B GIO DC V O TO TRNG I HC S PHM TP H CH MINH Hunh Th Bớch Liu XY DNG QUY TRèNH KHUCH I H GEN TY TH CHể Cể XOY LNG THI LAN BNG K THUT LONG-PCR V SO SNH QUAN H DI TRUYN GIA CHể Cể XOY LNG THI LAN V PH QUC LUN VN THC S SINH HC Thnh ph H Chớ Minh 2014 B GIO DC V O TO TRNG I HC S PHM TP H CH MINH Hunh Th Bớch Liu XY DNG QUY TRèNH KHUCH I H GEN TY TH CHể Cể XOY LNG THI LAN BNG K THUT LONG-PCR V SO SNH QUAN H DI TRUYN GIA CHể Cể XOY LNG THI LAN V PH QUC Chuyờn ngnh: Sinh hc thc nghim Mó s: 60 42 01 14 LUN VN THC S SINH HC Thnh ph H Chớ Minh 2014 LI CAM OAN Tụi xin cam oan õy l cụng trỡnh nghiờn cu ca riờng tụi.Cỏc s liu v cỏc kt qu nờu lun l trung thc v cha tng c cụng b bt k cụng trỡnh no khỏc Tỏc gi Hunh Th Bớch Liu LI CM N hon thnh c lun tt nghip ny, u tiờn tụi xin chõn thnh gi li cm n sõu sc n TS Trn Hong Dng ngi Thy ó tn ty, ht lũng quan tõm, hng dn v h tr, giỳp tụi nhng lỳc khú khn nht Trong sut quỏ trỡnh lm ti Thy luụn nhc nh, sa cha nhng sai sút, to iu kin cho tụi hon thnh lun Tụi cng xin gi li cm n chõn thnh n: Thy TS Chung Anh Dng thuc phũng Cụng ngh Sinh hc - Vin Khoa hc K thut Nụng nghip Min Nam ó tn tỡnh hng dn, to mi iu kin thun li cho tụi hon thnh lun ny Xin trõn trng bit n quý Thy, Cụ thuc Khoa Sinh hc v Phũng o to Sau i hc Trng i hc S phm Tp HCM ó tn tỡnh dy d, ch bo tụi sut quỏ trỡnh hc Xin trõn trng cm n Ban lónh o Vin Khoa hc K thut Nụng nghip Min Nam v Vin K thut Cụng ngh cao NTT Trng i hc Nguyn Tt Thnh ó to mi iu kin thun li giỳp tụi sut thi gian nghiờn cu ti Vin Cm n cỏc anh, ch, em, bn bố thuc phũng Genome & Bioinformatics - Vin K thut Cụng ngh cao - Trng H Nguyn Tt Thnh v Phũng Cụng ngh Sinh hc - Vin Khoa hc K thut Nụng nghip Min Nam ó giỳp tụi sut quỏ trỡnh thc hin lun Cui cựng tụi xin gi n ba m - ngi luụn bờn cnh tụi nhng lỳc khú khn nht - lũng bit n sõu sc Ba m cho nim tin, ngh lc cuc sng cng nh ng viờn v h tr cho mi mt c v vt cht ln tinh thn Tp H Chớ Minh, thỏng nm 2014 Tỏc gi Hunh Th Bớch Liu MC LC Trang Li cm n Li cm n Mc lc Danh mc cỏc t vit tt Danh mc cỏc bng Danh mc hỡnh nh M U .1 Lý chn ti Mc tiờu nghiờn cu Ni dung nghiờn cu 3.1 Ni dung 1: Ti u húa quy trỡnh tỏch chit DNA tng s ca mu Thỏi Lan 3.2 Ni dung 2: Xõy dng quy trỡnh khuch i cỏc mnh ca h gen ty th Thỏi Lan bng k thut Long-PCR 3.3 Ni dung 3: Gii v hiu chnh trỡnh t nm gen ca h gen ty th cú xoỏy Thỏi Lan 3.4 Ni dung 4: Nghiờn cu ỏnh giỏ a dng di truyn v xỏc nh mi quan h di truyn Phỳ Quc v Thỏi Lan da trờn phõn tớch phỏt sinh chng loi da vo trỡnh t cỏc gen .2 Phm vi nghiờn cu Chng TNG QUAN 1.1.Gii thiu v ging Phỳ Quc-Ngun gc ging Phỳ Quc Vit Nam 1.1.1 Phõn loi 1.1.2 c im chung ca cú xoỏy Phỳ Quc .6 1.1.3 Nghi v ngun gc ca ging Phỳ Quc Vit Nam 1.2 c im chung ca cú xoỏy Thỏi Lan 1.3 Cỏc nghiờn cu a dng di truyn v tin húa phỏt sinh chng loi da trờn trỡnh t h gen ty th 10 1.3.1 c im v c ch di truyn ca h gen ty th ng vt hu nh 10 1.3.2 loi ng dng ca h gen ty th nghiờn cu tin húa v phỏt sinh chng 11 1.3.3 Cỏc nghiờn cu a dng di truyn v tin húa phỏt sinh chng loi da trờn ton b trỡnh t h gen ty th 12 Chng VT LIU-PHNG PHP 20 2.1 Vt liu, húa cht v a im nghiờn cu .20 2.1.1 Vt liu v húa cht 20 2.1.2 a im nghiờn cu 23 2.2 Phng phỏp nghiờn cu 23 2.2.1 Phng phỏp thu mu v tỏch DNA tng s 23 2.2.2 Phng phỏp in di trờn gel agarose .27 2.2.3 Khuch i cỏc mnh gen ty th bng k thut PCR (Polymerase Chain Reaction) 27 2.2.4 Phng phỏp gii trỡnh t 33 2.2.5 Hiu chnh trỡnh t 33 2.2.6 So sỏnh vi c s d liu trờn ngõn hng gen 35 Chng KT QU V THO LUN 37 3.1 Thu thp mu 37 3.2 Ti u húa quy trỡnh tỏch chit DNA tng s 37 3.3 nh loi kiu n bi cú xoỏy Thỏi Lan bng trỡnh t vựng kim soỏt 41 3.3.1 Thit lp phn ng PCR khuch i vựng kim soỏt 41 3.3.2 Kt qu gii v phõn tớch trỡnh t DNA vựng kim soỏt 42 3.3.3 nh loi kiu n bi cho cú xoỏy lng Thỏi Lan 45 3.4 Xõy dng quy trỡnh phn ng khuch i cỏc mnh gen ty th bng k thut Long-PCR 48 3.4.1 Xõy dng quy trỡnh phn ng PCR khuch i mnh 49 3.4.2 Xõy dng quy trỡnh phn ng khuch i mnh v mnh h gen ty th cú xoỏy lng Thỏi Lan .51 3.5 Gii v phõn tớch trỡnh t h gen ty th Thỏi Lan mang kiu n bi A11 54 3.5.1 Thu nhn v hiu chnh kt qu gii trỡnh t .56 3.5.2 Lp rỏp cỏc trỡnh t ó hiu chnh .58 3.5.3 Phõn tớch phỏt sinh loi 59 KT LUN V KIN NGH .63 TI LIU THAM KHO 64 PH LC Ph lc Phng phỏp hiu chnh v lp rỏp trỡnh t cỏc gen ca h gen ty th Ph lc Phng phỏp s b xỏc nh tờn loi ca cỏc trỡnh t DNA vựng D-loop bng thut toỏn BLAST DANH MC CC T VIT TT àg Microgram àL Microlit BLAST Local Alignment Search Tool Bp Base pair DNA Deoxyribonucleic acid DNAse Deoxyribonuclease dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate EDTA Ethylenediamine tetraacetate Ep Eppendorf F Forward FCI Federation Cynologique International IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry Kb Kilo base mtDNA Mitochondrial DNA NCBI National Center for Biotechnology Information PCR Polymerase Chain Reaction R Reverse RNA Ribonuclease RNAse Ribonuclease rRNA Ribosomal RNA tRNA Transport RNA SDS Sodium dodecyl sulfate SSC buffer Sodium clorua NaCl, Sodium Citrate C H Na TBE Tris Borate EDTA TE Tris EDTA Tm Melting Temperature U Unit UV Ultraviolet V Volume DANH MC CC BNG Trang Bng 2.1 Húa cht tỏch chit DNA 20 Bng 2.2 Húa cht s dng k thut PCR 21 Bng 2.3 Húa cht in di 21 Bng 2.4 Dng c v thit b 22 Bng 2.5 Cp mi c hiu s dng phn ng khuch i vựng kim soỏt (Dloop) .28 Bng 2.6 Cỏc thnh phn cú phn ng khuch i vựng kim soỏt (D-loop) 29 Bng 2.7 Chu trỡnh nhit khuch i vựng kim soỏt (D-loop) 29 Bng 2.8 Cỏc cp mi khuch i cho phn ng PCR 30 Bng 2.9 Cỏc thnh phn phn ng PCR khuch i h gen ty th cú xoỏy lng Thỏi Lan s dng MasterAmp Extra-Long PCR 2X PreMixes 30 Bng 2.10 Cỏc thnh phn phn ng PCR khuch i mnh 1, 2, ln h gen ty th cú xoỏy lng Thỏi Lan s dng MasterAmp Extra-Long PCR 2X PreMixes .31 Bng 2.11 Chu trỡnh nhit khuch i mnh ln 31 Bng 2.12 Chu trỡnh nhit khuch i mnh 2, mnh ln 31 Bng 2.13 Cỏc thnh phn phn ng PCR khuch i mnh 1, 2, ln h gen ty th cú xoỏy lng Thỏi Lan s dng MasterAmp Extra-Long PCR 2X PreMixes .32 Bng 2.14 Chu trỡnh nhit khuch i mnh ln 32 Bng 2.15 Chu trỡnh nhit khuch i mnh ln 32 Bng 2.16 Chu trỡnh nhit khuch i mnh ln 33 Bng 3.1 Kt qu o quang DNA tng s c tỏch chit theo quy trỡnh FBI 38 Bng 3.2 Kt qu o quang DNA tng s c tỏch chit theo quy trỡnh cú hiu chnh .38 Bng 3.3 Kt qu o quang ca 11 mu Phỳ Quc v mt mu cho Thỏi Lan .40 Bng 3.4 Ba cp mi khuch i h gen ty th cú xoỏy Thỏi Lan 49 Bng 3.5 Thụng tin v nm gen mó húa protein nghiờn cu 55 Bng 3.6 Chớn cp mi dnh gii trỡnh t cỏc vựng gen nghiờn cu .55 59 Hỡnh 3.21 Trỡnh t ng nht ca Thỏi Lan trờn phn mm SeaView 3.5.3 Phõn tớch phỏt sinh loi xõy dng cõy tin húa da trờn trỡnh t nm gen ty th Thỏi Lan, chỳng tụi s dng b d liu gm 77 trỡnh t mtDNA ca cỏc loi thuc h Chú ni ting trờn th gii S dng hoang (Canis latrans) lm nhúm ngoi Trong ú cú hai trỡnh t mtDNA PQ1 (haplotype E4) v PQ2 (haplotype B1) ó c gii hon chnh lun nh dng haplotype v truy tỡm ngun gc Phỳ Quc bng trỡnh t vựng CR v b gen ty th ca Trng Nguyn Th Nh Mai v s dng nm trỡnh t mtDNA thuc kiu n bi A11 c ly t ngõn hng gen Sau ú, chỳng tụi tớch hp trỡnh t Thỏi Lan ó gii vi b d liu cú sn Cõy tin húa c suy lun t thut toỏn Neighbor-Joining Mụ hỡnh tin húa ti thớch cú tng chiu di nhỏnh = 0.12390421 Cõy phỏt sinh chng loi c v theo t l, vi chiu di nhỏnh tng ng khong cỏch tin húa c dựng suy lun cõy phỏt sinh chng loi Khong cỏch tin húa c c tớnh s dng thut toỏn Maximum-Likelihood v c biu th bng s base thay th mi v trớ Phộp phõn tớch bao gm 77 trỡnh t vi 4832 v trớ base c phõn tớch, ton b khong trng c loi b trc phõn tớch Phõn tớch tin húa c x lý bng phn mm MEGA6 Kt qu phõn tớch cho thy lng cú xoỏy Thỏi Lan mang kiu n bi A11 nm chung vi nhúm cú tin húa cao Chú Thỏi Lan cú tin húa xa hn so 60 vi nhúm mang kiu n bi A11 iu ny c gii thớch cú s sai khỏc v mt nucleotide n l (SNP) gia cỏc trỡnh t Trong ú nhúm Phỳ Quc ó phõn tớch nm nhúm ớt tin húa, nm v trớ ch em vi súi Tõy Tng (mó s GQ374438.1) iu ny gi ý cú th cú xoỏy Phỳ Quc v cú xoỏy Thỏi Lan khụng cựng mt t tiờn cú nhng kt lun chớnh xỏc hn v mt quan h di truyn gia lng xoỏy Phỳ Quc v lng xoỏy Thỏi Lan cn cú thờm nhiu d liu cú xoỏy lng Thỏi Lan Cng nh cn phi gii ht ton b h gen ty th cú nhiu thụng tin di truyn hn 61 EU789731.1 no comment Cho Thai Lan no comment EU789770.1 no comment EU789735.1 no comment Viszla VI1 EU408305 Rottweiler RO2 EU408295 Newfoundland NE1 EU408287 Rottweiler RO1 EU408296 English Springer Spaniel AY656744.1 Great Pyrenees GP1 EU408277 Australian Shepherd AU2 EU408248 Australian Shepherd AU1 EU408249 Irish Setter IR2 AY656753 Sapsaree AY656755.1 EU789740.1 no comment EU789730.1 no comment Old English Sheepdog AY656742.1 Nhúm A Nhúm B Tibetan Mastiff TM1 EU408300 Nhúm Tõy t?ng Grey wolf W07 DQ480503 Black Russian Terrier BL1 DQ480493 Swedish Elkhound from Sweden DQ480501.1 German Shepherd GE1 DQ480489 Canis lupus chanco GQ374438.1 Nhúm Phỳ Qu?c Husky102 AB499817.1 Kisyu25 AB499816.1 Grey wolf W03 DQ480507 Grey wolf W04 DQ480506 Jamthund JA1 DQ480502 Jamthund JA2 DQ480492 Tibetan wolf T01 NC 011218 Tibetan wolf T02 FJ032363 laniger FJ032363.2 Coyote C03 DQ480510 Coyote C04 DQ480511 Coyote C01 NC 008903 Coyote C02 DQ480509 0.005 Hỡnh 3.22 Cõy tin húa dng bng thut toỏn Maximum-Likehood t trỡnh t gen ND1, ND2, ATP8, ND4 v CYTB cú tng chiu di 4832 bp ca 77 trỡnh t 62 KT LUN V KIN NGH 63 KT LUN V KIN NGH Kt lun T nhng kt qu trờn chỳng tụi rỳt mt s kt lun sau: Quy trỡnh tỏch chit DNA tng s sau hiu chnh cho hiu qu cao DNA cú tinh sch tt, c s dng cho cỏc phn ng PCR sau ny Cỏc cp mi c s dng nghiờn cu ny hot ng tt, s dng hiu qu phn ng PCR v phn ng gii trỡnh t Xõy dng thnh cụng quy trỡnh khuch i cỏc mnh ca h gen ty th cú xoỏy Thỏi Lan bng k thut Long-PCR Gii c trỡnh t nm gen: ND1, ND2, ATP8, ND4 v CYTB thuc h gen ty th cú xoỏy Thỏi Lan Phõn tớch cỏc SNP ca vựng kim soỏt (D-loop), chỳng tụi xỏc nh mu Thỏi Lan nghiờn cu ca chỳng tụi mang kiu n bi A11 Kt qu phõn tớch ngun gc tin húa da trờn trỡnh t ca nm gen ca h gen ty th Thỏi Lan cho thy Thỏi Lan nm nhúm cú tin húa cao Trong ú cú xoỏy Phỳ Quc nm nhúm ớt tin húa iu ny gi ý cú xoỏy lng Phỳ Quc v cú xoỏy lng Thỏi Lan khụng cựng thuc mt t tiờn Kin ngh Nghiờn cu ny ch mi kho sỏt trờn mt mu Thỏi Lan, chỳng tụi kin ngh cn tng thờm s mu kho sỏt v m rng khu vc a lý thu thp mu trỏnh tỡnh trng thiờn lch s lng mu quỏ ớt 64 TI LIU THAM KHO Ting Vit Nguyn Hu Chim, Nguyn Vn Bin, Vừ Cụng Thnh, Nguyn Hu Thin, Trn Th Kim Hng, Nguyn Vn c, Lõm Thnh Quc, Lý Th Liờn Khai, Bựi Th Mai Phng, Nguyn ỡnh Truyờn (2004), iu tra nghiờn cu bo tn gen ng vt: Phỳ Quc, tnh Kiờn Giang, Bỏo cỏo tng kt, Trng i hc Cn Th Hong Tun Thnh, Nguyn Quc t, Vừ Vn S, Hong Vn Tiu (2009), Kh nng sinh trng v sinh sn ca Phỳ Quc nuụi ti Thnh ph H Chớ Minh, Bỏo cỏo khoa hc, Vin Chn Nuụi Lờ Th Thỳy (2010), Xỏc nh s sai khỏc di truyn ca cỏc ging g ni, Bỏo cỏo tng kt, Vin Chn Nuụi inh Trn M c (2013), Bc u nghiờn cu tớnh a dng di truyn ca Chú Phỳ Quc khu vc thnh ph H Chớ Minh da trờn trỡnh t 16S genome ty th Trng Nguyn Th Nh Mai (2013), nh dng haplotype v truy tỡm ngun gc Phỳ Quc bng trỡnh t vựng CR v b gen ty th Ting Anh Ana E.P., Lahoussine O., Mohsen K., Jose M., Francisco P.-F and Michael W.B (2006) Mitochondrial DNA sequence variation in Portuguese native dog breeds: Diversity and phylogentic affinities Journal of Heredity, 97(4), 318 - 330 Ardalan A., Kluetsch C.F., Zhang A.B., Erdogan M., Uhlen M., Houshmand M., Tepeli C., Ashtiani S.R and Savolainen P (2011) Comprehensive study of mtDNA among Southwest Asian dogs contradicts independent domestication of wolf, but implies dog-wolf hybridization Ecology and Evolution, 1(3), 373-385 65 Bannasch D., Bannasch M., Ryun J., Famula T and Pedersen N (2005) Y chromosome haplotype analysis in purebred dogs Mammalian Genomes, 16(4), 273-280 Bjornerfeldt S., Webster M.T and Vila C (2006) Relaxation of selective constraint on dog mitochondrial DNA following domestication Genomes Research, 16(8), 990-994 10 Clayton, D.A (1992) Transcription and replication of animal mitochondrial DNAs International Review Cytology, 141, 217-232 11 Ding Z.-L., Oskarsson M., Ardalan A., Angleby H., Dahlgren L.-G., Tepeli C., Kirkness E., Savolainen P and Zhang Y.-P (2012) Origins of domestic dog in Southern East Asia is supported by analysis of Y-chromosome DNA Heredity, 108(5), 507-514 12 GệKầK ầigdem (2005), Mitochondrial DNA (mtDNA) sequence analyses of Kangal dogs in Turkey, Master Thesis, Middle East Technical University 13 Gundry R.L., Allard M.W., Moretti T.R., Honeycutt R.L., Wilson M.R., Monson K.L and Foran D.R (2007) Mitochondrial DNA analysis of the domestic dog: Control region variation within and among breeds Journal of Forensic Sciences, 52(3), 562-572 14 Kim K.S., Lee S.E., Jeong H.W and Ha J.H (1998) The complete nucleotide sequence of the domestic dog (Canis familiaris) mitochondrial genome Molecular Phylogentics and Evolution, 10(2), 210-220 15 Klỹtsch C.F.C., Seppọlọ E.H., Fall T., Uhlộn M., Hedhammar ., Lohi H and Savolainen P (2011) Regional occurrence, high frequency but low diversity of mitochondrial DNA haplogroup d1 suggests a recent dog-wolf hybridization in Scandinavia Animal Genetics, 42(1), 100-103 16 Lang B.F., Gray M.W., Burger G., (1999) Mitochondrial genome evolution and the origin of eukaryotes Annual Review Genetics, 33, 351 397 17 Li Q., Liu Z., Li Y., Zhao X., Dong L., Pan Z., Sun Y., Li N., Xu Y and Xie Z (2008) Origin and phylogentic analysis of Tibetan Mastiff based on the 66 mitochondrial DNA sequence Journal of Genetics and Genomics, 35(6), 335-340 18 Li Y., Li Q., Zhao X., Xie Z and Xu Y (2010), Complete sequence of the Tibetan Mastiff mitochondrial h gen and its phylogentic relationship with other Canids (Canis, Canidae) Animal, 5(1), 18-25 19 Li Y and Zhang Y (2012) High genetic diversity of Tibetan Mastiffs revealed by mtDNA sequences Chinese Science Bulletin, 57(13), 1483-1487 20 Magda Sindii, Tomislav Gomeri, Ana Galov, Haidi Arbanasi, Josip Kusak, Alen Slavica and Huber a.D (2011) Mitochondrial DNA control region as a tool for species identification and distinction between wolves and dogs from Croatia" Veterinarski Arhives, 81, 249-258 21 Okumura N., Ishiguro N., Nakano M., Matsui A and Sahara M (1996) Intraand interbreed genetic variations of mitochondrial DNA major non-coding regions in Japanese native dog breeds Canis familiaris Animal Genetics, 27(6), 397-405 22 Oskarsson M.C., Klutsch C.F., Boonyaprakob U., Wilton A., Tanabe Y and Savolainen P (2012) Mitochondrial DNA data indicate an introduction through Mainland Southeast Asia for Australian dingoes and Polynesian domestic dogs Proceedings Biological sciences/The Royal Society, 279(1730), 967-974 23 Pang J.F., Kluetsch C., Zou X.J., Zhang A.B., Luo L.Y., Angleby H., Ardalan A., Ekstrom C., Skollermo A., Lundeberg J., Matsumura S., Leitner T., Zhang Y.P and Savolainen P (2009) mtDNA data indicate a single origin for dogs south of Yangtze River, less than 16,300 years ago, from numerous wolves Molecular Biology and Evolution 26(12), 2849-2864 24 Pereira F., Carneiro J and Asch B.v (2010) A guide for mitochondrial DNA analysis in non-human forensic investigations The Open Forensic Science Journal, 33-44 67 25 Pereira L., Van Asch B and Amorim A (2004) Standardisation of nomenclature for dog mtDNA D-loop: a prerequisite for launching a Canis familiaris database Forensic Science International, 141(23), 99-108 26 Roe Bruce A., Crabtree Judy S., Khan Akbar S (1995), Protocols for recombinant DNA isolation, cloning and sequencing, University of Oklahoma 27 Salmon Hillbertz N.H.C., Isaksson M., Karlsson E.K., Hellmen E., Pielberg G.R., Savolainen P., Wade C.M., von Euler H., Gustafson U., Hedhammar A., Nilsson M., Lindblad-Toh K., Andersson L and Andersson G (2007) Duplication of FGF3, FGF4, FGF19 and ORAOV1 causes hair ridge and predisposition to dermoid sinus in Ridgeback dogs Nature Genetics, 39(11), 1318-1320 28 Savolainen, B Rosen, A Holmberg, T Leitner, M Uhlen,J Lundeberg (1997),Sequence analysis of domestic dog mitochondrial DNA for forensic use, Journal of Forensic Sciences 42(4), 593600 29 Savolainen P., Zhang Y.P., Luo J., Lundeberg J and Leitner T (2002) Genetic evidence for an East Asian origin of domestic dogs Science, 298(5598), 1610-1613 30 Tsuda K., Kikkawa Y., Yonekawa H and Tanabe Y (1997) Extensive interbreeding occurred among multiple matriarchal ancestors during the domestication of dogs: Evidence from inter- and intraspecies polymorphisms in the D-loop region of mitochondrial DNA between dogs and wolves Gens & Genetic Systems, 72(4), 229-238 31 Van Asch B., Pereira L., Pereira F., Santa-Rita P., Lima M and Amorim A (2005) MtDNA diversity among four Portuguese autochthonous dog breeds: a fine-scale characterisation BMC Gentics, 6, 37 32 Vila, P Savolainen, J.E Maldonado, I.R Amorim, J.E.Rice, R.L Honeycutt, K.A Crandall, J Lundeberg, R.K.Wayne (1997), Multiple and ancient origins of the domestic dog, Science 276: 16871689 68 33 Vila C., Maldonado J.E and Wayne R.K (1999) Phylogenetic relationships, evolution, and genetic diversity of the domestic dog Journal of Heredity, 90(1), 71-77 34 Webb K.M and Allard M.W (2009) Identification of forensically informative SNPs in the domestic dog mitochondrial control region Journal of Forensic Sciences, 54(2), 289-304 35 Webb K.M and Allard M.W (2009) Mitochondrial genome DNA analysis of the domestic dog: identifying informative SNPs outside of the control region Journal of Forensic Sciences, 54(2), 275-288 Internet 36 http://www.dogbreedinfo.com/thairidgeback.htm 37 http://www.bigdogbreeds101.com/dogs/2013/04/15/rhodesian-ridgeback/ 38 http://m.english.vietnamnet.vn/fms/special-reports/13408/seeking-the-origin-ofphu-quoc-ridgeback.html 39 http://petsvietnam.com/vietnam-pet-industry-blog/phu-quoc-ridgeback dogs/seeking-the-origins-of-the-phu-quoc-ridgeback-dog-of-vietnam/ 40 http://m.nguoiduatin.vn/chuyen-ky-bi-ve-loai-khuyen-vuong-o-phu-quoc-ky-3nhung-cau-chuyen-chua-loi-giai-ve-khuyen-vuong-tren-dao-ngoc-a77396.html 41 http://phuquocconservation.com/vi/tiem-nang-du-lich/80-gioi-thieu-chung-ve-phuquoc 42 http://khoahoc.kiengiang.gov.vn/index2.jsp?menuId=1171&articleId=18225 43 http://dogsinvietnam.com/diendan/showthread.php?p=36847 44 http://vi.wikipedia.org/wiki/Ch%C3%B3_l%C3%B4ng_xo%C3%A1y_Th%C3%A1 i_Lan 45 www.ncbi.nlm.nih.gov/ 46 http://core.biotech.hawaii.edu/download/DNASequencingGuide.pdf 47 http://biology.tutorvista.com/animal-and-plant-cells/mitochondria.html PH LC Ph lc Phng phỏp hiu chnh v lp rỏp trỡnh t cỏc gen ca h gen ty th Kt qu gii trỡnh t cỏc gen ca h gen ty th c nhn di dng biu hunh quang Kt qu gii trỡnh t hai chiu c nhn di dng file ABI (.abi) S dng phn mm FinchTV 1.4 m file vi cỏc trỡnh t c gii bng mi xuụi v mi ngc Cỏc ca s s hin cỏc súng sc ph sau: Mu xanh lc: nucleotide loi A Mu xanh dng: nucleotide loi C Mu en: nucleotide loi G Mu : nucleotide loi T nhng kt qu gii trỡnh t tt chỳng ta s thy cỏc nh rừ rng, khụng mp m th hin cho tng loi nucleotide S dng Horizontal Scale v Vertical Scale tng hoc gim chiu rng v chiu cao cỏc súng nhỡn cha rừ Quan sỏt v xúa b cỏc on u v on cui ca kt qu gii trỡnh t (nhng on cú cỏc nh súng mp m) Hỡnh Cỏc v trớ mp m phn u v phn cui ca kt qu gii trỡnh t Hỡnh Kt qu sau xúa b cỏc v trớ mp m hai u trỡnh t i vi kt qu gii trỡnh t bng mi ngc, sau tin hnh xúa b cỏc v trớ mp m, chn Reverse Complement trờn cụng c Hỡnh Kt qu gii trỡnh t trc Reverse Complement Hỡnh Kt qu gii trỡnh t sau Reverse Complement Sau hiu chnh hai trỡnh t mi xuụi v mi ngc, dựng t hp phớm nhanh Ctrl + C chộp trỡnh t ca kt qu gii trỡnh t mi xuụi (mi ngc) M phn mm SeaView 4.2, vo menu Edit chn Load sequence Ca s mi hin ra, dựng t hp phớm nhanh Ctrl + V dỏn trỡnh t ó chộp vo Tin hnh t tờn cho trỡnh t va c dỏn vo ụ Seq name ca s, xong chn Add to alignment Lu li file di dng FASTA (.fst) v t tờn cho phự hp Lm tng t vi trỡnh t ngc li Sau ó thờm vo, chn hai trỡnh t ca cựng mt mu, vo menu Edit chn Dot plot sp thng hng hai trỡnh t Hoc vo menu Align chn Align selected sequences Tip theo tin hnh kim tra cỏc im sai khỏc gia trỡnh t mi xuụi v mi ngc Mi im sai khỏc gia hai trỡnh t mi xuụi v mi ngc s c chnh sa da theo trỡnh t cú súng sc ph rừ rng v ỏng tin cy hn i vi cỏc on ch cú trỡnh t mi xuụi hoc mi ngc, vic hiu chnh trỡnh t da trờn vic quan sỏt cỏc súng sc ph Nu nhng im on ny khụng rừ rng thỡ cn c loi b hoc phi tin hnh gii trỡnh t li Hỡnh Trỡnh t xuụi v ngc sau c chộp vo phn mm SeaView v sp thng hng To trỡnh t thng nht t hai trỡnh t xuụi v ngc: ca s SeaView chn hai trỡnh t mi xuụi v ngc, vo menu Edit chn Consensus sequence Kt qu to thnh mt trỡnh t kt hp, cú th i tờn bng cỏch chn trỡnh t consensus v vo menu Edit, chn Rename sequence, t tờn trỡnh t cho phự hp Hỡnh Trỡnh t liờn ng hai trỡnh t xuụi v ngc Ph lc Phng phỏp s b xỏc nh tờn loi ca cỏc trỡnh t DNA vựng Dloop bng thut toỏn BLAST xỏc nh cỏc trỡnh t DNA vựng D-loop sau gii trỡnh t v hiu chnh cú phi thuc loi Canis lupus khụng ta s dng BLAST Bc 1: Vo trang web http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Bc 2: Chn nucleotide blast Bc 3: chộp v dỏn trỡnh t cn phõn tớch vo ca s Ent Query Sequence Trong tựy chn Database chn nucleotide collection (nr/nt) Cỏc tựy chn khỏc t nh mc nh Hỡnh Giao din ca ng dng nucleotide blast v trỡnh t vựng D-loop ca Thỏi Lan c dỏn vo chun b cho phõn tớch Bc 4: Chn BLAST phõn tớch Sau phõn tớch xong nhn c kt qu nh hỡnh 3.8 Hỡnh Kt qu phõn tớch nh thut toỏn BLAST i vi mu Thỏi Lan [...]... trình khuếch đại toàn bộ hệ gen ty thể chó có xoáy lưng Thái Lan bằng kĩ thuật Long- PCR để thu thập dữ liệu phân tử nhằm phân tích quan hệ di truyền giữa chó có xoáy lưng Thái Lan và Phú Quốc 3 Nội dung nghiên cứu 3.1 Nội dung 1: Tối ưu hóa quy trình tách chiết DNA tổng số của mẫu chó Thái Lan 3.2 Nội dung 2: Xây dựng quy trình khuếch đại các mảnh của hệ gen ty thể chó Thái Lan bằng kĩ thuật Long- PCR. .. cặp mồi phổ quát để khuếch đại các mảnh của hệ gen ty thể chó có xóay Thái Lan - Nghiên cứu chuẩn hóa điều kiện phản ứng khuếch đại các mảnh của hệ gen ty thể chó có xoáy Thái Lan bằng kĩ thuật Long- PCR 3.3 Nội dung 3: Giải và hiệu chỉnh trình tự năm gen của hệ gen ty thể chó có xoáy Thái Lan - Giải trình tự của năm gen của hệ gen ty thể chó có xoáy Thái Lan - Hiệu chỉnh kết quả giải trình tự - Tích hợp... Hàn Quốc, Shar-Pei Trung Quốc và PungSang Triều tiên Hơn nữa, nghiên cứu hệ gen ty thể của chó Phú Quốc, nhóm nghiên cứu còn thấy, hệ gen ty thể chó Phú Quốc có mức độ tương đồng đến 98% với hệ gen ty thể chó sói xám Tuy nhiên trong nghiên cứu này, các tác giả chưa phân tích hệ gen ty thể của chó lưng có xoáy Thái Lan để tìm hiểu quan hệ nguồn gốc giữa chó lưng có xoáy Thái Lan và lưng có xoáy Phú Quốc. .. Để có thêm những bằng chứng chứng minh sự phát triển song song của hai loài chó này cần có những nghiên cứu sâu hơn về chó có xoáy Thái Lan Do vậy chúng tôi muốn giải trình tự hệ gen ty thể chó lưng có xoáy Thái Lan để so sánh với hệ gen ty 2 thể chó lưng có xoáy Phú Quốc, nhằm tìm quan hệ phát sinh chủng loài của hai loài có hình thái bên ngoài tương cận nhau này 2 Mục tiêu nghiên cứu Xây dựng quy trình. .. sống lưng chó Phú Quốc (http://dogsinvietnam.com/diendan/showthread.php?p=36847) 1.1.3 Nghi vấn về nguồn gốc của giống chó Phú Quốc Việt Nam Chó Phú Quốc là một trong 3 dòng chó có xoáy lưng trên thế giới Hai loại chó có xoáy lưng còn lại là chó xoáy Rhodesia Châu Phi và chó xoáy Thái Lan Tuy nhiên, hiện nay chó có xoáy lưng trên thế giới chỉ có hai giống đó là Rhodesia Châu Phi và chó xoáy Thái Lan. .. được chó Phú Quốc có thể có một sự phát triển song song với chó xoáy Thái Lan, và muốn biết chính xác hơn thì phải phân tích DNA mới có thể xác định được mối quan hệ của các giống chó này [40], [41], [42] 1.2 Đặc điểm chung của chó có xoáy Thái Lan Chó có xoáy lưng Thái Lan có kích thước trung bình, với lông ngắn và có một dải lông mọc ngược trên lưng Chúng có dáng cao, chiều dài thân dài hơn so với... giải trình tự 3.4 Nội dung 4: Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền và xác định mối quan hệ di truyền chó Phú Quốc và chó Thái Lan dựa trên phân tích phát sinh chủng loài dựa vào trình tự các gen - Thiết lập bộ cơ sở dữ liệu gồm các trình tự hệ gen ty thể chó cho phân tích - Xác định tính đa hình dựa trên một nucleotide đơn lẻ (SNP) của các trình tự các gen của hệ gen ty thể chó Thái Lan đã giải trình. .. Quốc Hai nhà khoa học người Mỹ là Merle Wood và Merle Hidinger cho rằng trong quá khứ chỉ có chó xoáy Thái Lan và chó xoáy Rhodesian của Nam Phi là có dải lông xoáy trên lưng, vì vậy chó Phú Quốc phải có nguồn gốc từ có xoáy Thái Lan Họ còn nói hơn 400 năm trước, các ngư dân Thái Lan đã mang chó xoáy Thái Lan đến đảo Phú Quốc và đã trở thành tổ tiên của chó Phú Quốc ngày nay [40] Giáo sư Dư Thanh Khiêm,... điểm hình thái cho thấy có sự khác biệt giữa chó xoáy Thái Lan và chó Phú Quốc Chó Thái có khối lượng trung bình khoảng 23 kg, cao 55 cm, trong khi chó Phú Quốc có khối lượng lớn nhất chỉ 18 kg và cao 48 cm Nếu suy luận theo giả thuyết nguồn gốc của chó Phú Quốc là từ những con có xoáy Thái Lan do ngư dân Thái Lan mang đến và để lại trên đảo Phú Quốc, thì với điều kiện tự nhiên của đảo Phú Quốc, một... dựa trên 181 trình tự bao gồm 531 nucleotides 47 Hình 3.10 Sơ đồ hệ thống các cặp mồi khuếch đại các mảnh gen ty thể chó Thái Lan và vị trí các gen cần giải trình tự 49 Hình 3.11 Kết quả điện di sản phẩm PCR mảnh 1 lần 1 hệ gen ty thể chó Thái Lan 50 Hình 3.12 Kết quả điện di sản phẩm PCR mảnh 1lần 2 hệ gen ty thể chó Thái Lan 51 Hình 3.13 Kết quả điện di sản phẩm PCR mảnh 2 lần ... mnh gen ty th Thỏi Lan v v trớ cỏc gen cn gii trỡnh t 49 Hỡnh 3.11 Kt qu in di sn phm PCR mnh ln h gen ty th Thỏi Lan 50 Hỡnh 3.12 Kt qu in di sn phm PCR mnh 1ln h gen ty th Thỏi Lan. .. mnh ca h gen ty th cú xoỏy Thỏi Lan bng k thut Long- PCR 3.3 Ni dung 3: Gii v hiu chnh trỡnh t nm gen ca h gen ty th cú xoỏy Thỏi Lan - Gii trỡnh t ca nm gen ca h gen ty th cú xoỏy Thỏi Lan - Hiu... TP H CH MINH Hunh Th Bớch Liu XY DNG QUY TRèNH KHUCH I H GEN TY TH CHể Cể XOY LNG THI LAN BNG K THUT LONG- PCR V SO SNH QUAN H DI TRUYN GIA CHể Cể XOY LNG THI LAN V PH QUC Chuyờn ngnh: Sinh hc thc