Enzyme giới hạn hệ thống hạn chế - cải biên (Restriction modification system) Vào năm 1962, lần Werner Arber chứng minh rằng: Có enzyme đặc biệt, hoạt động tế bào vi khuẩn, chúng có khả phân biệt DNA DNA lạ phage Các enzyme hạn chế khả sinh sản phage tế bào vi khuẩn cách phân hủy chúng cách đặc hiệu Vào năm 1970, Hamilton Smith phát vi khuẩn Haemophilus influenzae Rd enzyme giới hạn đặt tên cho HindII Với thí nghiệm tiếp theo, Arber cộng trường Đại học Geneva phát nhiều chủng vi khuẩn có khả phân huỷ DNA từ loài khác xâm nhập vào chúng nhờ kết hợp hai trình enzyme Hai trình enzyme thống hệ thống gọi hệ thống hạn chế - cải biến, nhằm phân hủy DNA lạ bảo vệ DNA - Sự hạn chế thực nhờ hoạt động enzyme cắt hạn chế (RE - Rectriction Enzyme) Đó endodesoxyribonuclease đặc biệt nhận biết trình tự nucleotide đặc hiệu chuỗi DNA sợi đôi cắt hai sợi DNA - Sự cải biến thay đổi DNA thân tế bào theo đường đặc biệt loài, khiến DNA khác với DNA loài khác chất enzyme cắt hạn chế Nhờ mà DNA tế bào chủ bảo vệ Sự cải biên thực nhờ enzyme metylase (mêtyl hoá) có tế bào vi khuẩn Enzyme metyl hoá cytosine vị trí (C5) adenine (trên N C6) thuộc vùng giới hạn (chuỗi đích) Ví dụ: Ở Enzyme Hind III, sau metyl hoá (dấu chấm) adeninee, chuỗi đích không nhận biết enzyme Hind III nữa, đó, DNA không bị cắt: Vậy enzyme hạn chế enzyme cải biên có đối tựơng nhận biết chuỗi nucleotide đặc hiệu DNA ngoại lai DNA tế bào chủ, nhằm hạn chế sinh sản DNA ngoại lai bảo vệ DNA Tuy nhiên, có số loại enzyme có hai chức hạn chế cải biên Ví dụ: Enzyme EcoRI với chuỗi đích là: Tính đặc hiệu vị trí enzim cắt giới hạn - RE - Rectriction Enzyme Rectriction Enzyme loại II bao gồm enzyme có trình tự nhận biết chuỗi nucleotide đặc hiệu Khi nhận biết trình tự đó, chúng cắt vị trí nhận biết 1- Trình tự nhận biết RE: Có thể nói RE công cụ thực thụ để cắt DNA Sự cắt xảy vùng đặc biệt nhận biết enzyme Mỗi enzyme nhận biết đoạn nucleotide khác đặc hiệu gọi trình tự nhận biết (chuỗi đích) hay đoạn đọc ngược xuôi Đặc trưng quan trọng trình tự nhận biết chúng có cấu trúc đối xứng nghịch đảo (palindromic), nghĩa hai mạch trình tự hoàn toàn giống chúng đọc theo chiều 5’ đến 3’ sợi đơn Các trình tự nhận biết enzyme giới hạn cấu tạo từ đến đôi bazơ Ví dụ đoạn DNA đóng khung sau: 2- Các kiểu cắt RE: Cắt đầu bằng: Một số RE tạo vết cắt phân tử DNA palindrom, tạo hai đoạn DNA đầu Sau cắt, hai đầu khả tự kết hợp trở lại Ví dụ: HpaI Cắt đầu dính (đầu lệch): Cắt bên bên tâm đối xứng để tạo hai đầu lệch vài bazơ Trong trường hợp này, đầu dính bổ sung bị bắt cặp trở lại Như vậy, DNA khác nguồn có chứa trình tự nhận biết đặc hiệu RE, sau bị cắt có đầu dính bổ sung giống nên đoạn DNA khác nguồn nối lại để tạo phân tử lai Đây sở phương pháp tạo dòng gen, phương pháp thúc đẩy phát triển công nghệ di truyền Ví dụ: EcoRI 3- Số lượng đoạn cắt: Một RE có khả thao tác toàn chiều dài phân tử DNA Số lượng đoạn cắt phụ thuộc vào số chuỗi đích RE có phân tử DNA mà thao tác Sử dụng RE khác nhau, bị cắt khác tạo lượng đoạn cắt khác Ví dụ: EcoRI Nếu chuỗi có lần phân tử DNA enzyme EcoRI cắt điểm phân tử DNA đó: - Ta đoạn DNA dạng vòng - Ta đoạn DNA dạng thẳng 4- Kích thước đoạn cắt: Vì vùng giới hạn phân bố cách ngẫu nhiên dọc theo phân tử DNA mà tạo thành cách tổ hợp loại bazơ nitơ (A,T,C,G) nên kích thước đoạn cắt phụ thuộc số cặp bazơ chuỗi đích Nếu vùng nhận biết (chuỗi đích) enzyme cặp bazơ sinh đoạn có kích thước trung bình 46 = 4.096 bazơ ≈ 4,1kb Nếu vùng nhận biết enzyme cặp bazơ sinh mảnh có kích thước 44 = 256 bazơ ≈ 0,26kb Tuy nhiên số RE nhận biết vùng gặp DNA Ví dụ NotI có chuỗi đích (GC\GGCCGC), cắt cho mảnh có kích thước khoảng 1.000kb PvuI có chuỗi đích (CGAT\CG) cho mảnh khoảng 300kb  ... adeninee, chuỗi đích không nhận biết enzyme Hind III nữa, đ , DNA không bị cắt: Vậy enzyme hạn chế enzyme cải biên có đối tựơng nhận biết chuỗi nucleotide đặc hiệu DNA ngoại lai DNA tế bào ch , nhằm... ch , nhằm hạn chế sinh sản DNA ngoại lai bảo vệ DNA Tuy nhiên, có số loại enzyme có hai chức hạn chế cải biên Ví dụ: Enzyme EcoRI với chuỗi đích là: Tính đặc hiệu vị trí enzim cắt giới hạn - RE...Sự cải biên thực nhờ enzyme metylase (mêtyl hoá) có tế bào vi khuẩn Enzyme metyl hoá cytosine vị trí (C5) adenine (trên N C6) thuộc vùng giới hạn (chuỗi đích) Ví dụ: Ở Enzyme Hind III, sau