MỤC LỤC PHỤ LỤC GIỚI THIỆU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Catharanthus 1.2 Catharanthus roseus (L).G.Don [1] 1.2.1 Tên gọi 1.2.2 Đặc điểm thực vật 1.2.3 Phân bố 1.2.4 Phân loại [6] 1.2.5 Trồng trọt thu hoạch 1.2.6 Một số công dụng chủ yếu CHƯƠNG 2:CÁC HỢP CHẤT ANKALOID TRONG CÂY C.roseus 2.1 Alkaloid loài Catharanthus roseus 2.1.1 Alkaloid 2.1.1.1 Khái niệm 2.1.1.2 Phân loại 2.1.1.3 Tính chất alkaloid a Tính chất vật lý b Tính chất hóa học 2.1.2 2.2 Alkaloid catharanthus [1] Các vinca alkaloid 2.2.1 Vinbastine 2.2.1.1 Công thức 2.2.1.2 2.2.2 Đặc điểm Vincristine 2.2.2.1 Công thức 2.2.2.2 Đặc điểm 2.2.3 Sinh tổng hợp [6] 2.2.4 Tác dụng dược lý [1], [5], 2.2.5 Ứng dụng y học 2.2.5.1 Vinblastin [1] 2.2.5.2 Vincristine [1] CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH 3.1 Phương pháp chiết tách dùng chất lưu siêu tới hạn 3.1.1 Khái niệm chiết suất siêu tới hạn: 3.1.2 Ưu điểm SC-CO2 chiết xuất hoạt chất tự nhiên: 3.2 Phương pháp chiết tách dùng bình chiết Soxhlet [6] 3.3 Phương pháp chiết tách solid – liquid [6] 3.4 Phương pháp tách chiết nước nóng [6] 3.5 Sắc ký lỏng cao áp hiệu cao [4] 3.5.1 Định nghĩa: 3.5.2 Cấu tạo hoạt động máy sắc ký lỏng cao áp HPLC GIỚI THIỆU Dừa cạn Catharanthus roseus G Don thuộc họ Trúc đào Apocynaceae loại cảnh phổ biến đồng thời loại dược thảo dân gian Người ta khám phá khả chữa bệnh loại nhờ chứa nhiều loại hợp chất alkaloid Từ dừa cạn người ta chiết chất chữa ung thư vinblastine, vincristine chữa cao huyết áp ajmalicin, serpentin Hiện nay, nhu cầu C.roseus cao, thực tế, điều kiện tự nhiên nhân giống C.roseus đường sinh sản hữu tính chậm phụ thuộc nhiều vào môi trường Mặt khác, lượng alkaloid thu từ tự nhiên thấp nên không đáp ứng nhu cầu thị trường Vì em chọn đề tài “Cây dừa cạn Catharanthus roseus nhóm hợp chất Vinca alkaloid” với mục đích tìm hiểu dược tính, cách thu nhận ứng dụng Nhờ có giá trị dược tính nên C.roseus trở thành đối tượng nhiều nghiên cứu sinh học Những nghiên cứu chủ yếu liên quan tới điều kiện nuôi cấy in vitro quan, mô tế bào khác nhau, trình tách indole alkaloid xác định cấu trúc hóa học trình sinh tổng hợp hóa tổng hợp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Catharanthus Giống Catharanthus (thuộc họ trúc đào Apocynaceae) gồm có loài, hầu hết thân thảo lâu năm Trong số có loài Catharanthus pusillus có nguồn gốc từ Ấn Độ, tất loài lại có nguồn gốc từ Madagascar Số lượng nhiễm sắc thể cho tất loài Catharanthus 2n=16 Tám loài thuộc giống là: • Catharanthus coriaceus Markgr Madagascar • Catharanthus lanceus (Bojer ex A.DC.) Pichon Madagascar • Catharanthus longifolius (Pichon) Pichon Madagascar • Catharanthus ovalis Markgr Madagascar • Catharanthus pusillus (Murray) G Don India subcontinent • Catharanthus roseus (L) G Don Madagascar • Catharanthus scitulus (Pichon) Pichon Madagascar • Catharanthus trichophyllus (Baker) pichon Madagascar Những giống Catharanthus có nguồn gốc từ Madagascar thường trồng để làm cảnh Được biết đến nhiều loài Madagascar Periwinkle hay gọi Vinca nhờ vào khả chịu hạn chịu nóng Ngoài việc biết đến loại cảnh, từ lâu dịch chiết alkaloid từ Catharanthus roseus sử dụng y học dân gian loại thuốc chống đái tháo đường, lợi tiểu, chữa tiêu chảy, xuất huyết, giúp vết thương mau lành, chống viêm mắt, làm se da….và ngày người ta tìm công dụng quan trọng loài Catharanthus roseus khả trị bệnh ung thư hiệu quả.[6] 1.2 Catharanthus roseus (L).G.Don [1] 1.2.1 Tên gọi Tên khoa học: Catharanthus roseus (L) G Don; Vinca rosea L; Lochnera rosea Reich Tên khác: dừa, hoa hải đằng, trường xuân hoa, phjắc pót đông (Tày), dương giác, Madagascar periwinkle Họ: Trúc đào (Apocynaceae) 1.2.2 Đặc điểm thực vật Cây dừa cạn thân thảo sống lâu năm, cao 40-60 cm, phân nhiều cành, có rễ phát triển, thân gỗ phía gốc, mềm phần Mọc thành bụi dày Lá mọc đối, thuôn dài, đầu nhọn, cuống hẹp nhọn, dài 4-6cm, rộng 2-3 cm, hai mặt nhẵn, mặt sẫm bóng, mặt nhạt Hoa trắng hồng, có mùi thơm Hoa mọc riêng lẻ kẽ gần Quả gồm đại, dài 2-4cm, rộng 2-3cm, mọc thẳng đứng, ngả sang hai bên, vỏ có vạch dọc, đầu tù, chứa 12-20 hạt nhỏ màu nâu nhạt, hình trứng, mặt hạt có hột thành đường chạy dọc Mùa hoa gần quanh năm Hình : Cành nở hoa; 2.Quả; 3.Hạt Hình 2: Hạt C.roseus 1.2.3 Phân bố Chi Catharanthus G.Don có nguồn gốc Madagascar Loài dừa cạn di nhập sang nhiều nước nhiệt đới Nam Á Đông Nam Á có Việt Nam đảo Hải Nam Trung Quốc Vào kỷ 18, dừa cạn trồng Paris, sau có mặt nhiều vườn thực vật khác Châu Âu Ở Việt Nam, dừa cạn hoang dại, có vùng phân bố tự nhiên tương đối đặc trưng từ tỉnh Quảng Ninh đến Kiên Giang dọc theo vùng ven biển, tập trung tỉnh miền Trung Thanh Hóa, Nghệ An, Thừa Thiên-Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng, Bình Định Phú Yên Ngoài có Côn Đảo Phú Quốc Ở vùng phân bố tự nhiên ven biển, dừa cạn có mọc gần loại bãi cát rừng phi lao, trảng cỏ bụi thấp, có khả chịu đựng điều kiện đất đai khô cằn vùng cát ven biển Dừa cạn trồng khắp nơi nước để làm cảnh làm thuốc 1.2.4 Phân loại [6] Catharanthus roseus G.Don nguồn giàu alkaloid thuộc chủng loại alkaloid terpenoid indole cô lập từ giống khác nhau: • ‘roseus’ với hoa màu tím hồng • ‘albus’ với hoa màu trắng • ‘ocellatus’ với hoa màu trắng nhụy đỏ Trong hoa màu đỏ tím có hàm lượng vincristine vinblastine cao Hình 3: Ba giống C.roseus 1.2.5 Trồng trọt thu hoạch Dừa cạn loại ưa sáng, ưa ẩm có khả chịu hạn Trong điều kiện trồng trọt, cung cấp đầy đủ điều kiện cần thiết, sinh trưởng phát triển mạnh, khối lượng chất xanh thu cao gấp đôi mọc từ thiên nhiên Cây mọc từ hạt tự nhiên vào khoảng 40%, xử lý tăng lên 90% [9] Cây trồng từ hạt hoa sau 4-5 tháng Trong thời kì sinh trưởng mạnh, bị cắt, tái sinh chồi khỏe Nguồn dừa cạn mọc tự nhiên Việt Nam tương đối dồi Trước năm 1975, miền Bắc xuất sang Đông Âu 1-3 tấn/năm Những năm gần đây, lượng xuất sang Pháp (khoảng 10 tấn/năm) thường xuyên hơn, chủ yếu từ trồng Phú Yên [1] Vào năm 1970, Viện Dược Liệu tiến hành nghiên cứu kỹ thuật trồng dừa cạn quy mô sản xuất Cây nhân giống hạt, hecta cần gieo 500-700gr hạt vườn ươm Thời vụ gieo hạt vào tháng 9-10 tháng 1-2 Cần ngâm hạt 3-4 giờ, vớt để gieo lên luống vườn ươm chuẩn bị kỹ Sau phủ rơm tưới nước Sau khoảng tuần, hạt nảy mầm, cần tháo bỏ rơm rạ Khi có 3-4 đôi thật (khoảng 40-45 ngày sau gieo) đánh trồng Có thể gieo thẳng cách tốn công chăm sóc [1] Dừa cạn ưa đất pha cát, đất phù sa, chịu hạn chịu úng Đất cần làm kỹ, lên luống cao 20cm, mặt luống rộng 50-60cm, dung 10-15 phân chuồng hoai mục 120-150 kg super lân để bón lót Trồng với khoảng cách 30x30cm, sau trồng cần tưới để mau bén rễ Tưới thúc cho hecta 100-200kg ure, tưới lần, cách tháng Mặc dù chịu hạn phải giữ đủ ẩm thường xuyên Chú ý thoát nước nhanh sau mưa lớn Khi trồng, thường bị sâu bám phá hoại Cây vườn bị Phytophthora làm cho chết hàng loạt Cần tỉa bớt cho đất thoáng phun phòng Boxdeaux [1] Sau trồng 3-4 tháng, cho thu hoạch, cành mang dài 10-15cm cắt phơi sấy khô Ở đất thoát nước chăm bón tốt thu hoạch nhiều lứa Trung bình hecta thu 1-1,2 khô lứa Ta thu rễ để chiết ajmalicin 1.2.6 Một số công dụng chủ yếu Theo kinh nghiệm dân gian Việt Nam Trung Quốc, có nơi dùng thân phơi khô sắc uống để thông tiểu tiện, chữa bệnh tiểu đỏ ít, làm thuốc điều kinh, tẩy giun, chữa sốt, săn da, chữa bệnh da Ở Nam Châu Phi, Ấn Độ, châu Úc, quần đảo Antilles người dân dùng trị bệnh đái tháo đường Có nơi dùng chữa tiêu hóa lỵ Chính nhờ thực nghiệm chuột mà nhà khoa học Canada phát tác dụng làm giảm bạch cầu số chất tách từ dừa cạn dẫn đến phát chất vincaleucoblastin alkaloid khác có tác dụng chống u leurosin, leurocristin leurosidin Ngoài người ta phát tác dụng tẩy giun mạnh, tác dụng lợi tiểu catharanthin, vindolinin vindolidin Những thí nghiệm dùng người bệnh bắt đầu vào năm 1960 Mỹ, Pháp số nước khác, nhiên có nhiều ý kiến khác Mặc dù vậy, chưa có loại thuốc khác tốt hơn, nên cầu dừa cạn tăng lên Cũng mục đích chữa khối u nên mua dừa cạn, người ta đặc biệt ý tới hàm lượng alkaloid toàn phần, số alkaloid toàn phần có hàm lượng vincaleucoblastin bao nhiêu.[1][6] CHƯƠNG 2: CÁC HỢP CHẤT ANKALOID TRONG CÂY C.roseus 2.1 Alkaloid loài Catharanthus roseus C.roseus thu nhiều quan tâm từ công nghiệp dược phẩm, có khoảng 70 loại alkaloid hữu ích phát (G.H.Svobda cộng (1991) Trong chiếm nhiều hai loại alkaloid vinblastine (vincaleukoblastine) vincristine (leurocristine).[1] 2.1.1 Alkaloid 2.1.1.1 Khái niệm Alkaloid chất hữu có chứa dị vòng nitơ, có tính base Thường gặp nhiều loại thực vật tìm thấy vài loài động vật Đặc biệt, alkaloid có hoạt tính sinh lý cao thể người động vật, hệ thần kinh Với lượng nhỏ alkaloid chất độc gây chết người lại có thần dược trị bệnh đặc hiệu Hàm lượng alkaloid đạt tới 10% loại rau thông dụng khoai tây, chè, cà phê.[7] 2.1.1.2 Phân loại Các alkaloid thông thường phân loại theo đặc trưng phân tử chung chúng, dựa theo kiểu trao đổi chất sử dụng để tạo phân tử Khi nhiều tổng hợp sinh học alkaloid, chúng gộp nhóm theo tên hợp chất biết Ví dụ: cấu trúc phân tử xuất sản phẩm cuối nên alkaloid thuốc phiện gọi “phenanthren” Hay gọi tên dựa theo nhóm động/thực vật mà từ người ta chiết xuất alkaloid ví dụ alkaloid chiết từ dừa cạn vinca gọi chung vinca alkaloid Khi người ta biết nhiều alkaloid cụ thể đó, việc gộp nhóm thường lấy theo tên gọi amin quan trọng mặt sinh học bật tiến trình tổng hợp Các nhóm ankaloid gồm có: • Nhóm pyridin: piperin, coniin, trigonellin, arecaidin, guvacin, pilocarpin, cytisin, nicotin, spartein, pelletierin • Nhóm pyrrolidin: hygrin, cuscohygrin, nicotin • Nhóm tropan: atropin, cocain, ecgonin, scopolamin • Nhóm quinolin: quinin, quinidin, dihydroquinin, dihydroquinidin, strychnin, brucin, veratrin, cevadin • Nhóm isoquinolin: Các alkaloid gốc thuốc phiện : morphin, codein, thebain, papaverin, narcotin, sanguinarin, narcein, hydrastin, berberin • Nhóm phenethylamin: mescalin, ephedrin, dopamin, amphetamin • Nhóm indol:     Các tryptamin: DMT, N-metyltryptamin, psilocybin, serotonin Các ergolin: Các ancaloit từ ngũ cốc/cỏ ergin, ergotamin, acid lysergic Các beta-cacbolin: harmin, harmalin, yohimbin, reserpin, emetin Các alkaloid từ chi Ba gạc (Rauwolfia): reserpin • Nhóm purin: Các xanthin ( caffein, theobromin, theophyllin) • Nhóm terpenoit:  Các alkaloid aconit: aconitin  Các steroit: solanin, samandari (các hợp chất amoni bậc bốn): muscarin, cholin, neurin  Các vinca alkaloid: Vinblastin, vincristin… 2.1.1.3 Tính chất alkaloid Những alkaloid hình thành kết hợp hai nửa: nửa indole nửa dihydroindole Vì thế, chúng biết đến với tên gọi “dimer alkaloid” “bisindole alkaloid” Sự khác Catharanthus alkaloid phụ thuộc vào loại alkaloid terpenoid indole Chúng gồm hai nửa bắt nguồn từ hai trình chuyển hóa riêng biệt- trình mevalonate cho nửa không chứa tryptophan; nửa tryptophan nhận từ trình tryptophan Cấu trúc phức tạp alkaloid có mặt hai nguyên tử nitơ Một indole nitơ (nửa bắt nguồn từ tryptophan) Và nguyên tử nitơ thứ hai tạo thành từ tách rời hai carbon vị trí β vòng indole Nửa tryptophan bắt nguồn từ acid mevalonic C10-geraniol (monoterpenoid) Geraniol tạo thành , thông qua chuỗi chuyển hóa chuyển thành dạng loganin sau secologanin (một monoterpenoid glucoside) Chìa khóa trung gian thuyết phát sinh sinh học alkaloid monoterpene indole 3α (S)-strictosidine, tạo thành từ ngưng hoạt tính enzyme trytamine secologanin Enzyme chịu trách nhiệm cho phản ứng quan trọng strictosidine synthase Strictosidine sau hình thành cấu trúc cathenamine (alkaloid loại coryanthe) Enzyme liên quan cathenamine synthase Cathenamine phải trải qua chuỗi phản ứng để dẫn đến hình thành catharanthin (alkaloid loại iboga) vindoline (alkaloid loại aspidosperma) Catharanthine vindoline alkaloid monomeric indole, xuất tự 3’,4’-Anhydrovinblastine chìa khoa trung gian từ ghép nối catharanthine vindoline enzyme liên quan peroxidase Sau chuyển thành vinblastine Hình 10: Con đường sinh tổng hợp Vinblastine Vinblastine tạo thành từ ghép nối hai monomer alkaloid: catharanthine (indole) vindoline (dihydroindole) Mặc dù nhu cầu sử dụng vincristine nhiều so với vinblastine lại sản xuất tỷ lệ vinblastine nhiều May mắn thay, ta biến đổi vinblastine thành vincristine phương pháp hóa học hay thông qua phương pháp vi sinh học “microbiological N-demethylation” sử dụng Streptomyces albogriseolus Hình 11: Quá trình sinh tổng hợp vincristine từ vinblastine 2.2.4 Tác dụng dược lý [1], [5], Vinblastine hay gọi vincaleucoblastine, chất ức chế cấu trúc vi ống Vinblastine đồng ý đưa vào điều trị tổ chức Food and Drug Administration (FDA) năm 1961 trở thành thành phần phương pháp hóa trị liệu điều trị tế bào mầm tế bào ung thư, khối u ác tính số loại lymphoma cấp cao, bao gồm u lymphoma Hodgkin, u lymphoma không Hodgkin, u sùi dạng nấm, tế bào ung thư phổi nhỏ, ung thư vú, ung thư tinh hoàn tiến triển, bướu thịt Kaposi, bệnh mô bào huyết, ung thư nhau, chriocarcinoma (một loại ung thư tử cung),… Theo ghi lịch sử sử dụng vinblastine vinblastine sử dụng kết hợp với tác nhân khác để chữa bướu thịt Kaposi ung thư bàng quang, ung thư vú vài loại u ác tính não Hoạt tính điều trị ung thư vinblastine hiệu hoạt tính vincristine, song lại độc tố thần kinh Desacetyl vinblastine (vindesine) xem dẫn xuất vinblastine bán tổng hợp Potier cộng Vinorelbine (5’-norhydro Vinblastine), có hoạt tính chống ung thư rộng giảm phản ứng phụ gây độc thần kinh Nó cấu trúc sửa đổi nhân catharanthine, kết tăng đáng kể lượng lipophilicity (chất có khả hòa tan chất béo dung môi không phân cực) so với alkaloid Vinca Nó có hiệu kết hợp với hóa trị liệu anthracycline, fluorouracil taxol Nó chấp nhận Mỹ việc điều trị tế bào ung thư phổi nhỏ, sử dụng riêng lẻ kết hợp với cisplatin, dùng cho bệnh nhân bị ung thư vú Vincristine hay gọi leurocristine, thường dùng để điều trị khối u ác tính trẻ em, có khả chống lại kết hợp nhạy cảm bệnh khối u ác tính trẻ em vincristine cho tác dụng tốt dùng liều lượng dành cho trẻ em Mặt khác, người lớn trẻ em, vincristine thành phần cần thiết liệu pháp hóa học để chữa viêm bạch cầu cấp tính, lên làm vỡ lymphoid bạch cầu myeloid mãn tính (chronic myeloid leukemia), hai bệnh lymphoma Hodgkin lymphoma không Hodgkin Nó đóng vai trò vài liệu pháp điều trị khối u Wilms, bướu thịt Ewing, u nguyên bào thần kinh rhabdomyosarcoma, tốt điều trị đa u tủy (multiple myeloma) tế bào ung thư phổi nhỏ (small-cell lung cancer) người lớn Cơ chế tác dụng: vinblastin vincristin, chất ức chế mạnh phân bào Các alkaloid liên kết đặc hiệu với tubulin, protein vi ống thoi phân bào ngăn cản kết hợp cấu trúc hình ống có nguyên sinh chất nhiều tế bào di động, ngăn cản tăng lên số lượng kỳ gián phân tế bào Hình 12: Cơ chế ức chế hình thành cấu trúc vi ống vinca alkaloid Vinblastin có tác dụng chống ung thư tác động chuyển hoá glutamate aspartate Và vincristin tác dụng chống ung thư ngăn cản tổng hợp RNA protein Ở nồng độ cao, thuốc diệt tế bào, nồng độ thấp làm ngừng phân chia tế bào Vinca alkaloid có tác dụng làm tăng nồng độ phosphat acid kiềm tinh hoàn tuyến tiền liệt chuột cống trắng Điều chứng tỏ cao dừa cạn làm biến đổi chức chuyển hoá hoạt tính phosphatase quan chuột Vinca alkaloid có tác dụng ức chế mạnh hoạt tính protease hai chủng T5 T12 nấm da Trichophyton rubrum Tác dụng ức chế hoàn toàn có ý nghĩa nồng độ cao Ở nồng độ thấp, không ức chế, tác dụng ức chế protease Cơ chế kháng nấm đâu ức chế hô hấp sợi nấm chủng T.rubrum Những điều thí nghiệm chuột:  Khi cho chuột cống trắng thụ tinh uống cao dừa cạn, thấy liều cao không gây tai biến cho chuột mẹ có dấu hiệu ngăn cản phát triển thai Khi cho chuột cống uống liều trung bình vào ngày – 13 thời kỳ thai nghén 50% chuột đẻ bình thường, 15% chuột có cổ tử cung không bình thường, 35% lại dấu hiệu thụ thai  Trong nghiên cứu, ảnh hưởng vinblastine chiết từ dừa cạn Việt Nam lên nhiễm sắc thể tế bào tủy xương chuột nhắt thấy có tác dụng gây sai lạc nhiễm sắc thể số lượng, chủ yếu gây nên tế bào đa bội thể (tứ bội), gây sai lạc cấu trúc nhiễm sắc thể, đến tiêu nhiễm sắc thể gây ức chế gián phân tế bào 2.2.5 Ứng dụng y học 2.2.5.1Vinblastin [1] Tên biệt dược: DBL Vinblastin Injection Dạng bào chế: dung dịch tiêm Thành phần: Vinblastine sulfate Hình 13: Cấu trúc hóa học vinblastine sulfate Là thành phần phối hợp thuốc, thuốc lựa chọn thứ điều trị ung thư biểu mô tinh hoàn Nó thành phần phối hợp thuốc lựa chọn thứ hai để điều trị bệnh Hodgkin, ung thư rau, ung thư biểu mô tế bào có vây đầu cổ, ung thư biểu mô tế bào thận Nó thuốc lựa chọn thứ ba để điều trị u nguyên bào thần kinh, ung thư vú, ung thư cổ ung thư dạng nấm da Nó dùng chữa bệnh sacoma limpho, sacoma bạch huyết bào, bệnh da sacoma, chảy máu Kaposi, bệnh sacoma tế bào Một số công thức kết hợp Vinblastine với thành phần khác: • ABVD (adriamycin, bleomycin, vinblastine, dacarbazine) • ChIVPP/EVA (chlorambucil, oncovin, procarbazine, prenisone , etoposide, vinblastine, adriamycin) • Stanford-V (adriamycin, mustargen , bleomycin, vinblastine , oncovin , etoposide, prednisone) Không có kháng chéo vinblastin loại chống ung thư khác  Tác dụng phụ: Vinblastine làm giảm việc sản xuất tế bào bạch cầu tủy xương, làm cho bệnh nhân dễ bị nhiễm trùng Điều có hiệu lực sau ngày dùng thuốc, khả bị nhiễm trùng cao sau 10-14 ngày sau hóa trị Các tác dụng buồn nôn, nôn, nhức đầu cảm xảy sau khoảng - kéo dài - 10 Các tượng tiêu chảy, táo bón, tắc ruột, liệt, chán ăn, viêm miệng xảy thường báo trước tác dụng độc thần kinh nhức đầu nặng, khó chịu, trầm cảm, dị cảm phản xạ gân sâu Độc tính thần kinh xảy 20% trường hợp, tùy thuộc vào liều lượng Tổn thương hệ thần kinh trung ương có tính lâu dài, dùng liều cao xảy mù tử vong Chứng rụng tóc xảy cho khoảng 30 - 60 % người dùng, tóc phát triển trở lại phương pháp điều trị hoàn thành Sự ức chế nhẹ tủy xương với giảm bạch cầu xảy bệnh nhân với tỷ lệ cao, cần ngừng dùng thuốc Dễ bầm tím, chảy máu bất thường (mũi, miệng, âm đạo trực tràng) Những tiểu cầu bị ảnh hưởng, xảy thiếu máu, cần đếm số lượng huyết cầu hàng tuần  Thận trọng lúc dùng: Thuốc có tác dụng độc hại chỗ , cần tránh tràn thuốc gây nhiễm tĩnh mạch nơi tiêm Nếu vinblastine vô tình dò rỉ vào mô xung quanh, da bắp bị hỏng nặng Có thể xảy tiết bất thường chất nội tiết tố kháng tiết niệu Thuốc có tác dụng gây quái thai động vật, không dùng tháng thứ vào thời kỳ thai nghén  Liều dùng: Người lớn tiêm tĩnh mạch, ngày đầu tiêm 0,1 mg/kg, ngày sau tuần sau đó, liều thuốc tăng lần 0,05 mg/kg, số lượng bạch cầu giảm xuống tới 3.000 bạch cầu/mm3, ung thư thuyên giảm, tới đạt liều tối đa 0,5mg/kg (bình thường liều cuối 0,15 - 0,2mg/kg) Sau đó, liều lượng trì tới mức giảm bớt trị số gia tăng so với liều cuối tiêm khoảng cáck từ - tuần lễ Một số chuyên gia dùng liều trì 10mg, 1-2 lần tháng Vinblastin gây độc cho thai, nên dùng thời kỳ mang thai tình trạng bệnh đe dọa tính mạng bệnh nặng mà thuốc an toàn hiệu lực Đối với trẻ em, tiêm tĩnh mạch 0,1 - mg/kg, lần tuần Điều kiện lưu trữ: tủ lạnh từ 36 – 46 0F (giữa 2,2 – 7,80C) Thuốc bảo quản 30 ngày kể từ ngày sản xuất 2.2.5.2 Vincristine [1] Tên biệt dược: Vincran Dạng bào chế: dung dịch tiêm Thành phần: Vincristine sulfate Hình 14: Sản phẩm cấu trúc hóa học vincristine sulfate Vincristine chấp thuận Food and Drug Administration (FDA) Mỹ vào tháng 7/1963 Oncovin Là thuốc chống ung thư dùng rộng rãi nhất, đặc biệt có ích bệnh ung thư máu, thường dùng để làm thuyên giảm bệnh bạch cầu lympho cấp Nó dùng liệu pháp phối hợp thuốc, lựa chọn hàng đầu để điều trị bệnh Hodgkin, u bạch huyết không Hodgkin, ung thư biểu mô phổi, u Wilm (một loại u thận phổ biến trẻ em), bạch cầu tủy, sarcoma Ewing sarcoma vân Phối hợp thuốc chứa vincristine lựa chọn hàng thứ hai cho ung thư biểu mô vú, ung thư cổ tử cung, u nguyên bào thần kinh bệnh bạch cầu lympho mãn tính Một số chuyên gia ưa dùng vincristine để làm thuyên giảm không dùng điều trị trì việc sử dụng kéo dài gây độc hại thần kinh Sự kháng vincristine phát triển trình điều trị Vincristine gây giảm bạch cầu nên phải đếm số lượng bạch cầu trước liều  Tác dụng phụ: Thường bắt đầu với buồn nôn, nôn, táo bón, co cứng bụng, sút cân phục hồi nhanh Thuốc gây phản ứng chậm phục hồi rụng tóc bệnh thần kinh ngoại biên Những tai biến nặng thần kinh xảy phản xạ gân sâu, viêm đau thần kinh, tê chi, nhức đầu, điều hòa Những khuyết tật thị giác, liệt nhẹ bại liệt teo số duỗi xảy chậm Liệt dây thần kinh số 2, 3, xảy Các tai biến thần kinh kéo dài nhiều tháng Tăng huyết áp nặng, tình trạng kích động trầm cảm xảy thời Thuốc gây độc chỗ, cần tránh tràn thuốc ngoài, tốt nên cho dùng thuốc cách tiêm truyền tĩnh mạch Vincristine nhanh chóng thải trừ khỏi máu, 70% thuốc thải mật Trong bệnh vàng da tắc mật, độc tính thuốc lớn cần giảm liều Khoảng 12% thuốc thải trừ nước tiểu Vincristine không vào não, không dùng cho bệnh bạch cầu hệ thần kinh trung ương Thận trọng lúc dùng: Vincristine gây độc hại cho thai Ðối với phụ nữ khả sinh đẻ, cần dùng biện pháp tránh thai Phụ nữ điều trị với Vincristine Vinblastine không cho bú Vinscristine khác với hầu hết thuốc chống ung thư khác chổ ức chế tủy xương không xảy thường xuyên, dùng phối hợp thuốc Tuy có giảm bạch cầu phải đếm số lượng bạch cầu trước liều Việc sử dụng thường bị hạn chế bới tác dụng độc thần kinh  Liều dùng: Tiêm tĩnh mạch tuần lần bệnh bạch cầu lymphô cấp tính trẻ 12 tuổi, bắt đầu 0,03 - 0,075 mg/kg cho trẻ em 10 tuổi 0,05 - 0,15 mg/kg cho trẻ em tuổi, liều tuần đầu,tiếp theo trị số gia tăng hàng tuần 0,025 mg/kg liều tối đa 0,15mg/kg Sau dùng thuốc khác để trì, bệnh nhân từ 12 – 20 tuổi, tiêm tĩnh mạch 1,5 – 4,5mg/m2 diện tích bề mặt thể lần tuần với prednisone (uống 40mg/m2, lần ngày), đạt thuyên giảm bệnh Dùng thuốc khác để trì Người lớn: 0,025 – 0,075 mg/kg, tuần lần, tùy theo tác dụng phụ hiệu điều trị mà điều chỉnh liều cần thiết Điều kiện lưu trữ: giữ 2-80C, bảo quản lạnh, không làm đông, tránh ánh sáng CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH 3.1 Phương pháp chiết tách dùng chất lưu siêu tới hạn 3.1.1 Khái niệm chiết suất siêu tới hạn: Là trình phân tách hay số chất từ hỗn hợp (dược liệu, hỗn hợp nguyên liệu) cách sử dụng chất lỏng CO2 siêu tới hạn dung môi Khi trạng thái CO2 có đặc tính độ tan tương tự chất lỏng đồng thời có khả khuếch tán độ nhớt gần với chất khí, nhờ chúng có khả khuếch tán hòa tan nhanh hoạt chất nguyên liệu Gore (1891) người phát khả hòa tan tốt Naphtalen Camphor CO lỏng Sau Andrews (1875) nghiên cứu đặc tính CO trạng thái siêu tới hạn Tuy nhiên, tới đầu năm 1970 công nghệ chiết xuất hợp chất tự nhiên dung môi CO siêu tới hạn (SC-CO2) thực phát triển vào ứng dụng công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm như: loại cafein cà phê chè xanh, chiết xuất dầu vừng đen, chiết polyphenol từ chè xanh, loại bỏ cholesterol thực phẩm, loại alcol đồ uống, chiết xuất phẩm màu, chiết xuất hoạt chất chống oxy hóa, chiết xuất tinh dầu, hương liệu từ thực vật sử dụng mỹ phẩm, thực phẩm… 3.1.2 Ưu điểm SC-CO2 chiết xuất hoạt chất tự nhiên: CO2 có điểm tới hạn thấp (nhiệt độ gần nhiệt độ phòng, áp suất thấp) hoạt chất bị oxy hoá hay phân huỷ nhiệt độ oxy hoà tan, vấn đề thiết kế hệ thống chiết xuất đảm bảo đủ áp lực siêu tới hạn dễ dàng nên khả ứng dụng cho quy mô sản xuất công nghiệp thuận lợi Sản phẩm sau chiết không tồn dư dung môi CO dễ dàng chuyển sang trạng thái khí bay toàn sau giảm áp suất, nhiệt độ xuống điểm tới hạn Vì vậy, chiết xuất theo phương pháp phù hợp sản phẩm dùng làm thực − phẩm, thuốc, mỹ phẩm Khả chiết xuất chọn lọc do: Độ tan SC-CO2 thay đổi áp suất nhiệt độ đạt siêu tới hạn thay đổi hoà tan chọn lọc chất khác nhiệt độ, áp suất tương ứng Thông thường tinh dầu dễ bay chiết áp suất 100bar, chất béo chiết − áp suất cao Dung môi SC-CO2 phân cực hoà trộn với dung môi phụ trợ phân cực như: methanol, ethanol khả hoà tan hợp chất đa dạng Tuy nhiên dung môi phụ trợ làm thay đổi điểm tới hạn CO thực nghiệm cần phải khảo sát tỷ lệ dung môi phụ trợ thích hợp để ảnh hưởng đến điểm tới hạn Thời gian chiết xuất ngắn: Do chất lỏng siêu giới hạn có hệ số khuếch tán cao chất lỏng, độ nhớt thấp, sức căng bề mặt nhỏ nên khả khuếch tán dung môi vào tế bào nhanh thời gian chiết rút ngắn chất lỏng thông thường Không thay đổi hương thơm, màu sắc tự nhiên ban đầu hoạt chất Không tạo mùi ,vị lạ SC-CO chất trơ, không mùi vị bay hoàn toàn thay đổi trạng thái siêu tới hạn CO2 không ăn mòn thiết bị, không gây cháy nổ trình vận hành, an toàn, thân thiện với môi trường, giá thành rẻ, dễ kiếm, tái sử dụng thời gian dài Trong trường hợp vinca alkaloid, vindoline tách chiết nhờ SFE Theo nghiên cứu nhằm tối ưu hóa trình thực hiện, lượng đáng kể vindoline (58% lượng chất khô) tách chiết từ Catharanthus roseus sử dụng SFE điều kiện nhiệt độ 350C áp suất 300 bar [6] Hình 15: Sơ đồ trình chiết tách SFE 3.2 Phương pháp chiết tách dùng bình chiết Soxhlet [6] (Soxhlet extraction) Quá trình chiết ankaloid thực máy Soxhlet gồm có: bình cầu, trụ chiết, ống sinh hàn bếp điện Nguyên liệu nghiền nhỏ, cho vào túi giấy lọc dùng ống hình trụ mẫu vào Cho túi nguyên liệu vào trụ chiết, lắp trụ chiết vào bình cầu, cho dung môi vào bình chiết đến ngập túi nguyên liệu, lắp ống làm lạnh, ngâm nguyên liệu dung môi vài Đặt máy Soxhlet vào nồi cách thủy Ta thu alkaloid Hình 16: Bình Soxhlet 3.3 Phương pháp chiết tách solid – liquid [6] Phương pháp solid-liquid trình loại bỏ nhiều chất tan từ chất rắn cách sử dụng dung môi lỏng Phương pháp chiết tách sử dụng công nghiệp hóa chất mà phương pháp học nhiệt áp dụng Chất chiết từ C.roseus hỗn hợp phức tạp alkaloid với phạm vi phân cực rộng Quy trình phương pháp chiết tách solid-liquid truyền thống cho Catharanthus alkaloid việc ngâm nguyên liệu môi trường acid, chủ yếu dựa đặc tính tổng hợp chúng Các alkaloid hình thành dạng muối ngâm môi trường acid để cải thiện độ tan tăng ổn định giá trị pH thấp Thêm vào đó, proton dung dịch acid hỗ trợ việc bẻ gãy liên kết nên giải phóng analyte dễ dàng 3.4 Phương pháp tách chiết nước nóng [6] (hot water extraction-HWE) HWE phương pháp dùng để tinh hợp chất hữu tự nhiên Phương pháp ngày nghiên cứu áp dụng Đó dùng nước nóng dạng lỏng, điều kiện nhiệt độ áp suất khác từ 100 0C-3740C bar -219 bar Tuy nhiên trình thường thực khoảng nhiệt độ 100-1800C áp lực bão hòa tương ứng 2-30bar để pha lỏng trì Khi nước qua mẫu, mang hợp chất hòa tan theo, sau chúng ngưng tụ để thu chất mong muốn Hình 17: Sơ đồ chưng cất lôi nước 3.5 Sắc ký lỏng cao áp hiệu cao [4] Cùng với đời vật liệu hiệu cao, tiến trang thiết bị cho phép thực đầy đủ lức vật liệu này, kỹ thuật HPLC phát triển vô mạnh mẽ vững so với phưong pháp sắc ký khác 3.5.1 Định nghĩa: HPLC kỹ thuật tách hỗn hợp cột đựoc nhồi hạt có kích thứoc ≤ 10 µm Trong đó, ngừoi ta dùng bơm có áp suất cao ≈ 300atm để đẩy pha động qua cột với tốc độ dòng khoảng vài ml/phút cho phép phân giải nhanh lựong mẫu nhỏ khoảng 20µg Ưu điểm: Trong sắc ký khí, hỗn hợp đựoc khảo sát pha hơi, cần phải tạo chất ổn định từ hỗn hợp cần phân tích, chuyển chất hỗn hợp thành dẫn chất bền với nhiệt Chỉ có khoảng 20% hợp chất hoá học thích hợp cho sắc kí khí mà không cần phải biến đổi mẫu thành dạng khác, số lại không bền với nhiệt không bay Hơn nữa, chất có nhóm chức phân cực hay ion hoá thừong có khuynh hứong kéo đuôi, không thích hợp áp dung sắc ký khí Vì HPLC kĩ thuật tốt đại phân tử, loại chất vô ion hoá, hợp chất thiên nhiên không bền, hỗn hợp thuốc chất hoá sinh Trong sắc kí khí có pha (pha tĩnh lỏng hay rắn) sẵn sàng tưong tác với phân tử mẫu Vì pha động chất khí, tất mẫu tan chất khí Trong HPLC, pha tĩnh lẫn pha động tương tác cách chọn lọc với mẫu Các tương tác tạo phức hay liên kết hydrogen pha động sắc ký khí xảy pha động HPLC Nhiều loại tương tác chọn lọc khác gia tăng biến đổi hoá học thích hợp bề mặt silica, HPLC kĩ thuật linh hoạt sắc ký khí thường thực phân tử tách khó Nhược điểm: Xét đầu tư trang thiết bị lẫn phí tổn vận hành, HPLC kĩ thuật đắt tiền, sắc ký khí 3.5.2 Cấu tạo hoạt động máy sắc ký lỏng cao áp HPLC: Thiết bị máy HPLC bao gồm:  Bình chứa pha động  Bơm tạo áp lực cao hệ thống tạo việc rửa giải đẳng môi hay rửa giải tiệm tiến ( pump + gradient system)  Bộ phận tiêm mẫu (injection unit) để đưa mẫu vào cột  Cột đựoc nhồi với pha tĩnh có hiệu cao Cột đựơc đặt phận điều nhiệt  Bộ phận phát hệ thống xử lý liệu  Máy ghi (recorder) máy vi tính để ghi lưu giữ sắc kí đồ Pha tĩnh HPLC phân tử có kích thứoc nhỏ, đựoc gọi chất nhồi vi tiểu phân, chúng thường đồng dạng, có hình cầu hình dạng bất định, đừong kính 10, 5, hay µm Cơ chế phân tách đựoc thực nhóm hoá học liên kết vào bề mặt tiểu phân silica để tạo pha liên kết Hiện nay, pha liên kết thông dụng đựoc sử dụng HPLC ODS, nhóm ankyl 18 carbon gắn vào bề mặt tiểu phân silica [...]... PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH 3.1 Phương pháp chiết tách dùng chất lưu siêu tới hạn 3.1.1 Khái niệm chiết suất siêu tới hạn: Là quá trình phân tách một hay một số chất từ hỗn hợp (dược liệu, hỗn hợp nguyên liệu) bằng cách sử dụng chất lỏng CO2 siêu tới hạn như một dung môi Khi ở trạng thái này CO2 có đặc tính về độ tan tương tự như một chất lỏng đồng thời có khả năng khuếch tán và độ nhớt gần với chất khí,... dài Trong trường hợp của vinca alkaloid, vindoline được tách chiết nhờ SFE Theo như một nghiên cứu nhằm tối ưu hóa trong quá trình thực hiện, một lượng đáng kể vindoline (58% lượng chất khô) đã được tách chiết từ lá của Catharanthus roseus sử dụng SFE dưới điều kiện nhiệt độ là 350C và áp suất 300 bar [6] Hình 15: Sơ đồ quá trình chiết tách bằng SFE 3.2 Phương pháp chiết tách dùng bình chiết Soxhlet [6]... pháp chiết tách solid – liquid [6] Phương pháp solid-liquid là quá trình loại bỏ một hoặc nhiều chất tan từ một chất rắn bằng cách sử dụng dung môi lỏng Phương pháp chiết tách này được sử dụng trong công nghiệp hóa chất khi mà các phương pháp cơ học và nhiệt không thể áp dụng Chất chiết từ cây C.roseus là một hỗn hợp phức tạp của các alkaloid với một phạm vi phân cực rộng Quy trình của phương pháp chiết. .. phẩm như: loại cafein trong cà phê và chè xanh, chiết xuất dầu vừng đen, chiết polyphenol từ chè xanh, loại bỏ cholesterol trong thực phẩm, loại alcol trong đồ uống, chiết xuất phẩm màu, chiết xuất các hoạt chất chống oxy hóa, chiết xuất tinh dầu, hương liệu từ thực vật sử dụng trong mỹ phẩm, thực phẩm… 3.1.2 Ưu điểm của SC-CO2 trong chiết xuất hoạt chất tự nhiên: CO2 có điểm tới hạn thấp (nhiệt độ gần... ở cây dừa cạn thu thập hoang dại ở Phú - Yên đạt cao nhất là 0.892-0.982% ở lá và 1.38-1.445% ở rễ vào mùa khô Ngoài hai alkaloid chính là vinblastine và vincristine được chiết xuất, nhiều tác giả đã bán tổng hợp được vinblastine từ cathanthin và vindolin có ở dừa cạn và - vincristine (có với hàm lượng thấp) từ vinblastine (có với hàm lượng cao hơn) Mai Ngọc Tâm và cộng sự, 1997 đã chứng minh rễ dừa. .. phóng analyte dễ dàng hơn 3.4 Phương pháp tách chiết bằng nước nóng [6] (hot water extraction-HWE) HWE là một trong những phương pháp dùng để tinh sạch các hợp chất hữu cơ tự nhiên Phương pháp này đang ngày càng được nghiên cứu và áp dụng Đó là dùng nước nóng đang ở dạng lỏng, điều kiện nhiệt độ và áp suất có thể khác nhau từ 100 0C-3740C và 1 bar -219 bar Tuy nhiên quá trình thường được thực hiện trong... vậy chúng có khả năng khuếch tán và hòa tan nhanh các hoạt chất trong nguyên liệu Gore (1891) là người đầu tiên phát hiện ra khả năng hòa tan tốt của Naphtalen và Camphor trong CO 2 lỏng Sau đó Andrews (1875) đã nghiên cứu về đặc tính của CO 2 ở trạng thái siêu tới hạn Tuy nhiên, tới đầu những năm 1970 công nghệ chiết xuất các hợp chất tự nhiên bằng dung môi CO 2 siêu tới hạn (SC-CO2) mới thực sự phát... cái đã thụ tinh uống cao dừa cạn, thấy liều cao không gây tai biến cho chuột mẹ nhưng có dấu hiệu ngăn cản sự phát triển của thai Khi cho chuột cống uống liều trung bình vào ngày 6 – 13 của thời kỳ thai nghén thì 50% chuột đẻ bình thường, 15% chuột có cổ tử cung không bình thường, 35% còn lại không có dấu hiệu thụ thai  Trong nghiên cứu, ảnh hưởng của vinblastine chiết từ dừa cạn ở Việt Nam lên bộ nhiễm... Vì thế HPLC là một kĩ thuật tốt hơn đối với các đại phân tử, các loại chất vô cơ và ion hoá, các hợp chất thiên nhiên không bền, các hỗn hợp thuốc và các chất hoá sinh Trong sắc kí khí chỉ có một pha (pha tĩnh lỏng hay rắn) là sẵn sàng tưong tác với các phân tử của mẫu Vì pha động là một chất khí, tất cả hơi của mẫu đều tan trong chất khí này Trong HPLC, cả pha tĩnh lẫn pha động có thể tương tác một... cộng sự, 1997 đã chứng minh rễ dừa cạn ở vùng Nha Trang chứa ajmalicin 0,18%, serpentin 0,27%, tetrahydroalstonin, tabersonin, - lochnericin, catharanthin và akuamin Nhiều tác giả khác (Phạm Thanh Kỳ và cộng sự, 1995; Trần Văn Thanh và cộng - sự, 1996 và 1999) đã chiết xuất ajmalicin từ rễ dừa cạn Trần Văn Thanh và cộng sự, 1996 và 1999 đã chiết xuất alkaloid toàn phần từ rễ, làm giàu ajmalicin bằng phương ... PHÁP CHIẾT TÁCH 3.1 Phương pháp chiết tách dùng chất lưu siêu tới hạn 3.1.1 Khái niệm chiết suất siêu tới hạn: 3.1.2 Ưu điểm SC-CO2 chiết xuất hoạt chất tự nhiên: 3.2 Phương pháp chiết tách dùng... 3: PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH 3.1 Phương pháp chiết tách dùng chất lưu siêu tới hạn 3.1.1 Khái niệm chiết suất siêu tới hạn: Là trình phân tách hay số chất từ hỗn hợp (dược liệu, hỗn hợp nguyên liệu)... nhiên Cây mọc từ hạt tự nhiên vào khoảng 40%, xử lý tăng lên 90% [9] Cây trồng từ hạt hoa sau 4-5 tháng Trong thời kì sinh trưởng mạnh, bị cắt, tái sinh chồi khỏe Nguồn dừa cạn mọc tự nhiên Việt