Đang tải... (xem toàn văn)
Hiện đã biết trên 8000 chất kháng sinh và mỗi năm có khoảng vài trăm chất kháng sinh mới được phát hiện
Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm !"# $%$%&'()(*+ ,-+./,0 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH LƯỢNG DƯ THUỐC KHÁNG SINH TRONG THỰC PHẨM GVHD : TS. Vũ Ngọc Hòa Sinh Viên:Vũ Minh Triết 60902903 Bùi Thiên Duy 60900368 Trần Tấn Lộc 60901467 Trương Đờ Kháng 60901168 TP. HCM 12/2011 1 Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm 2 Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm Mục lục Mục lục hình ảnh Hình 1.1: Penicillin G Hình 1.2 Sơ đồ thể hiện cơ chế tác dụng của thuốc kháng sinh trên vi khuẩn Hình 1.3 Cấu trúc cơ bản của nhóm Quinolone Hình 1.4 Cân bằng Acid Base của nhóm Acidic Quinolone Hình 1.5 Cân bằng acid base của nhóm Piperazinyl Quinolone Hình 1.6 Công thức cấu tạo của Ciprofloxacin Hình 1.7 Công thức cấu tạo của Enrofloxacin Hình 1.8 Công thức phân tử chung của họ chloramphenicol Hình 1.9 Sơ đồ tổng hợp chloramphenicol từ acid shikimic Hình 1.10 Sản phẩm penicillin lên men tự nhiên nhờ P.chrysogenum Hình 2.1 Hệ thống LC-MS/MS Hình 2.4: Máy xay sinh tố Hình 2.5: Máy ly tâm Hình 2.6: Bình định mức các loại Hình 2.7: Pipet các loại Hình 2.8: Phễu chiết cỡ 250 ml Hình 2.9: Quy trình thực hiện Hình 2.10: Âm tính: Hai vạch Hình 2.11: Dương tính: Hai vạch Hình 2.12: Kết quả sai: khi vạch chuẩn không xuất hiện. Mục lục bảng số liệu Bảng 1.1: Danh mục chất kháng sinh cấm sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thủy sản 3 Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm Bảng 1.2 Yêu cầu của các thị trường về giới hạn phát hiện của phương pháp phân tích một số kháng sinh cấm Bảng 2.1 Tổng hợp kết quả phân tích sàng lọc CAP trên ELISA và khẳng định trên LC-MS/MS Bảng 2.2. Tương quan giữa nồng độ CAP xác định bằng ELISA và tỷ lệ dương giả Bảng 2.3 Kết quả phân tích kiểm tra đường chuẩn Đồ thị 2.4 Đường chuẩn Bảng 2.5. Khả năng phát hiện của phương pháp ở nồng độ giới hạn phát hiện và giới hạn nồng độ tối đa cho phép theo Quyết định 2377/90 CE của Uỷ ban Châu Âu đối với một số Quinolone Bảng 2.6. Các tham số độ mạnh của phương pháp đối với các quinolone được thử tại ngưỡng phát hiện tối thiểu Bảng 2.7: Chương trình pha động Lời nói đầu 4567"89 !7!:;575 ! <5=>7?@>A !7:B:CDE A"F67GHD7I;JC#;D:E5K"#7LJM !;@;JC; !575NO@7GHD7IPJ! !:BO>QRSSSD75ATUG5AUD7 6:C!VFWW=ED7XY7Z :CP5P:7I575GUAD7:B:CQ? 6@:E[5E\]@]75AFF7+EAQ?5ED 7^7ZED76:C!>PQ_5 75`9 !J@E7Za>>b D76A>5EOG:c]95757G7D 7:B:CO>d +A@@;D7:C7LJMBA !U ;c; c9@G7G;JMDF6FAe5 cI FO!f575@5@;D7JFg`e7 5 FO!;`;8FA75HD!G?M;5A:`O!FA FCD7cJ758G_:>DFC"#;DFA7? h]QJ4 iV j k FV k k b l l F m m : k 5b k ::V k Q k Q k V m ;7 n j n o :Q j 5Q k o m @VQ l j : l n j F o @pJb m Jb m JFV k b j n j n j U k 5 m j j 7 m Q j k : k 5b k l j F k 7 l b l m @V l U 7 j ;b m Q k @;V m Jb7 l J k b j m @Q k j F k j UU k 5 m j j 7U m U m ; k OQ k 5 m j 5b k U j FV j q Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm b k r l F m JFV k b j n j n j 5 m j j 7 k 7 j ;b m 5V k V o ] j b j Q m Fb m ;@ b@ k : k b j n j j V m ;7] o b@@ k 5Q m Fb J m 7 j l ] l V m QJ m I Tổng quan về chất kháng sinh 1.1 Định nghĩa 1.2 Khái niệm về chất kháng sinh [1] 7=:CFAM7FAXDGUQJ!5#@ PB7"895#:`!+JMFQ5#_D :bL;FA5Ksr95#@G?rP 895# ftantibioticstu7vcIfXtantibiosisttantitwFA tchống lạit5AtbiosistwFAtcuộc sốngtD7:;IF7IF 5#5@;D7FADFD@fV85755#; DI;`5A"5 131 Tác dụng của chất kháng sinh I7FAXD:IF7"7I95#;U5 #bFQO^:_?bL;`:5A@E: @8x>9:7I5#`:5A7"bO^Fy :D7OW:x5AGU1z2R4565!F ,]FF9O7w{F]HJ|F]|F]:B:`QD,]FFD 7A@DX!5!:EKO!5Q};;5QI;MY; :?;55\]@FAD7:CJ4:8:EKO!F} +A=XD7F;]@F;F@];55 :CJ4:8KXUO!5AF7DX!5!IF 7I575;5AFX!5!IF575_5F6:C FAD7}~1• Hình 1.1: Penicillin G TUA!O!bQ>6:CXKD7+U 1z3S;2S€:>R•€}7IL5_FAJO!F}+U1z‚S7IA@G HI=•€V";7IL5J7IVAb@:BGf1S€:>2€ O!@EƒY:g:ED7D7YXJM • Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm 5!UfXUO!ƒ4I;O!7Ib@:?6 HV5AO!Fb@r:PJM;55~1• 1.4 Cơ chế động của chất kháng sinh [3]. D7:C:5AV8;7Z>>5#b@O! 7J!4O^E„ • …>7"AF5>OA„+UG7"}CA9>OA54 ]FF;]F7;5@ • …>!5M9A>OA • …>7"@89547F†J]7;]; • …>7"}C]„…>7"}C]954 ]@F;F@7J]7;FJ]7u]@@pv; • …>7"}CJF]„…>7"}C5A:9J F]†FrF]75A† ‚ Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm Hình 1.2 Sơ đồ thể hiện cơ chế tác dụng của thuốc kháng sinh trên vi khuẩn ‡ Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm isJM5EV>95!?>7"}C]{F@7J]7„\]@ • ˆ1„IW5AM8Q8:V5K3S\ • ˆ2„,O>s9?C:xQrPAFT]J • ˆ3„ ‰+{OK:7à1J] 4C • ˆq„)A5gF@7]7A7]7 à ?U}C ] ]@F]7 • IW5A8:V5K3S\Š‰O8àU`J6W5AT ]J6:CAF • F]F • IW5A8:V5K•S\Š‰O8à?>]J@F7†]7]àU J6W5AT]J6AF 7":B O>AO?AD7>:C 5#xO!5A^D7U`H@ 6:C5#xO!Q5#A@>5P>H@5A ^;D7U`5# FD@:C?U‹4 ?:9D7>A:X;5ŒFAFIXs 7IF5#O^FAAxD9e F65hOG5!;A:}D55@Q;VJ!:EK;rb :>FJM„JMJ!#5AJMP#uP#=:C FAB#;M#;w#v7J!#JM>>5#; =7P#[FA5#8; 77G? OK QJ!7P#:CJ4V8O!=7?:E;!I ƒJK=:9:8QJ!5#:BOKIFA@>:+>V8O! r@>;OWOGJ4F7J!# 1.5 Phân loại thuốc kháng sinh [4]. • +•F]F„,]F;]F;{FF];{HFF]; FHFF];\FFF;,]FF];&]] • +•F]F7„ < >!1„]†JHF;]F]H;]†F;]ŽF < >!2„]†F < >!3„]†H];]†H];]†H];]†H];]†ŽJ];]†H]; ]†JH] • +]@F]„]@F];‹H@@F];F]@F;%H@]@F; @F;]H@F • +7J„{;O@;+]@;ˆ]@;@; \]@ • +FJ„{Ž@;‰H@;•@@;5@; F@;\@ • +F7J„)@;FJ@ • +rF„{JFJH;F]†FH;†FH;†FH;†FH; F]5†FH;ˆ†FH;H†FH;,]†FH;\†FH • +•<<JŽF„FŽF];]JŽF];JŽF];\]JŽF]; ŽF];JŽF] • +\F†J„\F†J;\F†]HŽF;\F†JŽ;\F†7FŽ R Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm 1.6 Sản xuất thuốc kháng sinh x>7:E:CFAf5#5AD • ,]FF:C7GHDfDI;575 • 75@fH#\]@]7]F7 • F]FO:x:CbFf\]@]75]]Ž]F];@:C 7GHDO^V}C • p 1.7 Mặt trái của thuốc kháng sinh i6EJMyw"ƒ>5@GU5!7LJMAE I77ZA:]FEJMs"• V8OKJI77LJM :eI`J FC7=cJ"#8:EKO!ƒ4xO>F5 4b@O!:87sCiP>8O>5A5P_7Fx;Q_ WVQ>6;DFA_6:8;:BJ47r E;G x>; :e[:K5A :e)JM` CFy;JŒ:>XrG F XsEIUJ7LJM EF7:WEA=FAEF76JxJxOK5 ! D7YXG?M;G?9V8:I56D 7‘?O:h5A!?8b@XUO! ,G?xDFAJŒ6L5 ;D7 X! :I567I5#xO! ,i!7b’>J"=,;‘:K7J DQxF6 b9@:C !:D6 ]AF!9 !"#;,; FC7cJ7e;x7Z@8]A77 b@??:x7LJM+H@Q7LJM7e;xƒ 77ZDJƒOK“”I;OKO!XKJFC7A@7ZsM V8b@Q!C5#s?567 F7A@ OKb•5AcF c•7GJA;>F5#s56 7>rGFAF5#b@O!•7GFGUI 7+>7:CFŒ5A?U •7G;8PD@JFC 7K•7G5A7G#>O>+XU•7G?JFC 77Z5 PDM75AV8;JŒ:>X@:} 5 #OP;>_QJƒOKƒ#V `O!5!FJMD77Zb@FI;JŒ:Q7"89 F5#GUIV8:5Y9@7G U e@+ )b,6:b@:B>AG7PP 7LJM7U 5AJFC7K_rx@J z Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm 7e;x7IU 7LJM7 CFyFEFC;7L JMFQM:8=fO!7e:>AO:C–a!ŒK :CFD@">CD@2‚F7:C!:F:C 7LJMEDFAF]Fu>1•;3•€v;@F7u1•€v;F7u13;2q€v; †FHu1S€v;]@uR;3•€v;]@Fu‡;z•€v;FFu‡;2q€v :;F]FFA7!:BOKD7LJMQErI~1q• 1qzŒKA:C8;bs:>qq;z‚€7IŒJ7 5Cr?r@:Kaf2;•:>11SSFx756Q#A:;F 7F]F>•F!D:>R‡;•S€;†F]r>R3;33€; F]@F]>‚2;•S€;HFF>‚S€~1q• ‹:xGO>:CVH:KJFCI"#:8 >:CXJM@fX"#?JFCI7rQ #a QD;7 ICJM 1 {7F75A>#fe ?U;Ie@; D;DHLFy ; D#@LL4;D OGrG;]O J@ DGb7GHD I; c:" 5J665AFg; JK5ME5AOGrG; >O> 2 F]F 3 F† q FŽ] • F] ‚ ‹7] ‡ ‹]JŽF] R ]JŽF] z +†uOcG|ŽFJ]v 1S ‰JŽF] 11 ˆ]]F]u–F]v 12 &JŽF] 13 +JŽF] 1q F]O]F 1• ‹]@F7FO]7Fu‹•\v 1‚ ˆF@]J]7 1‡ F†u‹]]Hv 1R ˆ]iF]u@7F5F]v 1z +|FrF]7uD7LJM7GHD; J•7GHD#5AK5AWv Bảng 1.1: Danh mục chất kháng sinh cấm sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thủy sản [11] TT Kháng sinh cấm Chỉ tiêu kiểm tra Giới hạn phát hiện tối thiểu EU Mỹ Nhật 1S [...]... cho rằng ở S.venezuelae, trong sơ đồ tổng hợp các acid amin vòng có đường rẽ nhánh sinh tổng hợp chloramphenicol tại vị trí acid shikimic 16 Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm 17 Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm HN CH O=C HC-OH CHCl2 NO2 CH2OH 18 Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm O=C Hình 1.9 Sơ đồ tổng... với viêm thận kẽ Được sử dụng đúng, các penicillin là những thuốc cực kỳ an toàn và hiệu quả II Các phương pháp xác định hàm lượng chất kháng sinh trong thực phẩm 2.1 Dư lượng Chloramphenicol trong thủy sản bằng kít elisa thông qua phân tích khẳng định bằng LC – MS/MS [5] 2.1.1 Giới thiệu 21 Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm Các phương pháp phân tích sử dụng sắc ký có... cụ, thiết bị và hoá chất Dụng cụ, thiết bị 26 Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm Hình 2.2 Máy trắc quang UV-VIS Hình 2.4: Máy xay sinh tố Hình 2.6: Bình định mức các loại Hình 2.3: Cuvét thủy tinh có chiều dày 2 cm Hình 2.5: Máy ly tâm Hình 2.7: Pipet các loại 27 Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm Hình 2.8: Phễu chiết cỡ 250 ml Và một số... ciprofloxacin được phát hiện với độ xác thực, độ nhạy thấp nhất và tương ứng là 97,5 % và 95 % Bảng 2.6 Các tham số độ mạnh của phương pháp đối với các quinolone được thử tại ngưỡng phát hiện tối thiểu 33 Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm Đặc biệt, phương pháp có khả năng phát hiện các quinolone trong tôm với độ đặc hiệu là 100% Hay nói cách khác nếu mẫu thực sự âm tính thì 100%... giải diễn ra qua trung gian là các enzym tự ly giải thành tế bào vi khuẩn (ví dụ: các autolysin) Còn chưa rõ mối liên quan giữa các PBP và các autolysin, nhưng có lẽ kháng sinh beta – lactam gây cản trở bằng một chất ức chế autolysin e Cơ chế kháng 20 Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm Tính kháng với các penicillin có được phần lớn là nhờ sản sinh beta – lactam Để khắc phục... nhiều nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu sản xuất các chất kháng sinh này Nhờ vậy chỉ trong vòng hai năm người ta đã xác định được cấu trúc phân tử và triển khai thành công nghệ sản xuất ra loại thuốc kháng sinh này Hình 1.8 Công thức phân tử chung của họ chloramphenicol Trong đó : 14 Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm • • • • • Chloramphenicol có góc R: Cl2CHO – Nitrophenylseriol... 0 0.00 Thủy sản khô các loại Chả giò, há cảo 242 13 7.18 11 6.08 8 4.42 125 4 4.26 3 3.19 1 1.06 Mắm hải sản các loại 35 4 13.33 1 3.33 0 0.00 25 Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm Bảng 2.2 Tương quan giữa nồng độ CAP xác định bằng ELISA và tỷ lệ dư ng giả Với hàm lượng CAP có giá trị từ 0.3ppb trở lên (tương đương mức qui định của EU), thì tỉ lệ dư ng giả giảm mạnh,... trọng đến hệ miễn nhiễm, làm mất khả năng kháng thuốc khi tích tụ lâu ngày và có khả năng gây đột biến, rối loạn nội tiết d Sản xuất chloramphenicol 15 Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm Cơ chế sinh tổng hợp chloramphenicol: Ngày nay người ta có khả năng phân lập được nhiều nhiều vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh thuộc họ chloramphenicol như: Streptomyces,... Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm 1.8.3 Penicillin [13] a Lịch sử Penicilin được tìm ra nǎm 1928 và được sử dụng trong lâm sàng lần đầu tiên vào nǎm 1941 Nǎm 1941, penicilin G là kháng sinh có hiệu quả cao, thậm chí chống được hầu hết các chủng Staphylococcus aureus Tuy nhiên, đến nǎm 1947, phần lớn các các vi khuẩn phân lập được trong bệnh viện đều biểu hiện tính kháng. .. nguyên sử dụng để kích thích sản xuất kháng thể thì khả năng phát hiện của kít càng cao Theo thông tin ghi trong kít thì kháng nguyên sử dụng để sản xuất kháng thể là dẫn xuất của sarafloxacine, do đó kết quả này hoàn toàn phù hợp Như vậy, có thể kết luận kít có khả năng phát hiện tốt các kháng sinh 32 Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm thuộc nhóm quinolone được thử ở