BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Trần Thị Ái Liên NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ VAI TRÒ CỦA LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS TRONG CHẾ PHẨM PROBIOTIC LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - 2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Trần Thị Ái Liên NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ VAI TRÒ CỦA LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS TRONG CHẾ PHẨM PROBIOTIC Chuyên ngành: Vi sinh vật Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS TRẦN THANH THỦY Thành phố Hồ Chí Minh - 2011 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc đến: TS Trần Thanh Thủy, người tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên tạo điều kiện tốt cho hoàn thành tốt luận văn Sở Giáo dục Đào tạo tỉnh Bình Dương, Ban giám hiệu Trường Trung học phổ thông Bình Phú tạo điều kiện thuận lợi cho suốt khóa học Quý thầy cô Khoa Sinh học Trường Đại học Sư phạm Tp HCM tận tình dạy dỗ thời gian học cao học Quý thầy cô phụ trách phòng thí nghiệm Bộ môn Vi sinh–Sinh hóa, Sinh lý trường Đại học Sư phạm Tp Hồ Chí Minh Viện Sinh học nhiệt đới Tp Hồ Chí Minh hỗ trợ, động viên giúp đỡ trình thực thí nghiệm đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn bạn Trần Thị Minh Định, người tận tình giúp đỡ trình thực thí nghiệm đề tài chỉnh sửa luận văn Tôi xin cảm ơn anh Phan Văn Giác, anh Nguyễn Xuân Đức, em Đỗ Thị Thu Nga, em Lê Đình Hưng em Đặng Thị Tuyết nhiệt tình hỗ trợ, động viên suốt trình thực đề tài Tôi xin cảm ơn người thân gia đình, bạn bè, đồng nghiệp bên cạnh, ủng hộ Trần Thị Ái Liên LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu khoa học Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố công trình Các tài liệu tham khảo trích dẫn có nguồn gốc xác thực Tác giả luận văn Trần Thị Ái Liên MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN T T LỜI CAM ĐOAN T T MỤC LỤC T T DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT T T MỞ ĐẦU T T CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU T T 1.1 Tổng quan PROBIOTIC T T 1.1.1 Lược sử nghiên cứu T T 1.1.2 Các vi sinh vật probiotic thường gặp 10 T T 1.1.3 Đặc điểm chung vi sinh vật probiotic .12 T T 1.1.4 Cơ chế tác động chung probiotic 14 T T 1.1.5 Tình hình nghiên cứu sử dụng chế phẩm probiotic 16 T T 1.2.Vi khuẩn LACTIC 18 T T 1.2.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý phân loại .18 T T 1.2.2.Quá trình lên men lactic 22 T T 1.2.3 Tiêu chuẩn chọn chủng vi khuẩn lactic sử dụng làm probiotic 23 T T 1.2.4 Vai trò probiotic - lactic người 24 T T 1.2.5 Vai trò probiotic lactic vật nuôi 26 T T 1.2.6 Cơ chế tác động probiotic – lactic 28 T T 1.2.7 Ứng dụng vi khuẩn lactic 30 T T CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 T T 2.1 Vật liệu 32 T T 2.1.1 Nguyên liệu 32 T T 2.1.2 Hóa chất 33 T T 2.1.3 Thiết bị dụng cụ 33 T T 2.1.4 Môi trường nuôi cấy 33 T T 2.2 Phương pháp nghiên cứu 35 T T 2.2.1 Xác định khả sinh acid tổng MT cacbonat agar 35 T T 2.2.2 Phân lập từ môi trường MRS 36 T T 2.2.3 Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc [14] .36 T T 2.2.4 Phương pháp nhuộm Gram [14] 36 T T 2.2.5 Phương pháp khảo sát khả di động [15] .37 T T 2.2.6 Phương pháp xác định kiểu hô hấp [15] 37 T T 2.2.7 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính catalase [43] 38 T T 2.2.8 Phương pháp xác định hoạt tính protease [15] 38 T T 2.2.9 Phương pháp khảo sát khả sinh acid lactic [3], [11] 38 T T 2.2.10 Phương pháp khảo sát khả sinh bacteriocin .39 T T 2.2.11 Phương pháp khảo sát khả đề kháng chất KS LAB đĩa giấy KS chuẩn .40 T T 2.2.12 Phương pháp khảo sát khả chịu đựng pH thấp [14], [15] 41 T T 2.2.13 Khả chịu đựng acid mật [14] 41 T T 2.2.14 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến ST hoạt tính kháng khuẩn 42 T T 2.2.15 Ảnh hưởng pH ban đầu đến ST hoạt tính kháng khuẩn 42 T T 2.2.16 Ảnh hưởng nhiệt độ đến ST hoạt tính kháng khuẩn 43 T T 2.2.17 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy tĩnh, lắc đến ST hoạt tính kháng khuẩn 43 T T 2.2.18 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng nguồn cacbon MT nuôi cấy đến ST hoạt tính kháng khuẩn .43 T T 2.2.19 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng nồng độ glucose đến ST hoạt tính kháng khuẩn .44 T T 2.2.20 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng nồng độ cao nấm men lên ST hoạt tính kháng khuẩn 44 T T 2.2.21 Động thái trình sinh trưởng hoạt tính kháng khuẩn chủng LAB tuyển chọn .44 T T 2.2.22 Bảo quản giống vi khuẩn lactic phương pháp đông khô [14] [15] 45 T T 2.2.23 Xác định gián tiếp số lượng tế bào cách đếm số lượng khuẩn lạc mọc môi trường thạch [17] 45 T T 2.2.24 Phương pháp.định danh sinh học phân tử 46 T T CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 48 T T 3.1 Kết phân lập chủng Lactobacillus acidophilus 48 T T 3.1.1 Xác định khả sinh acid môi trường cacbonat agar 48 T T 3.1.2 Phân lập vi khuẩn lactic môi trường MRS .48 T T 3.2 Đặc điểm sinh học hai chủng LAB tuyển chọn .52 T T 3.2.1 Các đặc điểm hình thái chủng PA2 PP 52 T T 3.2.2 Các đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng PA2 PP .53 T T 3.3 Phổ kháng khuẩn chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu 56 T T 3.4 Khả chịu đựng điều kiện bất lợi đường tiêu hóa chủng LAB nghiên cứu 58 T T 3.4.1 Khả kháng chất kháng sinh 58 T T 3.4.2 Khả chịu đựng pH thấp .60 T T 3.4.3 Khả chịu acid mật 61 T T 3.5 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng hoạt tính kháng khuẩn chủng tuyển chọn 63 T T 3.5.1 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy 63 T T 3.5.2 Ảnh hưởng pH ban đầu 66 T T 3.5.3 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy 68 T 0T 3.5.4 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy tĩnh lắc 71 T T 3.5.5 Nguồn cacbon 73 T T 3.5.6 Nồng độ glucose 76 T T 3.5.7 Nồng độ cao nấm men 78 T T 3.6 Động thái trình tạo sinh khối tế bào chủng LAB điều kiện tối ưu 80 T T 3.7 Khả sống sót chủng vi khuẩn lactic sau đông khô 83 T T 3.8 Định danh đến loài phương pháp sinh học phân tử 84 T T KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 86 T T Kết luận 86 T T Kiến nghị 87 T T TÀI LIỆU THAM KHẢO 88 T T PHỤ LỤC 94 T T DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CFU Colony forming unit (mật độ tế bào) ĐC Đối chứng G- Gram âm P P G+ Gram dương KS Kháng sinh LAB Lactic Acid Bacteria (Vi khuẩn lactic) L Lactobacillus MT Môi trường MRS De Man - Rogosa - Sharpe OD Optical density (mật độ quang) ST Sinh trưởng VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật P P MỞ ĐẦU Ngày nay, với phát triển kinh tế xã hội, chất lượng sống không ngừng nâng cao, vấn đề chăm sóc sức khỏe người ngày trọng Do vậy, việc tạo chế phẩm sinh học nhằm cải thiện tăng cường sức khỏe người tạo ngày nhiều Một chế phẩm sinh học probiotic, chúng tạo từ việc ứng dụng vi sinh vật (VSV) có lợi bổ sung vào hệ tiêu hóa người Việc sử dụng VSV probiotic thực tế mang lại nhiều lợi ích to lớn sức khỏe người, thông qua đặc tính probiotic vốn có chúng Điển hình điều trị chứng bệnh rối loạn đường tiêu hóa, khắc phục số hạn chế việc điều trị kháng sinh dài ngày, giúp đồng hóa lactose sữa uống bệnh nhân khả dung nạp lactose sữa Bên cạnh đó, chúng có khả ảnh hưởng đến hoạt tính biến dưỡng đồng hóa cholesterol, tạo vitamin giải phóng enzyme có lợi giúp cho việc tiêu hóa thức ăn dễ dàng hơn, hấp thu chất dinh dưỡng cần thiết, khử chất có khả gây ung thư hợp chất độc hại, kích thích điều hòa hệ miễn dịch, tăng khả đề kháng cho thể chủ, Những chủng vi sinh vật probiotic thường nghiên cứu sử dụng chủ yếu vi khuẩn lactic nhờ có đặc tính ưu việt phù hợp cho việc sử dụng tạo chế phẩm probiotic cho người vật nuôi Những đặc tính là: khả sống sót phát triển tốt điều kiện bất lợi đường tiêu hóa người acid mật, pH thấp, kháng sinh, Đồng thời, chúng có khả sản sinh nhiều hoạt chất kháng khuẩn acid lactic, bacteriocin, H O , diacetyl,… tạo môi trường bất lợi, từ ức chế VSV gây bệnh thiết R R R R lập cân hệ VSV đường ruột Bên cạnh đó, chúng có khả sản sinh nhiều enzyme thúc đẩy trình tiêu hóa hấp thu chất thể vật chủ Trong số chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu làm probiotic chủng Lactobacillus acidophilus sớm biết đến nghiên cứu nhiều Đây chủng vi khuẩn phân lập Moro (1900) từ ruột người động vật, đặc biệt từ phân trẻ sơ sinh nuôi sữa mẹ Mặt khác, vi khuẩn có mặt hầu hết chế phẩm probiotic thị trường Xuất phát từ lí trên, chọn đề tài nghiên cứu cho là: “Nghiên cứu đặc điểm vai trò Lactobacillus acidophilus chế phẩm probiotic” Với mục tiêu: Nhằm tìm hiểu vai trò probiotic L acidophilus thông qua đặc điểm sinh học chủng Nhiệm vụ đề tài: Phân lập, tuyển chọn chủng L acidophilus từ chế phẩm probiotic dành cho người Tìm hiểu đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng L acidophilus Khảo sát phổ kháng khuẩn chủng L acidophilus với VSV gây bệnh đường ruột người Nghiên cứu khả tồn điều kiện bất lợi đường ruột Xác định điều kiện ST sinh chất đối kháng chủng L acidophilus tuyển chọn Nghiên cứu khả sống sót sau trình đông khô Phân loại đến loài chủng VK nghiên cứu sinh học phân tử pH sau Đồ thị 3.19 Động thái trình sinh trưởng sinh tổng hợp chất kháng khuẩn chủng Lactobacillus PA2 Đồ thị 3.20 Động thái trình sinh trưởng sinh tổng hợp chất kháng khuẩn chủng Lactobacillus PP Nhận xét: Khi nuôi cấy hai chủng Lactobacillus PA2 Lactobacillus PP điều kiện tối ưu khảo sát, nhận thấy:  Đối với chủng Lactobacillus PA2, thời điểm từ thời điểm 12 – 18 ST hoạt tính kháng khuẩn tăng nhanh, đạt cực đại thời điểm 36 ổn định đến thời điểm 48 Sau 48 giờ, ST hoạt tính kháng khuẩn bắt đầu có xu hướng giảm Ngược lại với tăng lên mật độ tế bào hoạt tính kháng khuẩn pH MT giảm dần từ thời điểm 12 – 48 giờ, sau có xu hướng tăng lên không đáng kể Do vậy, thu sinh khối tế bào tốt thời điểm từ 30 đến 36 giờ, giai đoạn chuyển từ pha logarit sang pha phát triển ổn định Tương tự, chủng Lactobacillus PP, ST hoạt tính kháng khuẩn bắt đầu tăng lên từ thời điểm 12 giờ, tăng nhanh đến thời điểm 36 giờ, đạt cực đại thời điểm 42 ổn định đến thời điểm 54 Bắt đầu có xu hướng giảm từ thời điểm sau 54 Sự thay đổi pH MT tỷ lệ nghịch với ST hoạt tính đối kháng Do vậy, thu sinh khối tế bào thời điểm từ 36 đến 42 Bảng 3.21 Tổng hợp điều kiện tối ưu để thu sinh khối hai chủng Lactobacillus PA2 Lactobacillus PP Điều kiện MT tối ưu Lactobacillus PA2 Lactobacillus PP MRS MRS 30 – 36 36 – 42 6,5 6,5 Môi trường Thời gian thu sinh khối pH ban đầu Nhiệt độ (0C) 350C – 370C 350C – 370C Nguồn cacbon glucose Glucose Nồng độ glucose (%) - 2% - 2% Nồng độ cao nấm men 1% 1% P P P P P P P P P P 3.7 Khả sống sót chủng vi khuẩn lactic sau đông khô Mục đích đông khô chủng VSV phương pháp bảo quản giống lâu dài làm nguồn nguyên liệu để tạo chế phẩm probiotic Chúng tiến hành khảo sát khả sống sót chủng Lactobacillus PA2 Lactobacillus PP sau trình đông khô, thời điểm 0; 15; 30; 45; 60; 75; 90 ngày phương pháp đếm khuẩn lạc môi trường thạch (như mục 2.2.23) Kết trình bày bảng 3.22 Bảng 3.22 Sự biến động số lượng tế bào hai chủng vi khuẩn lactic theo thời gian bảo quản đông khô Số lượng (CFU/g) Thời gian (ngày) 15 % 30 % 45 % Lactobacillus PA2 Lactobacillus PP 4,57 x109 4,38x109 9 P 4,39 x10 P P 4,12 x10 P 95,84 4,29x109 93,84 P 4,03x10 P 93,87 4,12 x109 90,15 91,80 90,88 P 3,99x10 P Số lượng (CFU/g) Thời gian (ngày) 60 Lactobacillus PA2 Lactobacillus PP % 75 4,11x109 90,00 3,97x109 90,50 P P % 90 3,65x109 79,87 3,45x109 75,49 3,44x109 78,36 3,26x109 74,26 P P % P P Nhận xét: Từ kết bảng 3.22 nhận thấy, tỷ lệ sống sót hai chủng sau đông khô là: thời điểm 15 ngày (≥ 93%), 60 ngày (≥ 90%) sau 90 ngày (≥ 74%) Khả sống sót sau đông khô tiêu chuẩn quan trọng VSV sử dụng làm probiotic Nhiều VSV probiotic phát huy vai trò probiotic chúng dạng sống Lúc đó, chúng có khả ST gia tăng số kượng tế bào sản sinh chất kháng khuẩn ức chế VSV gây bệnh, sản sinh vitamin, enzyme,… Do vậy, đặc tính sống sót cao sau đông khô có ý nghĩa quan trọng trình sử dụng để sản xuất chế phẩm probiotic bảo quản chúng thời gian dài Qua kết nhận thấy rằng, khả sống sót chủng sau trình đông khô cao so với kết nghiên cứu tác giả Trần Thị Mỹ Trang (2006), nghiên cứu khả sống sót chủng L acidophilus sau 90 ngày đông khô 20,17% 3.8 Định danh đến loài phương pháp sinh học phân tử Để khẳng định lại hai chủng thuộc loài L acidophilus nhãn chế phẩm, gửi hai chủng PA2 PP đến phòng xét nghiệm Công ty Nam Khoa – Thành phố Hồ Chí Minh, để định danh tiếp đến loài Kết định danh đến loài phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA tra cứu BLAST SEARCH Với chủng tiến hành định danh lặp lại hai lần, với hai lần phân lập độc lập (kết đính kèm phần phụ lục)  Chủng Lactobacillus PA2, kết giải trình tự gen 16S: CTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAGCA GAACCAGCAGATTTACTTCGGTAATGACGCTGGGGACGCGAGCGGCGGATGGGT GAGTAACACGTGGGGAACCTGCCCCATAGTCTGAGATACCACTTGGAAACAGGTG CTAATACCGGATAATAAAGCAGATCGCATGATCAGCTTATAAAAGGCGGCGTAAG CTGTCGCTATGGGATGGCCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTT ACCAAGGCAATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGAACGGCCACATTGGGACT GAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGG AGCCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAA GCTCTGTTGTTGGTGAAGAAGGATAGAGGTAGTAACTGGCCTTTATTTGAGCGTA ATCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTG Kết luận: Chủng Lactobacillus PA2 Lactobacillus suntoryeus với độ tương đồng 100%  Chủng Lactobacillus PP, kết giải trình tự gen 16S: TTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGC GAGCAGAACCAGCAGATTTACTTCGGTAATGAGCCTGGGGACGCGAGCGGCGGA TGGGTGAGTAACACGTGGGGAACCTGCCCCATAGTCTAGGATACCACTTGGAAAC AGGTGCTAATACCGGATAATAAAGCAGATCGCATGATCAGCTTATAAAAGGCGGC GTAAGCTGTCGCTATGGGATGGCCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAAC GGCTTACCAAGGCAATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGAACGGCCACATTGG GACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCAACA ATGGACGCAAGTCTGATGGACGAACGCCGCGTGAGTGAAGAGGGTTTTCGGATC GTAAAGCTCTGTTGTTGGTGAAGAAGGATAGAGGTAGTAACTGGCCTTTATTTGA CGGTAATCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTA Kết luận: Chủng Lactobacillus PP Lactobacillus helveticus với độ tương 99%, Lactobacillus acidophilus với độ tương đồng 97% Như vậy, chủng Lactobacillus PA2: Lactobacillus suntoryeus Chủng Lactobacillus PP: Lactobacillus helveticus Với chủng, tiến hành phân lập độc lập nhiều lần chế phẩm chứa thành phần L acidophilus định danh lặp lại hai lần Kết hai lần định danh chủng giống Thực tế, chế phẩm sử dụng chủng VK khác thuộc chi Lactobacillus mang đặc điểm tương tự thay cho loài Lactobacillus acidophilus nên thành phần VSV nhãn thuốc không Kết cảnh tỉnh việc sử dụng chế phẩm probiotic thị trường thuốc Tác dụng hiệu lâm sàng chế phẩm probiotic phụ thuộc gần hoàn toàn vào đặc tính sinh lý – sinh hóa VSV sử dụng Chỉ loài nghiên cứu lâm sàng đầy đủ bảo đảm an toàn lợi ích sử dụng chứng minh cách khoa học Vì vậy, việc công bố sai danh pháp VSV chế phẩm probiotic điều chấp nhận Để bảo đảm quyền lợi cho người tiêu dùng, cần phải có tiêu chuẩn kiểm tra sản phẩm chức mà tiêu định danh phải quan tâm mức, xây dựng đủ sở khoa học cho công tác kiểm nghiệm KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ thực nghiệm thu kết luận sau: - Từ 16 loại chế phẩm probiotic phổ biến thị trường thuốc Thành phố Hồ Chí Minh, phân lập đươc 31 chủng VK sinh acid chọn chủng Lactobacillus PA2 Lactobacillus PP có đặc điểm sinh học: thuộc chi Lactobacillus, tế bào hình que, G+ P , vi hiếu khí, lên men lactic đồng hình, catalase âm tính, không tạo hoạt tính protease, P bacteriocin âm tính, sản sinh acid lactic cao (1,46 -1,47 g/l) – Có hoạt tính đối kháng mạnh, phổ kháng khuẩn rộng với VSV kiểm định (gây bệnh đường ruột) Đặc biệt, có khả đối kháng số VK gây bệnh đường ruột kháng thuốc S aureus kháng methicillin, E coli kháng ampicillin - Có khả sống sót cao điều kiện bất lợi đường ruột người:  Khả đề kháng tốt với chất KS (điều trị bệnh đường ruột) ciprothokacin, neomycin, kanamycin, clindamycin  Khả chịu đựng pH thấp hai chủng cao: pH 1,5, tỷ lệ sống sót lớn 55% thời điểm 120 phút  Khả chịu acid mật chủng cao: - Ở nồng độ 0,5 – 1,0 % tỷ lệ sống sót cao: thời điểm1 (≥ 95%), thời điểm (≤ 39%), thời điểm 10 (≤ 35%) - Ở nồng độ acid mật 1,5 – 2% tỷ lệ sống sót thấp: thời điểm 10 (≤ 25%) - Đã xác định điều kiện MT nuôi cấy thích hợp cho tạo sinh khối, sinh chất kháng khuẩn chủng Lactobacillus PA2 Lactobacillus PP là: - Môi trường MRS - pH ban đầu: 6,5 - Nhiệt độ nuôi cấy: 350C – 370C P P - Nuôi cấy tĩnh - Nguồn cacbon glucose - Nồng độ đường glucose: 2% - Nồng độ cao nấm men: 1% P P - Thời gian tối ưu thu sinh khối 30 – 36 (chủng Lactobacillus PA2); 36 – 42 (chủng Lactobacillus PP) - Đã tiến hành thu sinh khối, đông khô kiểm tra độ sống sót chủng theo thời gian 90 ngày với tỷ lệ sống sót cao (lớn 73% chủng) - Kết nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa chủng PA2 PP, kết hợp kết định danh đến loài Công ty TNHH Dịch vụ Thương mại Nam Khoa – Thành phố Hồ Chí Minh Dựa vào khóa phân loại Bergey’s (1986) Okada (1992) kết luận: chủng Lactobacillus PA2 Lactobacillus suntoryeus; chủng Lactobacillus PP Lactobacillus helveticus Qua kết nghiên cứu nhận thấy rằng, chủng có mang đặc điểm sinh học phù hợp với vai trò probiotic Do vậy, sử dụng chúng để tạo chế phẩm probiotic cho nguời Tuy nhiên, thành phần VSV nhãn thuốc ghi không hoàn toàn thật Kiến nghị Xác định chất yếu tố đối kháng LAB với vi khuẩn kiểm định TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Kiều Hữu Ảnh (1999), Giáo trình Vi sinh vật học Công nghiệp, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr 100 – 108 Lý Kim Bảng, Lê Thanh Bình, Tạ Kim Chỉnh (1998), Ứng dụng vi khuẩn lactic bảo quản thức ăn xanh cho trâu bò, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp, tập 10, tr 455457 Nguyễn Thị Chính, Trương Thị Hòa (2005), Vi sinh vật y học, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1997), Vi sinh vật học, Nxb Giáo dục, tr 224-230 Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Yên Phùng Tiến, Đặng Đức Thạch, Phạm Văn Ty, Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập 1, Nxb Khoa học Kỹ thuật Hà Nội (1972), tr.86 – 178 Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo (1996), Vi sinh vật học, Nxb Giáo dục, tr 133138 Đào Trọng Đạt, Phan Thanh Phượng, Lê Ngọc Mỹ (1995), Bệnh đường tiêu hóa lợn, Nxb Nông nghiệp Hà Nội Trần Thanh Lan Hương, Phạm Thị Mai (2005), Hóa sinh y học, Nxb Y khoa Phạm Thị Minh Tâm (2008), Khảo sát định danh số sản phẩm probiotic có Lactobacillus acidophilus kit API 50CHL, Tạp chí Kiểm nghiệm thuốc, (20) 10 Nguyễn Hữu Phúc (1998), phương pháp lên men thực phẩm truyền thống Việt Nam nước vùng Nxb Nông nghiệp 11 Hồ Văn Thảo (2006), Phân lập, định danh tuyển chọn chủng enterococcus có tiềm probiotic từ phân trẻ sơ sinh, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên Tp HCM, tr 3-16 12 Trần Linh Thước, Đặng Thị Phương Thảo, Đỗ Anh Tuấn (2004), Giáo trình thực tập Bioinformatic, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Tp Hồ Chí Minh, Lưu hành nội 13 Lê Ngọc Tú, La Văn Chú, Phạm Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng (1982), Enzyme vi sinh vật Nxb Khoa học Kỹ thuật 14 Nguyễn Văn Thanh, Nguyễn Vũ Tường Vy, Trần Thu Hoa (2007), Khảo sát khả chịu đựng acid, muối mật KS số vi sinh vật nguyên liệu sản xuất probiotic đường uống, Tạp chí dược học (378) 15 Trần Thị Mỹ Trang (2006), Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn lactic để sản xuất chế phẩm probiotic phòng trị bệnh đường ruột cho heo, Luận văn Thạc sỹ.Sinh học Đại học Sư phạm Tp HCM 16 Trần Thanh Thủy (1998), Hướng dẫn thực hành Vi sinh vật học Nxb Giáo dục 17 Phạm Hùng Vân (2007), Bacilulus clausii vai trò probiotics điều chị tiêu chảy, Hội thảo chuyên đề Hội nhi khoa Tp HCM TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI 18 Bielecki, S., Krystynowics, A., Turkiewicz, M., Kalinowska, H., “Bacteria cellulose’’, Technical Universsity of Lodz, Stefanowskiego, Poland, pp 37-46 19 Borriello S.P., (1984), “Bacteria and gastrointestinal secretion and motility” Scand J Gastroenterol, vol 19, pp 114-121 20 Chuard C., and Reller L.B., (1998), “Bile – Esculin test for presiumptive identication of enterococci and streptococci: effect of bile concentration, inoculation technique, and incubation time” J Clin Microbial, vol 36, pp 1135 – 1136 21 Cai, Y., Kumai, S., Ogawa, M., Benno, Y & Nakase, T (1999), “Characterization and identifycation of Pediococcus species from forage crops and their applcation for silage preparation”, Appl Environ Microbiol 65, pp 2901-2906 22 Colum Dunne, Liam O,Mahony, Lisa Murphy, Gerardine Thornton, Darrin Morrissey, P P Sile O’Halloran, Maria Feeney, Sarah Flynn, Fergus Shanahan, and J Kevin Collins (2001), P P “In vitro selection criteria for probiotic bacteria of human origin: correlation with in vivo findings” American Society for Clinical Nutrition, pp 386-392 23 Carbonelle, F Denneis, A Marmonier, G Pion, R Vargues (1987), Bacteriologie medicale techniques usuelles, SIMEP SA Paris, France 24 Cabo M.L Murado , Gonzalez M.P and Patstoriza L (1999), “A method for bacteoricin quantification”, Journal of Applied Microbiology, vol 87, pp 907-914 25 Gusils C., Bujazha M and Gonzalez S., (2002), “Preliminary studies to desing a probiotic”, pp 273 -279 26.Goossens D.,Jonkers D.,Stobberingh E., Bogaard A., Russel M and Stockburgger R., (2003), “Probiotic in gastroenterology: Indications and future perspectives” Medical Microbiology, pp 15-20 27 Green Edward; Javed Muhammad and Grammell Renia (2003), “Lactic acid production”, World Intellual Property Organization, International Publication Number WO 03/008601, pp 20-23 28 Frank J C and Nino M (2002), “The Lactic Acid Bacteria” Microbiology, vol 28, pp 281-370 29 FAO/WHO Working Group (2002), “Guideline for the evaluation of probiotic in food” Food and Agriculture Organizatin of the United Nations 30 Heyman M., Menard S., (2002), “Probiotic microorganisms: how they affect intestinal pathphysiology” Cell Mol Life Sci, vol 59, pp 1-12 31 Klein G., (2003), “Taxonomy, ecology and antibiotic resistance of enterococci from food and the gastro – intestinal tract” International Journal of Food Microbiology, vol 88, pp 123-131 32 Kos B., Suskovic J., Vukovic S., Simpraga M., Frece J and Matosic S., (2003), “Adhesion and aggregation ability of probiotic strain Lactobacillus M92” Journal of Applied Microbiology, vol 94, pp 981-987 33 Karimi O and Pena A.S (2003), “Probiotic: isolated bacteria strain or mixture of different strain?” Drug of Today, vol 39, pp 565-597 34 Kakinuma Y., (1998), “Inorganic cation transpost and energy transduction in Enterococcus hirae and other streptococci” Microbiology and Molecular Biology, vol 62, pp 1021 -1045 35 Kos B., Suskovic J.,Vukovic S., Simpraga M., Frece J and Matosic S., (2003), “Adhesion and aggregation ability of probiotic strains Lactobacillus acidophilus M92” Journal of Applied Microbiology, vol 94, pp 981-987 36 Lane, D.J(1991), “16S/23S rRNA sequencing”, Nucleic acid techniques in bacterial systematic, pp 115-175 37 Luc De Vuyst, Fre, dri,c Leroy (2007), “Bacteriocins From lactic acid bacteria: P P P P production, and food applications”, J Mol Microbial Biotechnol, pp 194-199 38 Luc De Vuyst, Fre’dri’c Leroy (2007), “Bacteriocins from lactic acid bacteria: production, purification, and food applications”, J Mol Microbiol Biotechnol, pp 194-199 39 Laukova A, Strompfova V and Ouwehand A (, 2004), “Adhesion properties of Enterococci to intestinal mucus of different hosts” Veterinary Reseach Communication, vol 28, pp 647-655 40 Liong Min Tze (2006), “In-vivo and in-vitro cholesterol removal by Lactobacilli and Bifidobacteria”, A thesis submitted for the degree of Doctor of Philosophy, School of Molecu 41 Marcinakova M., Simonova M., Laukova A., (2004), “Probiotic properties of Enterococcus faecium EF9296 strain isolated from silsge” Bull Vet Inst Pulawy, vol 73, pp 513-519 42 Moore M R F., Saratinopoulos P., Tsakalidou E., De Vuyst L., (2006), “The role and application of enterococci in food and heath” International journal of food microbiology, vol 106, pp.1-24 43 M T Liong and N P Shah (2005), “Acid and bile tolerance and cholesterol removal ability of Lactobacillus strains”, American Dairy Science Association, pp 55-56 44 Mishra V.,Prasad D.N.,(2005), “Application of invitro methods for selection of Lactobacillus casei strains as potential probiotics” International journal of Food Microbiology, vol 103, pp.109-115 45 Naidu A.S, Bidlack W.R, and Clemens R.A., (1999), “Probiotic spectra of lactic acid bacteria (LAB)” Critical Review in Food Science and Nutrition, pp 13-126 46 Paula C, Teixeira M (1999) “Lactobacillus: Lactobacillus acidophilus” Encyclopedia of food Microbiology” Academic Press, San Diego, pp 112 -116 47 Raio A., Peluso R., Nesme X.and Zoina A (2004), “Chromosome and plasmid diversity of Agrobacterium strains isolated from Ficus benjamina tumor”, European Journal of Plant Pathology, vol 110, pp 163-174 48 Seppo Salminen (1997), “Lactic acid bacteria”, Univerof turku, Finland 49 Song J.,Lee S –C, Kang J –W.,Beak H-J, Suh J –W (2004), “Phylogenetic analysis of Streptomyces spp Isolated from potato scab lesions in Korea on basis of 16S rDNA gen and 16S-23S rDNA internally transceibed spacer seuqnces”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, vol.54, pp 203-209 50 Stackebrandt E.Frederiksen W.,Grarrity G.M., Grimont P.A.D.,Kampfer P.,Maiden M.C.J.,Nesme X.,Rossello-Mora R.,Swings J, TruperH.,G.,Vauterin L.,Ward A C.,Whitman W.B (2002), “Report of the adhoc committee the re-evalution of the species definition in bacteriology”, International Journal of Systematic and Evolutionnary Microbiology, vol 52, pp 1043-1047 51 Saarela M.,Mogensen G., Fonde R.,(2000), “Probiotic bacteria: safety functional and technological properties” Journal of Biotechnology, vol 84, pp 197-215 52 Song J., Lee S.-C, Kang J.-W., Beak H.-J, Suh J.-W (2004), “Phylogenetic analysis of Streptomyces spp Isolated from potato scab lesion in Korea on basis of 16S rDNA gen and 16S -23S rDNA internally transceibed spacer seuqnces”, International Journal of Systermatic and Evolutionnary Microbiology, vol.54, pp 203-209 53 S Oh, S H Kim, and R W Worobo (2000), “Characterization and purification of a bacteriocin produced by a potential probiotic culture, Lactobacillus acidophilus 30SC”, J Dairy Sci, pp.2747-2752 54 Stackebrandt E.Frederiksen W.,Grarrity G.M., Grimont P.A.D.,Kampfer P.,Maiden M.C.J.,Nesme X.,Rossello-Mora R.,Swings J, TruperH.,G.,Vauterin L.,Ward A C.,Whitman W.B (2002), “Report of the adhoc committee the re-evalution of the species definition in bacteriology”, International Journal of Systematic and Evolutionnary Microbiology, vol 52, pp 1043-1047 55 Ouwehand A.C., Salminen S.,Isolauri E.,(2002), “Probiotics: an overview of beneficial effects” Antonie van Leeuwenhoek, vol 82, pp 279 -289 56 Young Ju Kim, Ji Hee Kang, Ji Sunlee & Myung Suklee (2001), “Study on the bacteriocin produced by Lactobacillus sản phẩm GM 7311” Department of Microbiology college of nature Science Pukyong National University 57 Yuan Kun Lee, Koji Nomoto, Seppo Salminen, Sherwood L Gorbach (1999), “Handbook of probiotis”, John Wiley & Sons 58.Yeung P.S.M , M E Sanders, C.L Kitts, R Cano and P.S.Tong “Species- SpeciesSpecific indentification of Commercial Probiotic” Strains J Dairy Sci pp 1039 – 1051 59 Wood B.J.B and Holzapfel W.H (1995), “the genera of lactic acid bacteria”, Blackie Ademic and Professional, London, pp 19-48 TÀI LIỆU INTERNET 60 http:// www.enterococcus.ouhssc.edu T T 61 http:// www.fao.org/es/ESN/Probio.htm 62 http:// www.mesanders.com (probiotic basics) 63 http:// en.wikipedia.org/wiki/Probiotic.html T T 64 http:// apresslp.gvpi.net/zpfmicro/lpext.dll/fmicro/a890-Ink 65 http:// www.baomoi.com 66.http:// vietbao.vn/Suc-khoe 67 http:// tintuc.timnhanh.com/xa-hoi/20100802/35AA93FB 68 http://diaglab.vet.cornell.edu/clinpath/modules/chem/bileacids.htm 69 http:// apresslp.gvpi.net/zpfmicro/lpext.dll/fmicro/a890-Ink 70 http:// www.gut.bmjjournals.com PHỤ LỤC Giá trị tương quan OD 610 với số lượng tế bào chủng Lactobacillus PA2 R R Stt Mật độ tế bào (OD 610nm ) Số lượng tế bào 0,1 3541600 0,2 6737500 0,3 9250000 0,4 15075000 0,5 18625000 0,6 24700000 0,7 28250000 R R Đồ thị Đường tương quan tuyến tính OD 610 với số lượng tế bào chủng Lactobacillus PA2 R R Bảng: Tương quan thời gian mật độ tế bào hai chủng Lactobacillus PA2 Lactobacillus PP Stt Thời gian OD 610 (giờ) Lactobacillus PP Lactobacillus PA2 R 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51 54 57 60 63 66 69 72 75 78 81 84 87 90 93 96 0,032 0,032 0,033 0,063 0,364 1,050 1,676 1,980 2,224 2,290 2,346 2,378 2,428 2,484 2,515 2,515 2,515 2,516 2,515 2,515 2,488 2,467 2,434 2,401 2,364 2,343 2,311 2,305 2,305 2,299 2,294 2,288 2,277 0,025 0,025 0,032 0,038 0,503 1,415 2,114 2,334 2,448 2,515 2,582 2,612 2,657 2,657 2,656 2,656 2,656 2,648 2,638 2,604 2,558 2,515 2,438 2,412 2,388 2,380 2,372 2,336 2,352 2,344 2,337 2,334 2,230 Đồ thị Đường cong sinh trưởng chủng Lactobacillus PA2 Đồ thị Đường cong sinh trưởng chủng Lactobacillus PP [...]... lactase và tăng nồng độ β-galactosidase ở ruột non Do vậy, người ta cho các bệnh nhân không dung hòa được lactose sử dụng probiotic Các dòng probiotic sẽ thủy phân lactose trong sữa uống và lactose sẽ được đồng hóa, đồng thời canxi cũng được hấp thu [53] 1.1.5 Tình hình nghiên cứu và sử dụng các chế phẩm probiotic Chế phẩm probiotic hiện nay rất đa dạng với nhiều hình thức khác nhau Một trong những chế phẩm. .. vì những đặc tính ưu việt của vi khuẩn lactic (LAB) phù hợp với việc tạo chế phẩm probiotic cho người cũng như vật nuôi nên thành phần của hầu hết các chế phẩm probiotic hiện nay chủ yếu là các chủng LAB Một số nhóm vi sinh vật probiotic thường gặp: Nhóm vi khuẩn lactic: Theo Lee, Nomoto, Salminen và Gorbach (1999), một số loại chế phẩm probiotic được biết đến nhiều nhất với các chủng LAB, trong đó... học Probiotic Rối loạn tính thấm của ruột Bình thường hóa nhờ vi khuẩn lactic Hình 1.1 Tác động của probiotic trong điều trị các chứng rối loạn đường tiêu hóa (Selminen, 1998) 1.2.5 Vai trò probiotic lactic đối với vật nuôi  Cải thiện tăng trưởng và hệ số chuyển hóa thức ăn Sử dụng probiotic trong chăn nuôi gia súc và gia cầm sẽ làm tăng hiệu quả kinh tế cho người sản xuất Phần lớn các chế phẩm probiotic. .. quả LAB trong việc tạo ra nhiều chế phẩm probiotic hổ trợ đường tiêu hóa, điều trị tiêu chảy giúp duy trì cân bằng hệ VSV đường ruột cho người cũng như vật nuôi CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu 2.1.1 Nguyên liệu  Chế phẩm probiotic Các chế phẩm probiotic thông dụng trên thị trường hiện nay có chứa vi khuẩn L acidophilus, gồm: 1 Antibio Tropical Granule (Hàn Quốc): L acidophilus. .. dịch IgA của cơ thể (IgA là kháng thể sản sinh nhờ tế bào B trong niêm mạc ruột, đường hô hấp và thực hiện chức năng chống VK trên bề mặt niêm mạc) [2], [13], [15], [56]  Vai trò probiotic - lactic đối với sự tiêu hóa lactose và protein trong sữa Vi sinh vật probiotic – lactic có vai trò quan trọng đối với việc đồng hóa lactose và protein trong sữa, nhờ khả năng khả năng sản sinh enzyme lactase và protease...CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về PROBIOTIC 1.1.1 Lược sử nghiên cứu Lịch sử nghiên cứu probiotic bắt đầu trong những năm cuối thế kỷ 19, khi các nhà vi sinh vật học phát hiện ra sự khác biệt giữa hệ VSV trong ống tiêu hóa của người bệnh và người khỏe mạnh Hệ vi sinh vật có ích trong hệ thống ống tiêu hóa được gọi là probiotic Năm 1870, khi nghiên cứu tại sao những người nông dân Bungary có... làm giảm số lượng lớn E coli trong dạ dày và tá tràng Khi chỉ dùng L fermentum 14, cũng có tác dụng làm giảm số lượng E coli trong dạ dày [56] Hoặc trong nhiều nghiên cứu khác cho thấy, khi cho những bệnh nhân rối loạn tiêu hóa sử dụng probiotic chứa thành phần vi khuẩn L acidophilus, B bifidum và B breve sẽ làm gia tăng số lượng của Lactobacillus và giảm số lượng của E.coli trong ruột Còn khi cho bệnh... Đặc biệt, các sản phẩm này đã bổ sung nhầm VK gây hại vào các chế phẩm probiotic Điển hình là chế phẩm Biosubtyl DL (dạng gói bột do Viện Vắc xin Đà Lạt sản xuất) và chế phẩm Subtyl (dạng viên nén, sản xuất tại Việt Nam) Hai chế phẩm đã ghi thành phần trên nhãn là vi khuẩn B subtilis, nhưng thực tế lại là Bacillus cereus, một loài VK gây bệnh đường tiêu hóa do có nhiều dòng mang độc tố gây nôn ói và. .. Yeung P.S.M và cộng sự, có một số sản phẩm thương mại probiotic ghi trên nhãn không đúng với nội dung (xem bảng 1.1), có đến 28/44 sản phẩm nghiên cứu có tên không đúng với nội dung ghi trong nhãn, trong đó có 9/16 sản phẩm trên nhãn là L acidophilus nhưng khi kiểm nghiệm bằng phương pháp lên men carbonhydrat lại cho kết quả là một loài khác [9], [58] Bảng 1.1 Kết quả khảo sát một số chế phẩm probiotic. .. trị bệnh lây nhiễm đường ruột Các nghiên cứu gần đây đã tập trung vào lợi ích sức khỏe khác của các VSV này, cũng như về bảo đảm sự sống sót của các VK này khi ở trong vùng dạ dày - ruột và các loại thực phẩm để vận chuyện chúng vào trong cơ thể con người (Lourens - Hattingh và Viljoen, 2001) 1.1.2 Các vi sinh vật probiotic thường gặp Vi sinh vật được sử dụng làm probiotic gồm nhiều nhóm khác nhau ... hết chế phẩm probiotic thị trường Xuất phát từ lí trên, chọn đề tài nghiên cứu cho là: Nghiên cứu đặc điểm vai trò Lactobacillus acidophilus chế phẩm probiotic Với mục tiêu: Nhằm tìm hiểu vai. ..BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Trần Thị Ái Liên NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ VAI TRÒ CỦA LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS TRONG CHẾ PHẨM PROBIOTIC Chuyên ngành: Vi... tìm hiểu vai trò probiotic L acidophilus thông qua đặc điểm sinh học chủng Nhiệm vụ đề tài: Phân lập, tuyển chọn chủng L acidophilus từ chế phẩm probiotic dành cho người Tìm hiểu đặc điểm sinh lý,