BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH NGUYỄN THỊ THU SƯƠNG NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP TẾ BÀO TIỀN THÂN NỘI MÔ TỪ MÁU CUỐNG RỐN NGƯỜI BIỂU HIỆN GEN gfp (GREEN FLUORESCENT PROTEIN) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH NGUYỄN THỊ THU SƯƠNG NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP TẾ BÀO TIỀN THÂN NỘI MÔ TỪ MÁU CUỐNG RỐN NGƯỜI BIỂU HIỆN GEN gfp (GREEN FLUORESCENT PROTEIN) Chuyên ngành: Sinh Học Thực Nghiệm Mã số: SHTN-08-005 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS DƯƠNG THỊ BẠCH TUYẾT Thành phố Hồ Chí Minh – 2011 LỜI CAM ĐOAN “Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết luận văn trung thực chưa nghiên cứu luận văn khác.” Nguyễn Thị Thu Sương LỜI CẢM ƠN Hoàn thành luận văn này, nổ lực phấn đấu, chịu khó học hỏi, nghiên cứu thân, có nhiệt tình giảng dạy thầy cô suốt trình học tập Các cán bộ, em sinh viên thực tập phòng Thí nghiệm ứng dụng tế bào gốc-Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Thành Phố Hồ Chí Minh, bạn khóa giúp đỡ, động viên hoàn thành luận văn Tôi xin cảm ơn ThS Phan Kim Ngọc, ThS Phạm Văn Phúc thầy cô động viên, giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho hoàn thành luận văn Đặc biệt xin chân thành cảm ơn TS Dương Thị Bạch Tuyết tận tình dìu dắt, hướng dẫn suốt trình thực luận văn Tôi xin cảm ơn Nguyễn Thanh Tâm, Vũ Bích Ngọc Phan Lữ Chính Nhân Các em sát cánh bên tôi, giúp đỡ, động viên chia sẻ khó khăn thời gian nghiên cứu Xin chân thành cảm ơn gia đình Đây nguồn động lực lớn cho trình học tập nghiên cứu Trong trình nghiên cứu, hạn chế thời gian điều kiện nên luận văn không tránh khỏi sơ suất Kính mong đóng góp nhiệt tình quí thầy cô bạn bè TP Hồ Chí Minh, tháng 11/2011 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN T T LỜI CẢM ƠN T T MỤC LỤC T T DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT T T MỞ ĐẦU 10 T T LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI 10 T T MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU 10 T T 3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 11 T T ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 11 T T Ý NGHĨA CỦA NGHIÊN CỨU 11 T T CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 13 T T 1.1 Sơ lược tế bào gốc 13 T T 1.1.1 Định nghĩa .13 T T 1.1.2 Đặc điểm 13 T T 1.1.3 Lịch sử nghiên cứu [1] 14 T T 1.1.4 Phân loại 15 T T 1.1.5 Ứng dụng .15 T T 1.2 Tế bào tiền thân nội mô .17 T T 1.2.1 Định nghĩa .17 T T 1.2.2 Sơ lược nghiên cứu tế bào tiền thân nội mô .17 T T 1.2.3 Nguồn tế bào tiền thân nội mô 19 T T 1.2.4 Đặc điểm tế bào tiền thân nôi mô 21 T T 1.2.5 Marker tế bào tiền thân nội mô .22 T T 1.2.6 Động học tế bào tiền thân nội mô 23 T T 1.2.7 Liệu pháp tế bào gốc điều trị bệnh tim mạch 25 T T 1.3 Green fluorescent protein 27 T T 1.3.1 Lịch sử nghiên cứu 27 T T 1.3.2 Đặc điểm 28 T T 1.3.3 Ứng dụng .28 T T 1.4 Chuyển gen 29 T T 1.4.1 Chuyển gen phương pháp hóa học (chemical transfection) 30 T T 1.4.2 Chuyển gen phương pháp vật lý (physical transformation) 32 T T 1.4.3 Phương pháp chuyển gen sử dụng vector virus .33 T T 1.5 Chuyển gen vào tế bào tiền thân nội mô 34 T T 1.5.1 Nghiên cứu chuyển gen vào tế bào tiền thân nội mô 34 T T 1.5.2 Chuyển gen vào tế bào tiền thân nội mô vector virus 35 T T CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 38 T T 2.1 Vật liệu 38 T T 2.1.1 Mẫu vật – Địa điểm – Thời gian nghiên cứu .38 T T 2.1.2 Vector Lentivirus: copGFP Lentivirus mua từ Công ty Santa Cruz Biotechnology, USA sử dụng để biểu gen phát quang màu xanh tế bào động vật có vú So với GFP, copGFP Lentivirus phát quang mạnh ổn định gấp 1,3 lần .38 T T 2.1.3 Hóa chất 38 T T 2.1.4 Dụng cụ thiết bị 40 T T 2.2 Phương pháp nghiên cứu 42 T T 2.2.1 Thu nhận máu cuống rốn người 42 T T 2.2.2 Phương pháp li tâm thu nhận tế bào đơn nhân từ máu cuống rốn người 42 T T 2.2.3 Phương pháp nuôi cấy chọn lọc tế bào tiền thân nội mô ứng viên từ máu cuống rốn người 43 T T 2.2.4 Phương pháp flow cytometry [21], [45] 44 T T 2.2.5 Phương pháp chuyển gen gfp vào tế bào tiền thân nội mô vector Lentivirus 45 T T 2.2.6 Phương pháp đánh giá biểu protein GFP .45 T T 2.2.7 Phương pháp chọn lọc tế bào kháng puromycin 45 T T 2.2.8 Phương pháp xử lý số liệu .46 T T CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 48 T T 3.1 Thu nhận máu cuống rốn người .48 T T 3.2 Thu nhận tế bào đơn nhân từ máu cuống rốn người .48 T T 3.3 Nuôi cấy chọn lọc tế bào tiền thân nội mô ứng viên .49 T T 3.4 Kết định danh tế bào tiền thân nội mô .55 T T 3.5 Chuyển gfp vào tế bào tiền thân nội mô vector Lentivirus 58 T T 3.5.1 So sánh kết chuyển gen 61 T T 3.5.2 Kiểm tra kết chuyển gen gfp trước chọn lọc puromycin 62 T T 3.5.3 Kiểm tra kết chuyển gen gfp sau chọn lọc puromycin 63 T T 3.6 Đánh giá thay đổi tính gốc tế bào sau chuyển gen gfp 65 T T KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67 T T TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 T T PHỤ LỤC 74 T T DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ACEI Angiotensin converting enzyme Ức chế enzym chuyển đổi agiotensin inhibitor Cord blood- derived embryonic- Tế bào gốc giống tế bào gốc phôi thu like stem cell từ máu cuống rốn Cord blood- multipotent Tế bào tiền thân đa máu cuống progenitor cell rốn CD Cluster of differentiation Sự khác biệt cụm CEC Circulating endothelial cell Tế bào nội mô tuần hoàn CSC Cardiac stem cell Tế bào gốc tim DEAE Dextran diethylaminoethyl- CBE CB -MPC dextran EC Endothelial cell EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid EGM-2 Endothelical cell growth Tế bào nội mô Medium-2 EPC Endothelial progenitor cell Tế bào tiền thân nội mô ES Embryonic stem cell Tế bào gốc phôi FACS Fluorescent activated cell sorting Tách tế bào hoạt hóa huỳnh quang FBS Fetal bovine serum Huyết bào thai bò GFP Green Flourescent Protein Protein huỳnh quang màu xanh HBV Hepatitis B virus Virut siêu gan B HCV Hepatitis C virus Virut siêu gan C HEGF Human recombinant Epidermal Nhân tố tăng trưởng biểu bì tái tổ Growth Factor hợp người HFGF-B HIV Human Fibroblast Growth Factor- Nhân tố tăng trưởng nguyên bào sợi Basic người Human immunodeficiency virus Virút gây suy giảm miễn dịch người HMG-coA 3- hydroxyl-3- methylglytaryl coenzim A reductase HSC Hemapoietic stem cell Tế bào gốc tạo máu Long R3- Human recombinant insulin-like Nhân tố tăng trưởng giống insulin tái IGF-1 growth factor tổ hợp người LTR Long terminal repeat Trình tự lặp lại cuối dài MNC Mononuclear cell Tế bào đơn nhân MSC Mesenchymal stem cell Tế bào gốc trung mô PBS Phosphate - buffered saline Dung dịch muối đệm photphat SCs Stem cells Tế bào gốc SDF-1 Stroma-derived factor-1 Nhân tố thu nhận từ tế bào USSC Unrestrictedsomatic stem cell Tế bào gốc sinh dưỡng không giới hạn VE Vascular Endothelial Nội mô tạo mạch VEGF Vascular Endothelial Growth Nhân tố phát triển nội mạch Factor MỞ ĐẦU LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Bệnh tim mạch bệnh có tỷ lệ mắc phải khả gây tử vong hàng đầu cho nhân loại Đã có nhiều phương pháp chữa trị bệnh tim giúp người bệnh vựợt qua hiểm nghèo khả phục hồi chức thấp Vì thế, việc tìm phương pháp hiệu cho điều trị bệnh tim mạch cấp thiết Hiện giới, công nghệ tế bào gốc nghiên cứu ứng dụng y sinh học, kết nghiên cứu cận lâm sàng cho thấy khả điều trị bệnh tim mạch liệu pháp tế bào gốc có hiệu đáng khích lệ Trong đó, tế bào tiền thân nội mô loại tế bào gốc đơn có khả biệt hóa thành tế bào nội mô trưởng thành tế bào nội mô tham gia vào trình hình thành mạch, sửa chữa mạch Chính vậy, nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc nội mô cho việc điều trị bệnh tim mạch giải pháp đầy triển vọng Tủy xương, máu ngoại vi, máu cuống rốn nguồn chủ yếu thu nhận tế bào tiền thân nội mô Tuy nhiên, việc thu nhận tế bào gốc từ tủy xương máu ngoại vi gây đau đớn cho bệnh nhân lượng tế bào tiền thân nội mô lại không nhiều Trong đó, nguồn máu cuống rốn lại dồi tế bào gốc mà quần thể tế bào gốc có diện tế bào tiền thân nội mô Hơn nữa, việc thu nhận máu cuống rốn đơn giản, không đau, không vi phạm chuẩn mực đạo lí Trên giới, tế bào tiền thân nội mô thu nhận từ máu cuống rốn người vào năm 2003 (Eggemann cộng sự) đến năm 2005 (Ott cộng sự) có trình công bố cấy ghép tế bào tiền thân nội mô nghiên cứu điều trị bệnh tim mạch Ở Việt Nam năm gần việc nhiên cứu tế bào gốc máu cuống rốn ý Nhưng chưa có báo cáo thu nhận, nuôi cấy tế bào tiền thân nội mô theo dõi di cư, biệt hóa tế bào tiền thân nội mô trình cấy ghép Do đề tài: “Nghiên cứu thiết lập tế bào tiền thân nội mô từ máu cuống rốn người biểu gen gfp (Green fluorescent protein)” tiến hành MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU Nhằm mục đích làm tiền đề cho nghiên cứu luận văn tiến hành nghiên cứu xây dựng qui trình thu nhận tế bào tiền thân nội mô từ máu cuống rốn người thiết lập Ủ EPC-GFP với puromycin nhằm loại bỏ EPC mang gen gfp chưa sát nhập vào gen EPC, sau 24 kiểm tra kết phương pháp flow cytometry Kết biểu hình 3.16 Hình 3.16 Kết sau chọn lọc puromucin kỹ thuật flow cytometry copGFP Lentivirus có mang gen kháng puromycin EPC mang gen gfp có khả kháng puromycin Sau 24 ủ puromycin, EPC không mang gen kháng puromycin chết lơ lửng dịch nuôi EPC mang gen kháng puromycin sống phát triển Kết chọn lọc puromycin sau 24 cho thấy có phân thành hai vùng rõ rệt, vùng tế bào biểu dương tính (98,13%) với gen gfp vùng biểu âm tính (1,87%) với gen gfp Vector Lentivirus chuyển gen gfp vào nhân EPC, gen gfp sát nhập vào gen EPC, gen gfp gen kháng puromycin hoạt động hiệu EPC-GFP biểu âm tính với tính hiệu huỳnh quang chúng sống sót chứng tỏ gen kháng puromycin gắn vào gen EPC hoạt động có hiệu gen gfp gắn vào gen EPC gen gfp không tạo sản phẩm protein GFP nên tế bào không phát tín hiệu huỳnh quang Chuyển gen gfp vào EPC vector Lentivirus + polybrene kết hợp với chọn lọc puromycin kết có hiệu suất 98,13% cao so với kết nghiên cứu L Cheng cộng [32] chuyển gen gfp vào HSC thu 28% dương tính với GFP 3.6 Đánh giá thay đổi tính gốc tế bào sau chuyển gen gfp Trong kỹ thuật chuyển gen, gen mục tiêu chèn vào gen tế bào gốc cách ngẫu nhiên làm thay đổi tính gốc tế bào Do việc kiểm tra tính gốc tế bào sau chuyển gen phương pháp flow cytometry với marker CD14, CD34, CD90, CD133 thực hiện, kết thể hình 3.17 Hình 3.17 Kết kiểm tra tính gốc EPC-GFP Kết kiểm tra tính gốc EPC-GFP trình bày bảng 3.4 Bảng 3.4 Tỷ lệ EPC-GFP biểu với marker khảo sát Marker bề mặt Tỷ lệ tế bào dương tính với marker Tỷ lệ tế bào âm tính với marker (%) (%) CD14 0,98 99,02 CD34 54,19 45,81 CD90 1,21 98,79 CD133 58,46 41,54 Kết thu cho thấy EPC-GFP thể dương tính với marker CD34, CD133; âm tính với CD14, CD90 tương tự kết định danh EPC mục 3.4 Như sau gắn gen gfp vào gen EPC, tính gốc tế bào không thay đổi KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu rút kết luận sau: Thu nhận tế bào tiền thân nội mô từ máu cuống rốn người thực phương pháp làm giàu tế bào đơn nhân li tâm gradient Ficoll-paque kết hợp nuôi cấy chọn lọc môi trường EGM-2 cho quần thể tế bào tương đối tinh ổn định từ lần cấy chuyền thứ Kết hợp kiểm tra hình thái kiểm tra marker bề mặt tế bào tiền thân nội mô ứng viên biểu dương tính với CD34 57,89 ± 12,76%, CD133 60,93 ± 7,01% Kết chuyển gen copGFP Lentivirus + polybrene cho hiệu cao (48,89 ± 3,89%) Tế bào tiền thân nội mô biểu GFP ổn định với hiệu 98,13% Sau gắn gen gfp vào gen EPC, tính gốc tế bào không thay đổi KIẾN NGHỊ Tiếp tục nuôi cấy tăng sinh bảo quản dòng tế bào EPC biểu GFP ổn định phục vụ cho nghiên cứu Đánh giá tính gốc tính ổn định dòng EPC qua thời gian nuôi cấy lâu dài TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Phan Kim Ngọc, Phạm văn Phúc, Trương Định (2009), Công nghệ tế bào gốc, Nxb Giáo Dục, 556 trang Khuất Hữu Thanh (2004), Liệu pháp gen - Nguyên lý ứng dụng, Nxb Khoa học kỹ thuật, trang 24 -35 Khuất Hữu Thanh (2010), Cơ sở công nghệ tế bào động vật ứng dụng, Nxb Khoa học kỹ thuật, trang 43 -50 Tiếng Anh Anna M Wobus Kesneth Boheler (2005), Stem cell (Handbook of experimental pharmacology), Springer, Germany Anotonio M.L., Marco V., Maria B.G., Vincenzo Z., Matteo P., Domenico D.A., Antonio G.R., Filippo C (2009), From bone marrow to the arterial wall: the ongoing tale of endothelical progenitor cells European Heart Journal 30, 890-899 Ariff B., Eng Hin Lee (2005), Stem cells from bench to beside, Word scientific, Singapore Ariris P., Peter v.G (2008), “Biological considerations of mesenchymal stem cells and endothelical progenitor cells”, Injury-international Journal of The Care of The Injured 39S2, S21-S32 Ashay D B., Josephine V.G., Gang L., Tim M.C., Tom A.G.,Alan W S (2008), “Advanced glycation of fibronectin im pairs vascular repain by endothelial progenitor cells: Implications for vasodegeneration in diabetic retinopathy”, Invertigative Ophthalmology & Visual Science 49, 1232-1241 Carmen U., Stefanie D (2004), “Endothelial progenitor cells: Charaterization and role in vascular biology”, Circulation Research 95, 343-353 10 Crestwood Place Richmond, BC, Canada V6V 2G2 Retroviral and Lentiviral Infection of Target Cells Protocol, Applied Biological Materials Inc 11 Daniel P.S., Andrew B., David S.C., Martin K.C (2008), “Strikingly different angiogenic properties of endothelical progenitor cells subpopulations”, Journal of the American College of Cardiology vol 51, 660-668 12 Daniel P.G., Stefan A., Christian A.B., Ulrike G.S., Bernhard G., Joachim W., Gu¨nter A.J, ( 2003), “Riegge V ascular gene delivery of anticoagulants by transplantation of retrovirally-transduced endothelial progenitor cells”, Cardio-vascular Research 58, 469–477 13 DA Dean, D Machado-Aranda, K Blair- Parks, AV Yeldandi, JL Young (2003), “ Electroporation as a method for high- level nonviral gene transfer to the lung”, Gene therapy 10, 1608-1615 14 David A.I., Laura E.M., Hiromi T., Virginia M., Amy F., Kelly M., Karen P., Michael J.F., David G., Mervin C.Y (2004), “Identification of novel hierarchy of endothelical progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood”, Blood 104, 27522760 15 Ekaterina K., Joseph D.R., Vicente P (1999), “Lentiviral vectors and gene therapy”, Frontiers in Bioscience 4, d481-496 16 Femke H., Arjan W.G (2007), “Tumour vascularization: sprouting angiogenesis and beyond”, Canner and Metastasis Reviews 26 , 489-502 17 Gain P.F., Carlo A., Angelo A (2005), “Endothelial Progenitor Cells and vascular Biology in Diabetes Mellitus: Current Knowledge and Future Prespectives”, Current Diabetes Reviews 1, 41-58 18 Gerald J.S (2003), “Stem cells and tissue regeneration when is a stem cell really a stem cell?”, Bone Marrow Transplantation 32, S7-S11 19 Gian P.F., Carlo A., Angelo A (2007)., “Endothelial progenitor cells in coronary artery disease”, Journal of the American College of Cardiology 49, 1585 20 Gustavo Tiscornia, Oded Singer, Inder M verma (2006), “Production and purification of lentivirus vector”, Nature protocol 1, 241-245 21 Hawley, Robert C.; Teresa S Hawley (2004) Flow Cytometry Protocol Humana Press 22 Heidi Bompais, Jalila Chagraoui, Xavier Caron, Mihaela Crisan, Xu Hui Liu, Aurora Anjo, Carine Tolla-Le Port, Marylene Leboeuf, Pierre Charbord, Andreas Bikfalvi and Georges Uzan (2004), “Human endothelial cells derived from circulating progenitors display specific functional properties compared with mature vessel wall endothelial cells”, Blood 103, 2577-2584 23 Hidesuke Yamamoto, Hidefumi Kato, Motoaki Uruma, Masakazu Nitta, Shigeru Takamoto (2008), “Identification of two distinct populations of endothelial progenitor cells differing in size and antigen expression from human cord blood”, Ann Hematol 87, 87-95 24 HU Cheng Heng, LI Zhi- ming, DU Zhi-min, ZHANG Ai-xia, YANG Da-ya and WU Gui-fu (2009), “Human umbilical cord- derived endothelial progenitor cells promote growth cytokines- mediated neorevascularization in rat myocardial infarction”, Chinese Medical Journal 12 (25), 548-555 25 Jason H.C., Charles L.C., Candace C.C., (1990), Issues about the human umbilical cord, Silent Risk, North America 26 Juliane E., Stefanie K., Gergely J., Karin H., Ulrike M.B., Klaus M.D., Johannes W., Christian B (2003), “Endothelial progenitor cell cuture and differentiation in vitro: a methodological comparison using human umbilical cord blood”, Cardiovascular Research 58, 478-486 27 Jin Hur, Chang- Hwan Yoon, Hyo- Soo Kim, Jin- Ho Choi, Hyun- Jea Kang, kyungKook hwang, Byung- Hee Oh, Myoung- Mook Lee and Young-Bea Park (2004), “Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis”, Arterioscler Thromb Vasc Biol 24, 288-293 28 Ju-Yeon Kim, Hong Bea Jeon, Yoon Sun Yang, Woil Oh, Jong Wook Chang (2010), “Application of human umbilical cord blood- derived mesenchymal stem cells in disease models.”, World Journal of Stem Cells (2), 34-38 29 Karen K.H., David A.I., Mervin C.Y., (2008), “Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells”, Arterioscler Thromb Vasc Bio 28, 1584-1595 30 Krzysztof P, Magdalena M.K, (2009), “Use of HIV as a gene transfer vector”, Acta Biochimica Polonica Vol 56, 531–595 31 Lane, Suite, Rockville, Product Information and Protocols (V2.2), biogenova, United States 32 L Cheng, C Du, D Murray, X Tong, YA Zhang, BP Chen and Hawley (1997), “A GFP reporter system to assess gene transfer and expression in human hematopoietic progenitor cells”, Gene Therapy 4, 1013-1022 33 L Fouillard (1996), “Physical method for gene transfer: an alternative to viruses”, Hematol cell ther 38, 214-216 34 Masumi Nagano, Toshiharu yamashita, Hiromi Hamada, Kinuko Ohneda, Ken-ichi Kimura, Tomoki Nakagawa, Masabumi Shibuya, Hiroyuki Yoshikawa and Osamu Ohneda (2007), “Identification of functional endothelial progenitor cells suitable for the treatment of ischemic tissue using human umbilical cord blood”, Blood 110, 151160 35 Mehdi Kadivar, Shohreh Khatami, Yousef Mortazavi, Masoud Solemani, Mohammad Taghikhani, Mohammad ali shokrgozar (2005), “Isolation, culture and characterization of postnatal human umbilical vein- derived mesenchymal stem cells” DARU - Journal of Faculty of Pharmacy vol.13, 170-176 T T 36 M Hacker, A.G Mikos (2007), Bio 620: Tissue engineering gene transfer, Springer, Germanay 37 Monica B (2004), “Endothelial progenitor cells: Reporting for duty”, Blood vol 104, 2616-1617 38 Nair S., Jun R (2007), Vascular biology protocols, Humana Press Inc, USA 39 Pat M., Noel M.C (2007), “Vascular disease: A new progenitor biology”, Current Vascular Pharmacology 5, 61-68 40 Patrick A., Laurence M.D., Dan G.D., Kenneth S.C., James A.T., Ryan M.L., Dai F., David T., Rakesh K.J (2008), “Differential in vivo potential of endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood and adult peripheral blood to from functional” Blood 111, 1302-1305 41 Pat M., Noel M.C (2007)., “Vasccular disesse: a new progenitor biology”, Current vascular pharmacology 5, 61-68 42 Paul E.S., Paul W.M.F., Richard D.W., Duncan J.S., Micheal J.B.K , Subodh V (2002), “Endothelial progenitor cells: New hope for a broken hear”, Circulation 107, 3093-3100 43 Pengxia Liu, Bin Zhou, Dongsheng Gu, Lei Zhang, Zhongchao Han (2009), “Endothelial progenitor cell therapy in atherosclerosis: A double-edged sword?”, Ageing Research Reviews 8, 83-93 44 R.Ian Freshrey, Phd; Glyn n Stacey, Phd; Jonathan M Auerbach, Phd (2007), Culture of human stem cells, Wiley, Canada 45 Ricardo B deMedeiros, PhD and Joy Aho, PhD, immunostaining protocols for Flow Cytometric Analysis of adhereht cells R&D Systems Tools for Cell Biology Research™ 46 R.M Twyman (2005), Gene transfer to animal cells, Taylor & Francis, USA., 47 Rob P.W.R., Robert T.V.O.,Jan.D., Jan W.O.T, Lodder (2008), “Endothelial progenitor cells research in stroke: A potential shift in pathophysiological and theraapeutical concepts”, Stroke 39, 2158-2165 48 Roger Y Tsien (1998), “The green fluorescent protein”, Annual Review of Biochemistry 67, 509-544 49 Ronald A Bergman, Ph.D Atlas of Microscopic AnatomyPlate 13.261 Umbilical Cord 50 Sadettin S Ozturk, Wei-Shou Hu (2006), Cell culture technology for pharmaceutical and cell- based therapies, Taylor & Francis, USA 51 Satoshi Murasawa and Takayuki Asahara (2005), “Endothelial progenitor cells for vasculogensis”, Physiology 20, 36-42 52 Satoshi Murasawa and Takayuki Asahara (2007), “Gene modified cell transplantation for vascular regeneration”, Current Gene Therapy 7, 1-6 53 S.-.Lee, K Chu, K.-H Jung, D.-H.Kim, E.-H Kim, V.N Choe, J.-H Kim, W.-S Im, L Kang, J.-E Park, H.-J Park, H.-K Park, E.-C Song, S.K.Lee, M.kim and J.-K Roh (2009), “Decreased number and function of endothelial progenitor cells in patients with migraine”, Neurology 70, 1510-1517 54 Taina Jaatinen, Jarmo Laine (2007), “Isolation of Mononuclear Cells from Human Cord Blood by Ficoll-Paque Density Gradient”, Current Protocols in Stem Cell Biology 2A.1.1-2A.1.4 55 Tatjana Mitrovié (2003), “Gene transfer systems”, Medicine and Biology vol 10, 101105 56 Toyoaki Murohara (2001), “Therapeutic vasculogenesis using human cord bloodderived endothelial progenitors”, Trends in Cardiovascular Medicine 11, 303-307 57 Toshio Imanishi, Hiroto Tsujiola and Takashi Akasaka (2008), “Endothelial progenitor cells dysfunction and senescence: Contribution to Oxidative stress”, Current Cardiology Reviews 4, 275-286 58 Toyoaki Murohara (2003), “Angiogensis and vasculogenesis for therapeutic neovasculazation”, Nagoya Journal of Medical Science 66, 1-7 59 Toyoaki Murohara (2003), “Angiogenesis and vasculogenesis for therapeutic neovascularization”, Nagoya Journal of Medical Science 66, 1-7 60 Yukiko Yamazaki, Takesshi Yaki, Tsuyoshi Ozaki and Keiji Imoto (2000), “In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells using green fluorescent protein as a marker”, Journal of experimental zoology 286, 212-218 61 Victor J Dzau, Massimiliano Gnecchi, Alok S Pachori, Fulvio Morello and Luis G Melo (2005), “Therapeutic potential of endothelial progenitor cells in cardiovascular diseases”, Hypertension 46, 7-18 62 William C Heiseer (2004), Gene delivery to mammalian cells, Volume 2: Viral gene transfer techniquea, Humana Press, United States 63 Xialin Liu, yongjun Li, Yizhi Liu, Yan Lou, Dingding Wang, Brian H Annex and Pascal J Goldschmidt-Clermont (2010), “EPCs mobilized and activated by neurotrophic factor may contribute to pathologic neovascularization in diabetic retinopathy”, The American Journal of Pathology vol 176, 1-12 PHỤ LỤC PHỤ LỤC Chọn lọc ứng viên EPC từ mẫu tế bào đơn nhân máu cuống rốn người Thời gian theo dõi mẫu tế bào Tiêu chuẩn đánh giá mẫu tế bào Phân loại Nguyên nhân mẫu tế bào mẫu tế bào Đạt Không đạt không đạt 29 02 Tán huyết 25 04 Rất tế bào bám 21 04 Rất tế bào bám 18 03 Rất tế bào bám 06 12 Rất tế bào bám Mẫu tế bào thu nhận tách thành tế bào đơn, kích ngày thước tế bào tương đối đồng không lẫn tế bào hồng cầu, bạch cầu ngày Tế bào bám trải Tế bào bám trải, dạng hình viên sỏi dạng hình thoi Tế bào bám trải, dạng hình viên sỏi dạng hình thoi Tế bào bám trải, dạng hình 12 ngày viên sỏi dạng hình thoi Tế bào có dấu hiệu tăng sinh tạo thành cụm Tế bào không tăng 15 ngày Tế bào tăng sinh mạnh 04 02 sinh tế bào chết dần 18 ngày Tế bào tăng sinh mạnh 04 00 21 ngày Tế bào tăng sinh mạnh 04 00 >21 ngày Tế bào tăng sinh mạnh 04 00 PHỤ LỤC Kết xác định EPC phương pháp flow cytometry lần PHỤ LỤC Kết xác định EPC phương pháp flow cytometry lần PHỤ LỤC Xử lý số liệu sau chạy marker khảo sát Các đặc trưng thống kê CD14 CD34 CD90 CD133 Mean 1.47 57.88 2.06 60.93 Standard Error 0.61 7.37 0.68 4.05 Median 1.67 56.32 2.12 64.87 Mode #N/A #N/A #N/A #N/A Standard Deviation 1.06 12.76 1.18 7.01 Sample Variance 1.12 162.74 1.40 49.10 Kurtosis #DIV/0! #DIV/0! #DIV/0! #DIV/0! Skewness -0.83 0.54 -0.23 -1.73 Range 2.09 25.37 2.36 12.24 Minimum 0.32 45.98 0.85 52.84 Maximum 2.41 71.35 3.21 65.08 Sum 4.40 173.65 6.18 182.79 Count 3.00 3.00 3.00 3.00 Confidence Level (95.0%) 2.63 31.69 2.93 17.41 PHỤ LỤC Xử lý số liệu sau chuyển gen gfp cách Các đặc trưng thống kê Lentivirus Lentivirus Lentivirus + CaCl + polybrene R Mean 30.20 10.87 48.89 Standard Error 1.92 1.22 2.25 Median 28.71 10.31 47.78 Mode #N/A #N/A #N/A Standard Deviation 3.32 2.12 3.89 Sample Variance 11.04 4.48 15.13 Kurtosis #DIV/0! #DIV/0! #DIV/0! Skewness 1.61 1.11 1.18 Range 6.12 4.12 7.54 Minimum 27.89 9.09 45.67 Maximum 34.01 13.21 53.21 Sum 90.61 32.61 146.66 Count 3.00 3.00 3.00 Confidence Level (95.0%) 8.25 5.26 9.66 [...].. .tế bào tiền thân nội mô từ máu cuống rốn người biểu hiện gen gfp để theo dõi đánh giá chức năng của chúng về khả năng sửa chữa nội mạch trong mô hình chuột thiếu máu chi cục bộ và thiếu máu cơ tim cục bộ 3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Nội dung 1: Thu nhận tế bào tiền thân nội mô từ máu cuống rốn người - Thu nhận máu cuống rốn người - Thu nhận tế bào đơn nhân từ máu cuống rốn người - Nuôi cấy chọn lọc tế bào. .. VI NGHIÊN CỨU Đối tượng: Máu cuống rốn người Phạm vi nghiên cứu: Tạo nguồn tế bào tiền thân nội mô mang gen gfp nhưng không kiểm tra sự phát sinh đột biến xảy ra sau kết quả chuyển gen gfp 5 Ý NGHĨA CỦA NGHIÊN CỨU Ý nghĩa thực tiễn: Phân lập tế bào gốc nội mô từ nguồn phế phẩm máu cuống rốn đã giải quyết trở ngại về đạo lý trong nghiên cứu tế bào gốc thu nhận từ phôi Thiết lập tế bào tiền thân nôi mô. .. nhận từ máu cuống rốn thì biểu hiện âm tính [1] CD34 là marker đầu tiên được dùng để nhận diện các tế bào tạo máu người và là marker được sử dụng phổ biến cho việc thu nhận quần thể tế bào tiền thân nội mô, tế bào tiền thân tạo máu, tế bào nội mô trưởng thành Ngoài ra CD34 còn biểu hiện dương tính ở dòng tế bào tiền thân lympho, tế bào tiền thân dòng tủy, tiền thân đại thực bào, bạch cầu hạt, tiền thân. .. của các tế bào tiền thân dòng tủy và âm tính trong các tế bào gốc thu nhận từ tủy xương, mô mỡ và máu cuống rốn người Sử dụng kháng nguyên CD45 để loại trừ tế bào gốc máu trong quần thể tế bào gốc thu nhận từ máu cuống rốn và như vậy EPC được phân lập từ quần thể tế bào CD45- [29] P P CD90 biểu hiện dương tính với MSC thu từ tủy xương, mô mỡ, máu cuống rốn và CD90 biểu hiện dương tính các tế bào gốc... những tế bào gốc đó được gọi là tế bào tiền thân Tế bào tiền thân là một dạng trung gian giữa tế bào gốc và tế bào biệt hóa Tế bào tiền thân được xem là tế bào gốc do nó có khả năng tự làm mới và có khả năng biệt hóa cho ra nhiều loại tế bào có liên quan với nhau Ví dụ tế bào tiền thân dòng tủy có thể biệt hóa tạo thành nhiều loại tế bào máu như hồng cầu hay bạch cầu trung tính Tế bào tiền thân nội mô. .. thấy biểu mô hình vảy dẹt Hình 1.2 .Cuống rốn người cắt ngang [49] Tế bào gốc trong máu cuống rốn người: Máu cuống rốn chứa quần thể tế bào gốc với nhiều loại và nhiều tiềm năng khác nhau [34] Nhiều nghiên cứu cho rằng trong máu cuống rốn có các tế bào gốc sau [1], [44]: - Tế bào gốc tạo máu (HSC_Hematopotietic stem cell) - Tế bào gốc trung mô (MSC_Mesenchymal stem cell) - Tế bào tiền thân nội mô (EPC_Endothelical... bào tiền thân nội mô ứng viên - Định danh tế bào tiền thân nội mô bằng marker CD14, CD34, CD90, CD133 nhờ kỹ thuật flow cytometry Nội dung 2: Tạo tế bào tiền thân nội mô biểu hiện gen gfp - Chuyển gfp vào tế bào tiền thân nội mô bằng vector Lentivirus - Kiểm tra kết quả chuyển gen gfp bằng kính hiển vi huỳnh quang và kỹ thuật flow cytometry - Đánh giá sự thay đổi tính gốc của tế bào sau chuyển gen gfp. .. mang gen gfp nhằm đánh dấu theo dõi sự di cư và biệt hóa của tế bào này trong mô hình cấy ghép ở chuột thiếu máu chi và thiếu máu cơ tim Ý nghĩa khoa học: Tế bào tiền thân nôi mô đã được đánh dấu bằng gen phát huỳnh quang màu xanh lá sẽ là nguồn tế bào sử dụng cho các nghiên cứu về chức năng của tế bào tiền thân nôi mô Kết quả tạo nguồn tế bào tiền thân nội mô mang gen gfp ổn định là tiền đề cho các nghiên. .. tạo máu và hệ thống mạch máu [56] Năm 2000, Murohara phát hiện EPC trong máu cuống rốn Eggermann và cộng sự (2003) đã phát hiện và tách EPC từ máu cuống rốn [43] Máu cuống rốn là nguồn giàu tế bào EPC, chứa tỉ lệ cao các tế bào CD133+ và HSC P P CD34+ chúng có thể biệt hóa thành tế bào nội mô ex vivo, in vitro [42], [43], [51], [56], [58] P P Khi so sánh tập đoàn tế bào nội mô của máu cuống rốn với máu. .. (EPC_Endothelical progenitor cell) - Tế bào gốc sinh dưỡng không giới hạn (USSC_Unrestrictedsomatic stem cell) - Tế bào gốc giống tế bào gốc phôi được thu nhận từ máu cuống rốn (CBE_cord blood - derived embryonic - like stem cell) - Tế bào tiền thân đa năng được thu nhận từ máu cuống rốn máu cuống rốn (CBMPC_cord blood - multipotent progenitor cell) 1.2.4 Đặc điểm tế bào tiền thân nôi mô EPC biểu hiện hai loại ... trình thu nhận tế bào tiền thân nội mô từ máu cuống rốn người thiết lập tế bào tiền thân nội mô từ máu cuống rốn người biểu gen gfp để theo dõi đánh giá chức chúng khả sửa chữa nội mạch mô hình chuột... thiếu máu chi cục thiếu máu tim cục NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Nội dung 1: Thu nhận tế bào tiền thân nội mô từ máu cuống rốn người - Thu nhận máu cuống rốn người - Thu nhận tế bào đơn nhân từ máu cuống rốn. .. nghiên cứu tế bào tiền thân nội mô .17 T T 1.2.3 Nguồn tế bào tiền thân nội mô 19 T T 1.2.4 Đặc điểm tế bào tiền thân nôi mô 21 T T 1.2.5 Marker tế bào tiền thân nội mô