BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS Lê Thị Thủy Tiên Giới thiệu 2 Tổng quan tài liệu 2.1 2.1.1 Nhân giống in vitro 2.1.2 Nuôi cấy mô sẹo 13 2.2 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào Đối tượng thực vật nghiên cứu 15 2.2.1 Hoa cát tường 15 2.2.2 Cây đậu xanh 18 Vật liệu phương pháp 19 3.1 Vật liệu .19 3.2 Phương pháp tiến hành 19 3.2.1 Pha môi trường nuôi cấy 19 3.2.2 thân Kỹ thuật nhân giống in vitro hoa cát tường phường pháp cấy cụm chồi/cắt đốt 26 3.2.3 Kỹ thuật gieo hạt đậu xanh in vitro 28 3.2.4 Kỹ thuật tạo mô sẹo từ mầm đậu xanh 29 3.2.5 Kỹ thuật giải phẫu nhuộm màu, quan sát kính hiển vi 31 Kết .32 4.1 Nhân giống in vitro hoa cát tường 32 4.2 Gieo hạt đậu xanh in vitro 35 4.3 Tạo mô sẹo từ mầm đậu xanh 39 4.4 Giải phẫu nhuộm màu, quan sát kính hiển vi 40 Thảo luận 43 5.1 Lý giải kết thí nghiệm 43 5.2 Tại lại tạo sẹo? 44 5.3 Tại tạo cụm chồi? 44 5.4 Lưu ý 45 Kết luận 47 Tài liệu tham khảo 48 Cao Ngọc Tân - 61002880 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS Lê Thị Thủy Tiên Giới thiệu Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật kỹ thuật quan trọng công nghệ sinh học thực vật Những thành tựu mà nuôi cấy mô tế bào thực vật đạt chứng tỏ khả ứng dụng hiệu nhiều lĩnh vực, đặc biệt nhân nhanh bảo tồn loài thực vật quý Trong năm gần đây, nuôi cấy mô tế bào thực vật không ngừng phát triển đem lại hiệu thiết thực công tác chọn tạo nhân giống trồng Những thành tựu góp phần to lớn vào việc thúc đẩy phát triển nông nghiệp công nghệ cao manh tính cạnh tranh thị trường quốc tế Tổng quan tài liệu 2.1 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào 2.1.1 Nhân giống in vitro  Nhân giống vô tính trồng in vitro hay vi nhân giống (Micropropagation) lĩnh vực ứng dụng có hiệu trông công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật Bao gồm:  Nuôi cấy trưởng thành  Nuôi cấy quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ tinh  Nuôi cấy phôi: phôi non phôi trưởng thành  Nuôi cấy mô sẹo (callus)  Nuôi cấy tế bào đơn  Nuôi cấy protoplast: nuôi cấy phần bên trông tế bào thực vật sâu tách vỏ gọi nuôi cấy tế bào trần  Đây phương pháp nhân giống đại thực phòng thí nghiệm nên gọi phương pháp nhân giống ống nghiệm (in vitro) để phân biệt với trình nuôi cấy điều kiện tự nhiên ống nghiệm Cao Ngọc Tân - 61002880 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS Lê Thị Thủy Tiên (in vivo) Khác vối phương pháp nhân giống truyền thống giâm, chiết cành ghép mắt, phương pháp nhân giống in vitro có khả thời gian ngắn tạo số lượng lớn để phủ kín diện tích đất định mà phương pháp nhân giống khác thay Ngoài phương pháp không phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên nên tiến hành quanh năm Đây hướng ứng dụng rộng rãi Ở Việt Nam có nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô, nhiều trung tâm sản xuất giống trồng hàng năm cung cấp lượng đáng kể giống có chất lượng cao cho sản xuất chuối, dứa, khoai tây, loại lan, cảnh, lâm nghiệp  Cơ sở khoa học: Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào (tissue culture) nói chung kỹ thuật nhân giống vô tính nói riêng dựa vào sở khoa học tính toàn năng, phân hoá phản phân hoá  Tính toàn tế bào: Haberland (1902) lần quan niệm tế bào thể sinh vật đa bào có khả tiềm tàng để phát triển thành thể hoàn chỉnh Theo quan điểm sinh học đại tế bào chuyên hoá chứa lượng thông tin di truyền (bộ ADN) tương đương với lượng thông tin di truyền thể trưởng thành Vì vậy, điều kiện định tế bào phát triển thành thể hoàn chỉnh Đặc tính tế bào gọi tính toàn tế bào Qua người ta biến tế bào (hoặc mẩu mô) thành thể hoàn chỉnh nuôi cấy môi trường thích hợp có đầy đủ điều kiện cần thiết cho tế bào thực trình phân hoá, phản phân hoá Cao Ngọc Tân - 61002880 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS Lê Thị Thủy Tiên  Tính phân hoá phản phân hoá tế bào: - Tính phân hoá tế bào biến đổi tế bào phôi sinh thành tế bào mô chuyên hoá đảm nhiệm chực khác Trong thể thực vật có khoảng 15 loại mô khác đảm nhiệm chức khác (mô dậu, mô dẫn, mô bì, mô khuyết…) chúng có nguồn gốc từ tế bào môi sinh trải qua giai đoạn phân hoá tế bào để hình thành mô riêng biệt - Tính phản phân hoá tế bào: dó tế bào phân hoá thành mô riêng biệt với chức khác điều kiện định chúng quay trở trạng thái phôi sinh để phân chia tế bào Trong kỹ thuật nuôi cấy quan dinh dưỡng lá, thân…thì giai đoạn tạo mô sẹo tế bào quay trở trạng thái phôi sinh có khả phân chia liên tục mà hẳn chức quan dinh dưỡng lá, thân… trước Sự phân hoá phản phân hoá tế bào phôi sinh tế bào chuyên hoá biểu diễn theo sơ đồ sau: → ← Về chất phân hoá phản phân hoá trình hoạt hoá gen, thời điểm trình phát triển thể số gen hoạt hoá số gen khác bị ức chế Điều xảy theo chương trình mã hoá cấu trúc phân tử ADN Khi nằm thể hoàn chỉnh tế bào có ức chế lẫn nhau, tách rời điều kiện định gen hoạt hoá dễ dàng nên chúng có khả mở tất gen để hình thành thể Đó sở làm tảng cho kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào Cao Ngọc Tân - 61002880 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS Lê Thị Thủy Tiên  Các ứng dụng: Đây lĩnh vực mà nuôi cấy mô tế bào thực vật mang lại hiệu kinh tế to lớn thực Một ưu việt phương pháp nhân giống in vitro việc sử dụng mô nuôi cấy kích thước nhỏ Ở kích thước nhỏ, tương tác tế bào mô đơn giản Tác động phương pháp hiệu Mô nuôi cáy dễ phân hoá sau dễ tái sinh Kỹ thuật nhân nhanh in vitro có ưu việt mà phương pháp khác là: nhân giống trồng quy mô công nghiệp (kể đối tượng khó nhân phương pháp thông thường), phương pháp có hệ số nhân cao cho cá thể hoàn toàn đồng mặt di truyền Ứng dụng:  Duy trì nhân nhanh kiểu gen quý làm vật liệu cho công tác chọn tạo giống  Nhân nhanh trì cá thể đầu dòng tốt để cung cấp giống loại trống khác - Nhân nhanh loài hoa, cảnh khó trồng hạt - Duy trì nhân nhanh dòng bố mẹ dòng lai để tạo hạt giống rau, hoa loại trồng khác - Nhân nhanh kết hợp với làm virus - Bảo quản tạp đoàn gen, đặc biệt với loại dễ bị nhiếm bệnh điều kiện tự nhiên, dễ bị giao phấn Với phương pháp nhiều giống hoa (hoa lan, cẩm chướng, đồng tiền, cúc…), lương thực thực phẩm (khoai tây, súp lơ, măng tây, cọ dầu, mía, cà phê…), ăn (chuối, dứa, dâu tây…), lâm nghiệp (bạch đàn, keo lai, dứa sợi…) phổ biến nhanh vào sản xuất Cao Ngọc Tân - 61002880 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS Lê Thị Thủy Tiên  Các bước nhân giống in vitro:  Bước 1: Chọn lọc chuẩn bị mẹ Trược tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy) Các cần bệnh, đặc biệt bệnh virus giai đoạn sinh trưởng mạnh Việc trồng mẹ điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc phòng trừ sâu bệnh hiệu truớc lấy mẫu làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả sống sinh trưởng mẫu cấy in vitro  Bước 2: Tạo vật liệu khởi đầu Là giai đoạn khử trùng mẫu vào nuôi cấy in vitro Giai đoạn cần đảm bảo yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn sinh trưởng tốt Kết giai đoạn phụ thuộc vào nhiều vào cách lấy mẫu, tuỳ thuộc vào mục đích khác nhau, loại khác để nuôi cấy phù hợp Khi lấy mẫu cần chọn mô, giai đoạn phát triển cây, quan trọng đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách sau đỉnh chồi hoa cuối đoạn thân, mảnh - Ví dụ: Vật liệu nuôi cấy thích hợp để nhân nhanh in vitro Măng tây: chồi (Kohter, 1975) Khoai tây: mầm (Morel, 1952) Dứa: chồi nách, chồi đỉnh (Paunethier, 1976) Bắp cải: mảnh (Bimomilo, 1975) Súp lơ: hoa tự (Kholer, 1978) Cần thiết phải khử trùng mẫu trước đưa vào nuôi cấy hoá chất khử trùng để loại bỏ vi sinh vật bám bề mặt mẫu cấy Chọn phương pháp khử trùng đưa lại tỷ lệ sống cao chọn môi trường dinh dưỡng thích hợp đạt tốc độ sinh trưởng nhanh Thường dùng chất: HgCl 0.1% Cao Ngọc Tân - 61002880 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS Lê Thị Thủy Tiên xử lý 5-10 phút, NaOCl Ca(OCl)2 5-7% xử lý 15-20 phút, H2O2, dung dịch Br… - Một số dạng môi trường dinh dưỡng phổ biến: Muối khoáng: theo White (1943), Heller (1953), Murashige Skoog (1962) Chất hữu cơ: đường sarcaroza Vitamin: B, B6, inositol, nicotin axit Hoocmon: auxin (IAA, IBA, NAA…), Xytokinin (BA, Kin, 2P…), Gibberelin (GA3)  Bước 3: nhân nhanh Mục đích cảu giai đoạn kích thích phát triển hình thái tăng nhanh số lượng chồi đơn vị mẫu cấy thời gian định thông qua đường: hoạt hoá chồi nách, tạo chồi bất định tạo phôi vô tính Vật liệu khởi đầu in vitro chuyển sang môi trường nhân nhanh có bổ sung chất điều tiết sinh trưởngnhóm xytokinin để tái sinh tù chồi thành nhiều chồi Hệ số nhân phụ thuộc vào số lượng chồi tạo ống nghiệm Vấn đề phải xác định môi trường điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu cao Chế độ nuôi cấy thường 25-270C 16 chiếu sáng/ngày, cường độ ánh sáng 2000-4000 lux, ánh sáng tím thành phần quan trọng để kích thích phân hoá chồi (Weiss Jaffe, 1969) Tuy nhiên với đối tượng nuôi cấy đòi hỏi chế độ nuôi cấy khác nhau: nhân nhanh súp lơ cần chu kỳ chiếu sáng giờ/ngày, nhân phong lan Phalenopsis giai đoạn đầu cần che tối…  Bước 4: Tạo in vitro hoàn chỉnh Kết thúc giai đoạn nhân nhanh có số lượng chồi lớn Cao Ngọc Tân - 61002880 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS Lê Thị Thủy Tiên chưa hình thành hoàn chỉnh chưa có rễ Vì vậy, cần chuyển từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ Tách chồi riêng cấy chuyển vào môi trường nuôi cấy có bổ sung chất điều tiết sinh trưởng nhóm auxin Mỗi chồi rễ thành hoàn chỉnh Một số loại phát sinh rễ sau chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu xytokinin sang môi trường không chứa chất điều tiết sinh trưởng Đối với phôi vô tính cần cấy chúng môi trường chất điều tiết sinh trưởng môi trường có chứa xytokinin nồng độ thấp phôi phát triển thành hoàn chỉnh  Bước 5: Thích ứng in vitro điều kiện tự nhiên Để đưa từ ống nghiệm vườn ươm với tỷ lệ sống cao, sinh trưởng tốt cần đảm bảo số yêu cầu: - Cây ống nghiệm đạt tiêu chuẩn hình thái định (số lá, số rễ, chiều cao cây…) - Cần có thời gian huấn luyện (từ 1-2 tuần tuỳ loại cây) để thích nghi với thay đổi nhiệt độ, độ ẩm, sâu bệnh cách đặt bình điều kiện tự nhiên, mở nắp bình nuôi… - Có giá thể tiếp nhận in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoat nước Phải chủ động điều chỉnh độ ẩm, chiếu sánh vườn ươm có chế độ dinh dưỡng thích hợp Cao Ngọc Tân - 61002880 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS Lê Thị Thủy Tiên  Ưu/nhược điểm:  Ưu điểm: - Phương pháp nhân giống in vitro có khả hình thành số lượng giống từ mô, quan với kích thước nhỏ khoảng 0.1-10mm Trong phương pháp nhân giống truyền thống để tạo thành giống, phải sử dụng phần quan dinh dưỡng với kích thước từ 5-20cm - Hoàn toàn tiến hành điều kiện vô trùng nên giống tạo đựoc không bị nhiễm bệnh từ môi trường bên - Sử dụng vật liệu virus có khả nhân nhanh số lượng giống virus - Hoàn toàn chủ động điều chỉnh tác nhân, điều chỉnh khả tái sinh thành phần dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, chất điều tiết sinh trưởng… theo ý muốn - Hệ số nhân giống cao nên sản xuất số lượng giống Cao Ngọc Tân - 61002880 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS Lê Thị Thủy Tiên thời gian ngắn Hệ số nhân giống loại nằm khoảng 36 1012 /năm, kỹ thuật nhân giống vô tính khác lại có hệ số nhân giống cao - Có thể tiến hành quanh năm mà không chịu chi phối điều kiện ngoại cảnh thời vụ - Cây giống in vitro chưa có nhu cầu sử dụng bảo quản thời gian dài điều kiện in vitro  Nhược điểm: - Mặc dù có hệ số nhân giống lớn giống tạo cí kích thước nhỏ xuất dạng không mong muốn - Cây giống in vitro cung cấp nguồn hydrat cacbon nhân tạo nên khả tự tổng hợp hợp chất hữu Đồng thời giống in vitro nuôi dưỡng bình thuỷ tinh bình nhựa nên đọ ẩm không khí thường bão hoà Do trồng điều kiện tự nhiên thường bi cân nước, gây tượng bị héo chết Vì trước chuyển từ điều kiện in vitro điều kiện in vivo cần phải trải qua giai đoạn huấn luyện để quen dần với điều kiện bên có độ ẩm không khí thấp ánh sáng mạnh - Cần trang thiết bị đại, kỹ thuật viên có tay nghề cao - Những vấn đề tồn vi nhân giống  Tính bất định mặt di truyền  Sự nhiễm mẫu  Việc sản sinh hợp chất độc từ mô nuôi cấy  Hiện tượng thuỷ tinh hoá Cao Ngọc Tân - 61002880 10 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS Lê Thị Thủy Tiên Kết tạo cụm chồi sau tuần Chiều Chai Số cao chồi Chiều cao chồi (cm) mẫu chồi trung bình 32 1 0.7 Đánh giá sinh trưởng 1.2 1.5 0.6 0.5 0.8 0.8 1.1 0.4 0.9 1.1 1.1 1.2 0.7 0.4 0.9 1.3 0.6 1.2 0.8 0.6 1.1 0.5 0.9 0.9 1.2 0.91cm ++++ 0.75cm ++++ 1.26cm +++ 0.92cm + 1.10cm ++ 0.8 1.2 1.1 0.7 0.6 0.5 0.6 0.5 28 0.8 12 Cao Ngọc Tân - 61002880 0.6 0.6 0.5 0.6 0.7 0.6 0.7 0.8 0.9 0.7 0.5 0.7 0.8 0.6 1.1 0.7 - - - - 1.2 1.5 0.9 1.6 0.8 1.1 1.8 0.7 0.9 1.2 1.4 - - - - 0.8 1.3 0.5 0.9 1 - - 1.6 0.9 0.7 1.1 1.1 - - - - - 0.6 0.9 - - 34 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS Lê Thị Thủy Tiên  Nhận xét: - Cây, chồi phát triển khỏe mạnh - Kích thước tương đối (cấy đốt thân, chai 3,4,5) nhỏ (cấy cụm chồi, chai 1,2) - Chưa thấy xuất rễ - Lượng thạch môi trường giảm phần so với ban đầu 4.2 Gieo hạt đậu xanh in vitro Hạt đậu xanh sau ngày gieo Cao Ngọc Tân - 61002880 35 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS Lê Thị Thủy Tiên Đánh giá chung (sau tuần) - Số chai: - Số mẫu: gieo hạt/chai - Tỉ lệ nảy mầm: 100% - Tỉ lệ tăng trưởng, phát triển: 100% - Tỉ lệ vô trùng: 100% - Cây mầm phát triển tốt - Nhiều vươn thân lên tận nút cong thân lại không đủ chỗ - Thạch cạn phần - Cây phát triển khỏe mạnh Kết gieo hạt đậu xanh Sau ngày Chai mẫu Tỉ lệ nảy Tỉ lệ tạo Sau ngày Tỉ lệ nảy Tỉ lệ tạo Tỉ lệ nảy Tỉ lệ tạo mầm 3/3 0/3 3/3 1/3 3/3 3/3 3/3 0/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 0/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 0/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 0/3 3/3 2/3 3/3 3/3 Cao Ngọc Tân - 61002880 mầm Sau tuần mầm 36 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS Lê Thị Thủy Tiên Chai mẫu Hạt nảy Chiều cao mầm đậu xanh mầm - (cm) Cây Cây Cây Đánh giá sinh trưởng Kết sau ngày gieo 3-0 0 + 3–0 0 + 3–0 0 + 3–0 0 + 3-0 0 + Kết sau ngày gieo 3-1 0.5 ++ 3-3 ++++ 3-3 4.5 ++++ 3-3 6.5 5.5 4.5 ++++ 3-2 0.5 +++ Kết sau tuần gieo 3-3 6.5 ++++ 3-3 8 +++++ 3-3 7.5 8 +++++ 3-3 8.5 8.5 +++++ 3-3 9 +++++ Cao Ngọc Tân - 61002880 37 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS Lê Thị Thủy Tiên  Nhận xét:  Sau ngày: - 100% hạt nảy mầm vài hạt chưa phát triển thành - Lá: số có lá, lú khoảng ½ Lá màu xanh đậm, khép không xòe rộng - Lá mầm: xanh nhạt, teo lại, chiều dài rộng tương ứng khoảng 0.3 0.6cm - Thân:  Một số vươn cao có số mầm, chưa phát triển thân  Cây chưa hình thành rõ trụ thượng diệp - Rễ: bắt đầu hình thành phát triển  Sau tuần: - Sau tuần 100% số hạt gieo phát triển thành - Lá: phát triển đầy đủ, khép mà không xòe Lá màu xanh đậm - Lá mầm: màu chiều dài tương đương lúc ngày, teo nhiều - Thân:  Thân có tiết diện ngang tròn đều, Đường kính - mm  Thân phân hóa rõ rệt trụ hạ diệp trụ thượng diệp  Thân có màu đậm dần từ rễ đến  Thân mẫu vươn cao - Rễ: lan khắp phần thạch đáy chai Cao Ngọc Tân - 61002880 38 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS Lê Thị Thủy Tiên 4.3 Tạo mô sẹo từ mầm đậu xanh Mô sẹo sau tuần nuôi cấy Đánh giá chung - Mẫu từ rế không tạo sẹo - Các mẫu khác có tạo sẹo, trụ thượng diệp tạo sẹo mạnh - Tỉ lệ vô trùng: 100% - Sẹo phát triển tương đối, không to - Tạo sẹo đầu cắt mẫu (dấu hiệu phình to) - Cao Ngọc Tân - 61002880 Các mẫu tạo sẹo nhỏ 39 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS Lê Thị Thủy Tiên Kết tạo sẹo từ mầm đậu xanh Mẫu Tỉ lệ tạo sẹo Đánh giá sinh trưởng Lá 4/5 ++++ Trụ thượng diệp 5/5 +++++ Trụ hạ diệp 5/5 +++++ Rễ 1/5 +  Nhận xét: - Mẫu có dấu hiệu co lại - Mẫu trụ thượng diệp cong hướng lên Xuất mô trắng phớt xanh nhạt đầu, dài khoảng 7- mm - Mẫu trụ hạ diệp xuất mô vàng bọc đầu mẫu bám phần mẫu - Phần phình nhiệt độ máu mô trắng bao bọc - Chỗ tạo sẹo có màu sẫm 4.4 Giải phẫu nhuộm màu, quan sát kính hiển vi  Cơ sở khoa học  Màu sắc tế bào - Màu hồng: mô sống - Màu xanh tím: tế bào chết ( mô mộc )  Nội dung tế bào - Tế bào trụ hạ diệp mầm có tế bào mềm, xếp đặn nên lát cắt mỏng, tẩy nội dung dễ dàng → phần bên màng tế bào - Các tế bào mô sẹo chứa nội dung ( có phần đục) , lát cắt mô sẹo dày hơn, khó cắt- tế bào xếp không trật tự Cao Ngọc Tân - 61002880 40 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS Lê Thị Thủy Tiên  Quan sát lát cắt ngang vuông góc với tiết diện trụ hạ diệp mầm đậu xanh (cây giá) Vật kính x4 Trụ hạ diệp mầm đậu xanh  Nhận xét: - Hình mờ - Có lớp tế bào biểu bì bao bên - Các tế bào xếp ngắn, đặn xung quanh vòng trụ trung tâm - Phần nhu mô: tế bào mềm - Phần trụ trung tâm: bó mạch xếp theo cụm (mô mộc libe), đều, đối xứng - Thường gồm bó mạch bó mạch nhỏ rải rác - Do thao tác chưa xác nên phần mép bị gấp nếp nhiều lớp, tạo nên màu sẫm Cao Ngọc Tân - 61002880 41 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS Lê Thị Thủy Tiên  Quan sát mô sẹo trụ hạ diệp lấy từ mẫu cấy Vật kính x10 Mô sẹo từ trụ hạ diệp  Nhận xét: - Mẫu sót hạt nhỏ màu đen, tế bào chất rửa chưa hết - Mô sẹo xuất phát từ nhu mô phát triển phía - Hình dáng số tế bào không giống - Hình thái tế bào mô bình thường mô sẹo có khác rõ rệt - Mô sẹo phát triển không đồng đều, có tế bào lớn hơn, có tế bào nhỏ tế bào bình thường - Các tế bào phát triển dày đặc chen chúc - Các tế bào xếp lộn xộn, trật tự Một số tế bào dính Đa số mô sẹo bở Cao Ngọc Tân - 61002880 42 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS Lê Thị Thủy Tiên Thảo luận 5.1 Lý giải kết thí nghiệm  Nhân giống in vitro hoa cát tường - Các mẫu cấy phát triển không giống thao tác cấy, diện tích vết cắt thân, lớn hay nhỏ, cấy cụm chồi hay cấy đốt thân,…nên kết tạo chồi khác - Các mẫu phát triển tương đối chậm chưa hình thành rễ, hút chất dinh dưỡng từ môi trường nuôi qua vết cắt thân - Thạch có tượng nứt sau thời gian nuôi cấy môi trường khô, lớn dần hút chất dinh dưỡng từ thạch không đồng  Gieo hạt đậu xanh - Có nước bám thành chai trình trao đổi chất - Giống tốt → nảy mầm hoàn toàn - Các hạt phát triển không nhau: chất lượng khác hạt, vị trí đặt hạt vào môi trường (chiều, độ chìm hạt môi trường, lượng môi trường điểm đặt hạt,…) - Sau ngày, thân mầm có màu xanh, không trắng mầm bán thị trường: mẫu nuôi điều kiện phòng mát chiếu sáng đầy đủ, nên hình thành lục lạp, tạo màu xanh cho mầm (cây mầm giá thị trường nuôi trồng điều kiện thiếu sáng nên màu xanh)  Tạo mô sẹo từ mầm đậu xanh - Mẫu rễ không tạo sẹo: sinh viên cấy mẫu rễ nhỏ, dấu hiệu xuất mô sẹo - Dưới tác dụng 2,4-D khả tạo sẹo quan khác khác - Đa số mẫu trụ thượng diệp có di động: mảnh thân có xu Cao Ngọc Tân - 61002880 43 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS Lê Thị Thủy Tiên hướng dựng đứng lên (hướng sáng) - Chỉ tạo sẹo đầu mẫu, nơi vết cắt: vết cắt, mẫu hút chất dinh dưỡng từ môi trường tạo sẹo (do tác dụng 2,4-D)  Giải phẫu nhuộm màu mẫu Quan sát kính hiển vi - Chỉ quan sát khung tế bào, dùng acid acetic để giết tế bào đẩy tế bào chất khỏi tế bào rửa nước cất - Dùng Javel chứa vài giọt Tween20 để tẩy tối đa mẫu cần quan sát - Mô sẹo chứa tế bào có hình dạng kích thước khác không theo trật tự Do chúng phân chia cách vô trật tự (do tác dụng 2,4-D) 5.2 Tại lại tạo sẹo? - Mô sẹo hình thành thí nghiệm tác động chất điều hòa sinh trưởng thực vật ngoại sinh (auxin) - Vai trò chất điều hòa sinh trưởng thực vật ngoại sinh Auxin:  Kích thích phản phân hóa TB  Loại nồng độ thay đổi tùy vào vật liệu nuôi cấy  Đa số mẫu cấy TV (nhóm song tử diệp cần phối hợp auxin cytokinin)  Nồng độ auxin cao kích thích tạo mô sẹo bỡ  Giảm độ auxin xuống mô sẹo có dạng nốt 5.3 Tại tạo cụm chồi? - Cụm chồi hình thành thí nghiệm dô tác động chất điều hòa sinh trưởng thực vật Cytokinin - Vai trò Cytokinin:  Điều khiển phát sinh hình thái Cao Ngọc Tân - 61002880 44 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS Lê Thị Thủy Tiên  Phá vỡ trạng thái hưu miên chồi  Kích thích hoạt động chồi bên  Giúp cho tăng sinh chồi bên  Ảnh hưởng tạo phôi (với auxin)  Cản tạo rễ  Các loại cytokinin thường sử dụng: (2 – iP (IPA), Dihydrozyatin, Kinetin & BAP (BA) – thường sử dụng, TDZ)  Cần cho tăng trưởng bình thưởng phôi soma  Kìm hãm phát sinh phôi soma số trường hợp 5.4 Lưu ý  Pha môi trường nuôi cấy: - Cần pha với hàm lượng xác, phù hợp với điều kiện sinh trưởng - Đặc biệt chất điều hòa sinh trưởng, sai khác nhỏ ảnh hưởng lớn lên  Nhân giống hóa Cát Tường - Sử dụng chất kích thích sinh trưởng BA để kích thích mọc chồi - Khi cấy cần ý đến vết cắt, yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hấp thu chất dinh dưỡng mẫu cấy Vết cắt lớn, mẫu hút chất dinh dưỡng mạnh - Cấy cụm chồi cho kết rõ rệt cấy đốt thân - Khi cấy cụm chồi cần ý cắt bỏ phần gốc đen mẫu trước cấy vào môi trường  Gieo hạt đậu xanh - Khi cấy cần lưu ý thao tác nhẹ nhàng, tránh làm tổn thương hạt → ảnh hưởng đến hiệu nảy mầm Cao Ngọc Tân - 61002880 45 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS Lê Thị Thủy Tiên - Các phát triển tốt khỏe mạnh chứng tỏ hạt giống tốt điều kiện nuôi cấy thuận lợi - Lưu ý không nhấn chìm hoàn toàn hạt vào môi trường ( hạt không trao đổi khí được) hay đặt nằm hẳn môi trường ( hạt khó hấp thu dinh dưỡng) - Tránh không rửa hạt lâu Rửa hạt xong đem cấy ngay, tránh tình trạng rửa xong không cấy mà để để hạt trạng thái ướt thời gian, làm hạt bị trương nước  Tạo mô sẹo từ mầm đậu xanh - Cần cho xác lượng CĐHSTTV 2,4-D, sai khác lượng nhỏ có ảnh hưởng đến trình tạo sẹo mẫu - Môi trường khô làm mẫu hóa nâu - Thao tác cần nhanh chóng xác Tránh cắt sẵn hết mẫu đặt petri lâu cấy vào môi trường → tỉ lệ nhiễm cao - Đối với mẫu rễ, vừa cắt mẫu từ xong cấy vào môi trường để rễ khỏi bị nước → ảnh hưởng đến chất lượng mẫu  Giải phẫu nhuộm màu mẫu Quan sát kính hiển vi - Khi thao tác, đặt dao lam vuông góc với mẫu cây, cắt thật nhanh thẳng nhiều mẫu Từ mẫu ta chọn vài mẫu đạt yêu cầu - Cắt xong phải đặt mẫu vào mặt kính đồng hồ có chưa nước cất để mẫu không bị nước - Khi rửa Javel hay Acid Acetic phải tuần thủ thời gian, không lâu hay nhanh Khi rửa lại nước cất rửa kỹ ( để rửa trôi hết tế bào chất) Cao Ngọc Tân - 61002880 46 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS Lê Thị Thủy Tiên Kết luận Môn học thí nghiệm công nghệ tế bào mục đích giúp sinh viên nắm rõ phần lý thuyết, tiền đề quan trọng để thực đề tài khoa học hay đồ án môn học luận văn tốt nghiệp sau Quá trình thực hành đem lạ nhiều học kinh nghiệm bổ ích cho sinh viên Qua thấy môn khoa học thực nghiệm, tất thao tác tiến hành thí nghiệm phải thực xác khéo để đạt kết tốt nhất, phục vụ trình nghiên cứu Cô tận tình hướng dẫn, truyền dạy cho chúng em kiến thức kinh nghiệm quý báu suốt trình học Nhờ chúng em có thêm nhiều kiến thức kỹ cần thiết cho môn học trình nghiên cứu khoa học sau Nhờ buổi học bổ ích không khí thoải mái cô tạo cho sinh viên mà chúng em thêm yêu thích ngành học theo đuổi Em xin chân thành cảm ơn cô! Cao Ngọc Tân - 61002880 47 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS Lê Thị Thủy Tiên Tài liệu tham khảo [1] Nguyễn Đức Lượng Lê Thị Thủy Tiên (2006) Công nghệ tế bào Nhà xuất Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh, 376 trang [2] Nguyễn Hoàng Lộc (2007).Giáo trình Nhập môn công nghệ sinh học Nhà xuất Đại học Huế [3]Bùi Trang Việt, Nguyễn Thị Ngọc Lang, Nguyễn Du Sanh, Võ Thị Bạch Mai (1997) Giáo trình thực tập sinh lý thực vật ĐH KHTN TPHCM [4] Hoàng Thị Thao (2010).Nghiên cứu quan hệ di truyền số giống đậu xanh [Vigna radiata (L.) Wilczek] Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học Đại học Thái Nguyên-Trường Đại học Khoa học 71 trang [5] Agriviet.com Kỹ thuật trồng hoa cát tường [6] Dương Công Kiên (2002) Nuôi cấy mô thực vật T1, T2 NXB ĐHQG TPHCM [7] Trần Văn Minh (1999) Công nghệ sinh học thực vật (Giáo trình đại học) Viện Sinh học Nhiệt đới [8] Giáo trình Kỹ thuật nhân giống in vitro Đại học KHTN - ĐHQG TPHCM Cao Ngọc Tân - 61002880 48 [...]... 61002880 12 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS Lê Thị Thủy Tiên 2.1.2 Nuôi cấy mô sẹo Nuôi cấy mô sẹo là khâu rất quan trọng trong nuôi cấy mô tế bào Mô sẹo là nguyên liệu khởi đầu cho các nghiên cứu quan trọng khác như: phân hóa mô và tế bào, chọn dòng tế bào, nuôi cấy tế bào trần, nuôi cấy tế bào đơn, nuôi cấy phôi soma, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học…Mô sẹo là một khối tế bào. .. 61002880 32 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS Lê Thị Thủy Tiên Hoa cát tường sau 2 tuần nuôi cấy Đánh giá chung (sau 4 tuần) - Số chai: 5 - Số mẫu cấy: 1 mẫu/chai - Tỉ lệ sống sót, phát triển: 100% - Tỉ lệ mẫu cấy vô trùng: 100% - Các cây đều khỏe mạnh, phát triển bình thường - Có cây tăng trưởng nhiều, có cây tăng trưởng ít Cao Ngọc Tân - 61002880 33 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD:... 34 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS Lê Thị Thủy Tiên  Nhận xét: - Cây, chồi phát triển khỏe mạnh - Kích thước lá tương đối (cấy đốt thân, chai 3,4,5) và khá nhỏ (cấy cụm chồi, chai 1,2) - Chưa thấy xuất hiện rễ - Lượng thạch môi trường giảm một phần so với ban đầu 4.2 Gieo hạt đậu xanh in vitro Hạt đậu xanh sau 4 ngày gieo Cao Ngọc Tân - 61002880 35 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO... các thí nghiệm đã làm)  Lưu ý: - Có thể dùng tất cả các bộ phận của cây đậu xanh để tạo sẹo - Đặt các đoạn mẫu nằm ngang trên thạch cho diện tích tiếp xúc với môi trường bằng nhau Cao Ngọc Tân - 61002880 30 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS Lê Thị Thủy Tiên 3.2.5 Kỹ thuật giải phẫu và nhuộm màu, quan sát dưới kính hiển vi  Nguyên liệu - Cây giá (mầm đậu xanh) - Mô sẹo nuôi từ thí nghiệm. .. Javel vào, ngâm trong khoảng 10 phút Sau đó rửa mẫu bằng nước cất khoảng 3 - 4 lần, dùng ống bóp hút cẩn thận cho đến khi hết nước - Tẩy nội dung tế bào (chỉ quan sát khung tế bào) bằng acid acetic, ngâm Cao Ngọc Tân - 61002880 31 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS Lê Thị Thủy Tiên trong vòng 20 phút Sau đó cũng rửa nước cất 3 - 4 lần - Dùng giấy thấm hút hết nước trong mẫu - Nhuộm mẫu bằng thuốc... vàng, trắng, nâu hay trắng xanh…  Một số vấn đề quan tâm trong nuôi cấy mô sẹo: - Sự biến tính tế bào do độ già của mẫu - Sự thay đổi tế bào chất của nhân - Thời gian duy trì - Điều kiện nuôi cấy - Thành phần môi trường, nhất là chất sinh trưởng Cao Ngọc Tân - 61002880 13 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS Lê Thị Thủy Tiên  Sự hình thành chồi từ mô sẹo  Được điều khiển bằng: - Các chất... sẹo từ cây mầm đậu xanh Cây đậu xanh in-vitro được thu nhận trong thí nghiệm trên được sử dụng làm nguyên liệu cho thí nghiệm tạo mô sẹo  Dụng cụ và hóa chất: - Chai chứa môi trường tạo sẹo vô trùng - Đèn cồn, - Kẹp, kéo, dao - Petri - Mẫu cây đậu xanh - Bình cồn, khăn bông Cao Ngọc Tân - 61002880 29 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS Lê Thị Thủy Tiên  Các bước tiến hành: - Cây đậu xanh... đơn - Nhóm Flamenco: là nhóm thích hợp với cường độ ánh sáng cao và quang chu kỳ ngày dài Thân hoa dài và mạnh Các màu là xanh bóng, hồng, vàng, trắng - Nhóm Heidi: thích hợp với cường độ ánh sáng trung bình và quang chu kỳ ngày ngắn Có nhiều màu để chọn lựa Cao Ngọc Tân - 61002880 17 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS Lê Thị Thủy Tiên - Nhóm Laguna: là nhóm thích hợp với cường độ ánh sáng... về chất lượng, số lượng và năng suất và biến dị này không di truyền)  Tần số biến dị thì hoàn toàn khác nhau và không lặp lại  Nhân tố thường gây ra biến dị tế bào là số lần cấy chuyền Cao Ngọc Tân - 61002880 14 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS Lê Thị Thủy Tiên  So sánh vi nhân giống và nuôi cấy mô sẹo:  Vi nhân giống: tách đỉnh chồi hoặc mô phân sinh  khử trùng  đưa vào nuôi cấy ở... vụ thích hợp - Độ ẩm khoảng 70% được xem là lý tưởng nhưng sau khi nụ đầu tiên được hình thành thì việc giảm độ ẩm xuống dưới 70% sẽ làm gia tăng chất lượng của hoa - Tính cả thời gian từ lúc gieo hạt cho đến khi cây ra hoa là từ 20 –23 tuần Cao Ngọc Tân - 61002880 16 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS Lê Thị Thủy Tiên  Các chủng loại hoa Cát tường  Giống hoa kép - Nhóm Avilia: nhóm này thích ... rửa kỹ ( để rửa trôi hết tế bào chất) Cao Ngọc Tân - 61002880 46 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS Lê Thị Thủy Tiên Kết luận Môn học thí nghiệm công nghệ tế bào mục đích giúp sinh viên... Các tế bào xếp lộn xộn, trật tự Một số tế bào dính Đa số mô sẹo bở Cao Ngọc Tân - 61002880 42 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS Lê Thị Thủy Tiên Thảo luận 5.1 Lý giải kết thí nghiệm. .. cho tế bào thực trình phân hoá, phản phân hoá Cao Ngọc Tân - 61002880 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS Lê Thị Thủy Tiên  Tính phân hoá phản phân hoá tế bào: - Tính phân hoá tế bào