primer ORF6 đồng thời cho phản ứng nested RT-PCR với cặp primer ORF7 (Sơ đồ 3.4) Thực kiểm chứng với nhiều mẫu dương pha lỗng Mẫu dương tính với hai phương pháp Pha loãng Chạy RT-PCR sử dụng primer ORF6 nested RT-PCR với primer ORF7 Sơ đồ 3.4 Cách thực sánh độ nhạy phương pháp RT-PCR nested RT-PCR Ngoài ra, chúng tơi cịn kiểm tra mẫu âm tính nội dung nested RT-PCR để kiểm tra độ nhạy phương pháp phát mẫu âm tính giả (Sơ đồ 3.5) Mẫu ân tính với RT-PCR sử dụng primer ORF6 Kiểm tra lại nested RT-PCR với Primer ORF7 Sơ đồ 3.5 Cách thực kiểm tra độ nhạy phương nested RT-PCR Điện di sản phẩm để xem kết gel để so sánh độ nhạy hai phương pháp phát RNA virus Kích thước sản phẩm virus PRRS kiểu gene Châu Mỹ hay châu Âu phải tương ứng với kiểu gene đối chiếu với ladder 100 bp mẫu đối chứng Tỉ lệ phát virus PRRS kiểu gene Châu Mỹ hay châu Âu phương pháp mẫu dương Tỉ lệ phát virus PRRS mẫu âm kiểm tra phương pháp RT-PCR sử dụng primer ORF6 phương pháp nested RT-PCR 3.6 Xử lý số liệu Tỷ lệ nhiễm trình bày theo tỷ lệ khoảng tin cậy tỷ lệ Sử dụng trắc nghiệm chi bình phương phần mềm Statgraphic 7.0 để so sánh tỷ lệ 22 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết xác định nhiễm virus PRRS heo phương pháp RT-PCR Khi sử dụng phương pháp RT-PCR với primer ORF6 để kiểm tra mẫu RNA ly trích từ mẫu máu heo nghi ngờ nhiễm thu thập trại heo Kết cho thấy có 12/20 (60 %) mẫu có kết dương tính 8/20 (40 %) mẫu có kết âm tính (Bảng 4.1) Kết phụ hợp với Trần Thị Ánh Hồng (2007) tác giả sử dụng RT-PCR với primer ORF6 để phát virus PRRS (Hình 4.1) 500 bp Hình 4.1 Kết phát virus PRRS huyết heo RT-PCR Giếng 2: Mẫu (âm tính); Giếng 4: Mẫu 20 21 (dương tính); Giếng 5: DC(+): Đối chứng dương; Giếng 6: Lad (Thang chẩn 100bp); Giếng 7: DC(-): Đối chứng âm; Giếng 9: Mẫu 23 24 (âm tính); Giếng 10, 11 12: Mẫu 27, 28 82 (dương tính) Khi sử dụng phương pháp RT-PCR với primer ORF6 để phát RNA virus PRRS khó phân biệt mẫu nhiễm kiểu gene Sản phẩm khuếch đại cho kiểu gene Châu Mỹ khoảng 508 bp cho kiểu gene Châu Âu khoảng 485 bp, khó khăn xác định hai kiểu gene virus PRRS gel Đây nhược điểm sử dụng phương pháp RT-PCR với primer ORF6 phát virus PRRS Ngoài ra, sản phẩm phụ tạo nhiều sử dụng phương pháp RT-PCR với primer ORF6 Điều hay xảy thực phản ứng PCR, độ đặc hiệu mồi hay nồng độ số chất chưa thật tối ưu phản ứng Tuy nhiên, sản phẩm phụ có kích thước 23 nhỏ 100 bp nên sử dụng phương pháp RT-PCR với primer ORF6 để phát RNA virus PRRS mẫu… Bảng 4.1 Kết phát RNA virus PRRS phương pháp RT-PCR với primer ORF6 Kết Số mẫu Tỉ lệ (%) Dương tính 12 60 Âm tính 40 20 100 Tổng 4.2 Kết xác định nhiễm phân biệt hai kiểu gene virus PRRS phương pháp nested RT-PCR Với mẫu vaccine kiểm tra nested RT-PCR để chuẩn hóa qui trình cho băng tương ứng với virus PRRS kiểu gene Châu Âu khoảng 241 bp với virus PRRS kiểu gene Châu Mỹ khoảng 337 bp Trên gel xuất băng khoảng 337 bp mẫu vaccine Besta xuất hai băng khoảng 337 bp băng 241 bp vaccine Porcillis Kết thu theo nhà cung cấp với mẫu vaccine Besta nhiễm virus PRRS kiểu gene Châu Mỹ mẫu vaccine Porcillis nhiễm hai kiểu gene (Hình 4.2) Kết thực hai mẫu vaccine cho thấy sử dụng quy trình nested RT-PCR với thành phần phản ứng trình nhiệt nêu để phát virus PRRS 500 bp 337 bp 241 bp Hình 4.2 Kết phát virus PRRS mẫu vaccine nested RT-PCR Be: Vaccine Besta; LAD: thang chuẩn 100 bp; Por: Vaccine Porcillis 24 Những mẫu ly trích kiểm tra phương pháp RT-PCR với primer ORF6 kiểm tra nhiễm virus PRRS phương pháp nested RT-PCR với primer ORF7 Pesch (2003) Với phương pháp nested RT-PCR phát 18/20 (90 %) mẫu dương tính 2/20 (10 %) mẫu có kết âm tính (Bảng 4.2) Trong đó, số mẫu nhiễm kiểu gene Châu Mỹ 10/18 (55,56 %) mẫu, số mẫu nhiễm kiểu gene Châu Âu 2/18 (11,11 %) mẫu số mẫu nhiễm hai kiểu gene 6/18 (33,33 %) mẫu Phương pháp nested RT-PCR phát phân biệt hai kiểu gene virus PRRS mẫu thu thập (Hình 4.3) DC (-) Lad 25 O EU US O EU US O EU US 22 23 Lad O EU US O EU US O US uÚUUS 28 EU US a) O US T5 EU US O 26 EU b) Lad US O O EU US 500 bp DC (+) EU US 433 bp 337 bp 241bp c) Hình 4.3 Kết phát virus PRRS huyết heo nested RT-PCR O: Outer (Đoạn chung); EU: Kiểu gene Châu Âu; US: Kiểu gene Châu Mỹ; Lad: Thang chẩn 100 bp; a) Mẫu 28: Nhiễm kiểu gene Châu Mỹ, DC (-): Mẫu đối chứng âm, mẫu 25 25: Nhiễm kiểu gene Châu Âu; b) Mẫu 22: Nhiễm kiểu gene Châu Âu, mẫu 23: Nhiễm hai kiểu gene; c) Mẫu T5: Nhiễm hai kiểu gene, mẫu 26:Nhiễm kiểu gene Châu Mỹ, DC(+): Mẫu đối chứng dương Kết phù hợp với nghiên cứu U Truyen ctv (2006) tác giả sử dụng đoạn outer primer Mardassi ctv (1994) inner primer Pesch ctv (2003) để phát phân biệt hai kiểu gene virus PRRS máu heo nghi ngờ nhiễm virus PRRS 25 Bảng 4.2 Kết phát RNA virus PRRS phương pháp nested RT-PCR với primer ORF7 Kết Số mẫu Tỉ lệ (%) Dương tính 18 90 Âm tính 10 20 100 Tổng Bảng 4.3 Kết phân biệt hai kiểu gene virus PRRS phương pháp nested RT-PCR mẫu dương tính Kiểu gene Kiểu gene Cả hai Tổng Mẫu Châu Mỹ Châu Âu kiểu gene nhiễm 10 (55,56 %) Số mẫu (Tỉ lệ %) (11,11 %) (33,33 %) 18 (100 %) Theo bảng số liệu bảng 4.3 sử dụng phương pháp nested RT-PCR phân biệt mẫu nhiễm kiểu gene virus PRRS Trong đó, mẫu nhiễm kiểu gene Châu Mỹ chiếm chủ yếu, mẫu nhiễm kiểu gene Châu Âu Kết phân biệt kiểu gene virus PRRS phù hợp với Trần Thị Dân ctv (2007) tác giả sử dụng phương pháp ELISA phát phân biệt hai kiểu gene virus số sở chăn nuôi heo miền Đông Nam Bộ heo nghi ngờ nhiễm phát 36,78 % có 85,71 % số sở chăn ni bị nhiễm Trên mẫu nhiễm có 59,23 % số mẫu nhiễm kiểu gene Châu Mỹ, 3,8 % số mẫu nhiễm kiểu gene Châu Âu 36,92 % số mẫu nhiễm kiểu gene 4.3 Kết so sánh độ nhạy đặc hiệu phương pháp RT-PCR nested RT-PCR phát virus PRRS heo Độ nhạy hai phương pháp PCR kiểm tra với nhiều mẫu dương tính với virus PRRS pha lỗng bậc 10 cho kết khác (Bảng 4.4) Bảng 4.4 Kết so sánh độ nhạy hai phương pháp phát virus PRRS kiểu gene Châu Mỹ Mức phát Mẫu RT-PCR Nested RT-PCR 22 T3 T4 T5 10-3 10-3 10-4 10-5 10-4 10-4 10-8 10-7 10-8 10-8 10-6 10-6 26 Kết hai phương pháp kiểm tra gel agarose 1,5 % cho băng sản phẩm có kích thước khoảng 508 bp tương ứng với primer ORF6 băng khoảng 337 bp tương úng với primer ORF7 Pesch mẫu nhiễm kiểu gene virus Châu Mỹ Sản phẩm nested RT-PCR có độ nhạy độ đăc hiệu phương pháp RT-PCR (Hình 4.4) 100 10-1 10-2 10-3 10-410-5 10- 10-710-8 Lad 100 10-1 10-2 10-310-4 10-5 10-6 10-7 10-8 508 bp 337 bp Hình 4.4 Độ nhạy RT-PCR nested RT-PCR phát virus PRRS kiểu gene Châu Mỹ Giếng 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9: mẫu phát RT-PCR; Giếng 10 ladder; Giếng 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19: mẫu phát nested RT-PCR Từ số liệu bảng 4.4 cho thấy phương pháp nested RT-PCR phát mẫu có nồng độ pha loãng thấp tốt phương pháp RT-PCR Kết phù hợp với nghiên cứu nhiều tác giả (Fetzer ctv, 2006; U Truyen ctv, 2006) sử dụng quy trình nested RT-PCR với primer thiết kế Mardassi Pesch để kiểm tra độ nhạy phương pháp Kết so sánh độ nhạy hai phương pháp RT-PCR nested RT-PCR phù hợp với nghiên cứu Lo cộng Tác giả độ nhạy phương pháp nested-PCR phương pháp PCR thông thường 10.000 lần Phương pháp nested-PCR phương pháp nhanh tin tưởng để kiểm tra sản phẩm PCR Kiểm tra lại mẫu âm tính phương pháp RT-PCR với đoạn primer ORF6 phương pháp nested RT-PCR với primer ORF7 cho kết 6/8 mẫu dương tính Kết cho thấy sử dụng kỹ thuật nested RT-PCR cần thiết chẩn đoán virus PRRS, cho phép phát mẫu âm tính giả (Hình 4.5) 27 500 bp 433 bp 337 bp 241 bp Hình 4.5 Độ nhạy phương pháp RT-PCR nested RT-PCR phát virus PRRS O: outer (Đoạn chung); EU: kiểu gene Châu Âu; US: kiểu gene Châu Mỹ; Giếng 1, 2, 4: mẫu 19, 21, 25 29 (Mẫu cho kết âm tính với RT-PCR); Giếng 5: Lad (Thang chẩn); Giếng 6, 7, 8: mẫu 19, giếng 9, 10, 11: mẫu 21, giếng 12, 13, 14: mẫu 25, giếng 15, 16, 17: mẫu 29 (Mẫu cho kết dương tính với nested RT-PCR) Từ số liệu bảng 4.5 xử lý thống kê (P < 0,05) cho thấy phương pháp nested RT-PCR với primer ORF7 tốt phương pháp RT-PCR với primer ORF6 phát mẫu nhiễm virus PRRS (18/20 dương tính so với 12/20) Kỹ thuật nested RT-PCR cịn thể ưu điểm chẩn đoán phân biệt kiểu gene virus PRRS nhiễm: Châu Âu Châu Mỹ Bảng 4.5 Kết phát virus PRRS phương pháp RT-PCR nested RT-PCR Kết RT-PCR Nested RT-PCR Tổng Dương tính 12 18 30 Âm tính 10 Tổng 20 20 40 Sai biệt thống kê P = 0,028 Phương pháp nested RT-PCR thực có ưu điểm nhạy đặc hiệu phương pháp RT-PCR chuẩn đốn virus PRRS Phương pháp nested RT-PCR cịn mẻ chưa áp dụng nhiều Việt Nam Với kết thực đề tài số nghiên cứu giới cho thấy áp dụng phương pháp chuẩn đoán virus PRRS heo nước ta 28 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Kỹ thuật nested RT-PCR sử dụng primer ORF7 phát phân biệt virus PRRS kiểu gene châu Âu châu Mỹ với độ nhạy cao khoảng 1.000 lần so với kỹ thuật RT-PCR Độ nhạy phương pháp nested RT-PCR RT-PCR phát virus PRRS tùy vào mẫu kiểm tra có nồng độ cao hay thấp RNA Có thể sử dụng kỹ thuật RT-PCR với primer ORF6 việc chẩn đốn virus PRRS heo Quy trình RT-PCR với primer ORF6 chưa đặc hiệu nên thấy nhiều băng sản phẩm phụ Phương pháp nested RT-PCR sử dụng để kiểm tra lại mẫu âm tính phương pháp RT-PCR 5.2 Đề nghị Ứng dụng phương pháp nested RT-PCR phát phân biệt hai kiểu gene virus PRRS mẫu thu thập khác (tinh dịch, gan, phổi, amidan, dịch nuôi cấy tế bào) Thực kỹ thuật nested RT-PCR RT-PCR độ pha lỗng cao để có đánh giá xác độ nhạy kỹ thuật nested RT-PCR Nghiên cứu thực kỹ thuật nested RT-PCR RT-PCR đoạn ORF6 để có đánh giá rõ kỹ thuật nested RT-PCR RT-PCR chẩn đoán virus PRRS 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Hồ Huỳnh Thuỳ Dương.1998 Sinh học phân tử Nhà xuất Giáo Dục, Thành phố Hồ Chí Minh, trang 190-199 Nguyễn Ngọc Hải 2007 Công nghệ sinh học thú y Nhà xuất Nông Nghiệp, trang 23-101 Trần Thị Ánh Hồng 2008 Phân lập virus PRRS môi trường tế bào MARC-145 xác định virus kỹ thuật RT-PCR Luận văn tốt nghiệp kỹ sư ngành Công nghệ Sinh học, trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Trần Thị Bích Liên Trần Thị Dân 2007 Xác định tỉ lệ nhiễm chủng virus PRRS số sở chăn nuôi heo miền Đông Nam Bộ Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y số 6-2007, trang 5-9 Trần Thị Bích Liên 2008 Bệnh tai xanh heo Nhà xuất Nông nghiệp thành phố Hồ Chí Minh, trang 9-36 Trần Đức Minh 2006 Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (Bài dịch từ: Theriogenology 66) Hoàng Văn Năm 2001 Hội chứng sinh sản hô hấp lợn (bài dịch tổng hợp) Tạp chí khoa học thú y, trang 74-87 Nguyễn Nhất Bảo Quốc 2005 Ứng dụng kĩ thuật RT-PCR để phát virus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn Luận văn tốt nghiệp kỹ sư ngành Công nghệ Sinh học, trường Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Huỳnh Trọng Tiến 2007 Phát virus gây hội chứng gây rối loạn sinh sản hô hấp heo (PRRS) kĩ thuật RT-PCR Luận văn thạc sĩ, trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh, Khoa Chăn Nuôi Thú Y, trường Đại học Nông Lâm, Tp Hồ Chí Minh 10 Võ Ngọc Thơ 2007 Phân lập virus PRRS môi trường tế bào MARC-145 xác định virus kỹ thuật RT - PCR Luận văn tốt nghiệp kỹ sư ngành Công nghệ Sinh học, Trường Đại Học Nơng Lâm, Tp Hồ Chí Minh 11 Võ Thị Đan Thanh 2006 Phân lập virus PRRS môi trường tế bào MARC-145 xác định virus phương pháp RT-PCR Luận văn tốt nghiệp bác sĩ thú y ngành Chăn Nuôi Thú Y, trường Đại Học Nông Lâm, Tp Hồ Chí Minh 30 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 12 Ausvetplan 2004 Disease stratery porcine reproductive and respiratory syndrome http://www.aahc.com.au/ausvetplan/index.htm 13 C.Fetzer, S Pesch, V.F Ohlinger 2006 High risk of false positive results in a widely used diagnostic test for detection of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) Veterinary Microbiology.115: 21-31 14 Benfield DA, Nelson JK, Rossow KR, Nelson C, Steffen M, Rowland RR 1999 Diagnosis of persistent or prolonged porcine reproductive and respiratory syndrome virus infections Proc 3rd Symp PRRS and Aujeszky's Dis Ploufragan, France, 151-152 15 Davidson 2002 Nested Primers for PCR 16 Wagstrom, E A., K J Yoon, C Cook, and J J Zimmerman 2000 Diagnostic performance of a reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) test to detect porcine reproductive and respir-atory syndrome virus J Vet Diag Invest 12: 75–78 17 Wagstrom, E A., C C Chang K J Yoon J J Zimmerman 2001 Shedding of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in mammary gland secretions of sows Am J Vet Res 62: 1876-1880 18 Fun In Wang 1994 Minimal residues of porcine reproduction and respiratory syndrome virus in pig carcases and boar semen Proc Natl Sci counc ROC(B) 33: 167-174 19 Mardassi H, Mounir S, Dea S 1994 Identification of major differences in the nucleocapsid protein genes of a Quebec strain and European strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus J Gen Virol 75:681–685 20 Han-Kook Chung, Changsun Choi, Junghyun Kim, Chanhee Chae 2002 Detection and differentiation of North American and European genotypes of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues by multiplex reverse transcription-nested polymerase chain reaction Vet Diagn Invest 14:56–60 21 Christopher-Hennings, J., E A Nelson, J K Nelson, R J Hines, S L.Swenson, H T Hill, J J Zimmerman, J B Katz, M J Yaeger, C C L.Chase, and D A Benfield 1995 Detection of porcine reproductive and respiratory syndrome vi-rus in boar semen by PCR J Clin Microbiol 33:1730–1734 22 Zimmerman J, Benfield DA, Murtaugh MP, et al 2006 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (Porcine arterivirus) In: Diseases of swine, ed Straw BE, Zimmerman JJ, D’Allaire S, Taylor DJ, 9th ed, 387–417 31 23 Meulenberg Janneke J.M., 2000 PRRS, the virus http//www.csirus.com 24 Yoon, K.J., J.J Zimmerman, S.L Swenson, M.J McGinley, K.A Eernisse, A Brevik, L.L Rhinehart, M.L Frey, H.T Hill, and K.B Platt 1995 Characterization of the humoral immune response to porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus infection J Vet Diagn Invest 7:305-312 25 Yoon K.J.,and Stevenson G 1999 Porcine reproductive and respiratory syndrome Trends in emerging viral infection of swine Iowa State Press 347- 354 26 Bierk, M D., S A Dee, K D Rossow, J E Collins, M I Guedes, and T W Molitor 2000 Experiences with tonsil biopsy as an antemortem diagnostic test for detecting porcine reproductive and respiratory syndrome virus in-fection in breeding swine Swine Health Prod 8:279–282 27 Delputte, P L., Vanderheijden, N., Nauwynck, H J & Pensaert, M B 2002 Involvement of the matrix protein in attachment of porcine reproductive and respiratory syndrome virus to a heparinlike receptor on porcine alveolar macrophages J Virol 76: 4312–4320 28 R.Allende, W.W.Laegreid, G.F.Kutish, J.A.Galeota, R.W.Wills and F.A.Osorio 2000 Porcine Reproductive And Respiratory Syndrome Virus: Description Of Persistence In Individual Pigs Upon Experimental Infection Journal of Virology 10834–10837 29 Pesch S 2003 Etablierung einer Nachweismethode fur die zwei Genotypen von PRRSV und ein Beitrag zu seiner molekularen Epidemiologie Doctoral Vet Med Thesis, Veterinary Faculty Universitat Leipzig, Leipzig 30 U Truyen, S.Wilhelm M Genzow and G Schagemann 2006 Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV): A Ring Test Performed in Germany to Assess RT-PCR Detection Methods; J Vet Med B 53: 68–74 TÀI LIỆU INTERNET http://www.agraroldal.hu http://www.davidson.edu/ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi http://www.porcilis-prrs.com/microbiology-prrsv-structure.asp http://www.porkboard.org/docs/PRRSchapter3.pdf http:/nestedpcr/NewFolder/drfer.htm 32 PHỤ LỤC Dung dịch đặt mẫu 3X Dung dịch đặt mẫu 3X gồm: bromophenol blue 0,1 %, EDTA 1,6 mM, formaldehyde 0,36 M, glycerol %, formamide 12,04 %, FA (formaldehyde agarose) gel buffer 1,6 M Quy trình ly trích RNA huyết (QIAamp Viral RNA Mini Handbook) Các bước chuẩn bị: Chuẩn bị Buffer AVL carrier RNA Thêm 310 µl buffer AVE vào tube chứa 310 µg carrier RNA khan để tạo thành dd nồng độ µg/µl Rã đơng hồn tồn chia nhỏ để dễ sử dụng dung dịch khơng rã đông lần Kiểm tra Buffer AVL có kết tủa phải ngâm 80 oC kết tủa tan hết (không ngâm 5phút) sử dụng Buffer theo bảng sau: Bảng Thể tích buffer AVL buffer AVL-carrier RNA kit li trích QIAamp Viral RNA Mini Handbook Buffer AVL-carrier RNA nên pha sử dụng liền Buffer ổn định 2-8 oC 48 Buffer có kết tủa bảo quản 2-8 oC, phải rã đơng 80 oC trước sử dụng, nhiên không nên rã đông lần lần không 5phút Buffer AW1: Thêm 25ml ethanol tuyệt đối 19ml AW1 (bảo quản năm) Buffer AW2: Thêm 30ml ethanol tuyệt đối 13ml AW2 (bảo quản năm) Quy trình ly trích RNA huyết theo kit QIAamp Viral RNA Mini: Hút 560μl Buffer AVL+carrier RNA vào tube 1.5ml Nếu mẫu >140 µl, tăng lương Buffer AVL+carrier RNA tương ứng theo tỷ lệ sử dụng tube lớn Thêm vào 140μl mẫu huyết Mix (trộn lẫn hỗn hợp) cách vortex 15 giây Lưu ý nên mix thành hỗn hợp đồng để tăng hiệu ly giải Những mẫu rã đông nên rã đông lần Để nhiệt độ phịng 10 phút (15-25 oC) Q trình ly giải xảy hoàn toàn 10 phút Nếu để thời gian lâu khơng tăng hiệu ly trích Ly tâm nhẹ để loại bỏ bọt khí Thêm vào 560µl ethanol (96-100%), vortex 15 giây, ly tâm nhẹ để loại bỏ bọt khí Để tăng hiệu gắn kết nên mix thành hỗn hợp đồng Nếu thể tích mẫu lớn 140 µl phải tăng lượng ethanol tương ứng theo tỷ lệ Hút 630µl dung dịch vào spin column có gắn collection tube (2ml) Đóng nắp ly tâm 6000 x g (8000rpm) 1phút Bỏ collection tube cũ thay collection tube (Có thể loại bỏ nước sử dụng lại tube cũ) Nếu thấy dung dịch chưa xuống hết nên ly tâm thêm để dung dịch xuống hết Lập lại bước hết dung dịch bước Thêm vào 500 µl Buffer AW1 Đóng nắp ly tâm phút Bỏ collection tube cũ thay collection tube Nếu mẫu >140 µl khơng cần thiết gia tăng lương buffer AW1 Thêm vào 500 µl Buffer AW2 Đóng nắp ly tâm phút Có thể thực bước 11 hay để loại trừ hết buffer AW2 thực bước 10 tiếp tục bước 11 Thành phần buffer AW2 ảnh hưởng đến ứng dụng sau 10 Đề nghị: Bỏ colletion tube cũ, đặt spin column vào collection tube ly tâm phút 11 Bỏ colletion tube Đặt spin column vào tube 1.5 12 Thêm vào 60 µl Buffer AVE Đóng nắp để nhiệt độ phòng 1phút Ly tâm phút Hòa tan RNA x 40 µl Buffer AVE tăng 10 % thể tích Nếu hịa tan 30 µl làm giảm lượng thể tích RNA thu khơng làm tăng nồng độ RNA 13 Bảo quản RNA năm -20 oC hay -70oC Các bảng số liệu thống kê Bảng Bảng kết so sánh độ nhạy phương pháp RT-PCR nested RT-PCR để phát virus PRRS dòng Châu Mỹ huyết Phương Bậc pha lỗng pháp Kí hiệu mẫu 100 10-1 10-2 10 -3 10-4 10-5 10 -6 10-7 10-8 + + + + - - - - - + + + + - - - - - 22 + + + + + - - - - T3 + + + + + + - - - T4 + + + + + - - - - T5 + + + + + - - - - + + + + + + + + + + + + + + + + + - Nested 22 + + + + + + + + + RT-PCR T3 + + + + + + + + + T4 + + + + + + + - - T5 + + + + + + + - - RT-PCR + dương tính; - âm tính Bảng Kết phát RNA virus PRRS phương pháp RT-PCR nested RT-PCR Kết RT-PCR Nested RT-PCR Tổng Dương tính 12 18 30 Âm tính 10 Tồng 20 20 40 Dữ liệu thống kê bảng Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1) -Chi-square D.F Significance -4.80000 0.0284597 3.33333 0.0678892 with Yates correction With rows With columns Statistic Symmetric dependent dependent -Lambda 0.20000 0.00000 0.30000 Uncertainty Coeff 0.10082 0.11254 0.09131 Somer's D -0.34286 -0.30000 -0.40000 ... pháp cho nhạy so với phương pháp RT-PCR truyền thống chưa thực Việt Nam việc phát virus PRRS heo Do đó, đề tài: ? ?Ứng dụng phương pháp nested RT-PCR để phát virus gây hội chứng rối loạn sinh sản. .. Đề tài : ? ?Ứng dụng phương pháp nested RT – PCR để phát virus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp (PRRSV) heo? ?? thực từ ngày 16/2/2009 đến ngày 16/7/2009, Viện Nghiên Cứu Công nghệ Sinh Học Môi... DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP NESTED RT-PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ