BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP.HỒ CHÍ MINH _ Ngô Lê Minh Thư ƯỚC TÍNH CÁC THƠNG SỐ DI TRUYỀN TÍNH TRẠNG TĂNG TRƯỞNG VÀ KHÁNG BỆNH GAN THẬN MỦ PHỤC VỤ CHƯƠNG TRÌNH CHỌN GIỐNG CÁ TRA Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage 1878) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP.HỒ CHÍ MINH _ Ngơ Lê Minh Thư ƯỚC TÍNH CÁC THƠNG SỐ DI TRUYỀN TÍNH TRẠNG TĂNG TRƯỞNG VÀ KHÁNG BỆNH GAN THẬN MỦ PHỤC VỤ CHƯƠNG TRÌNH CHỌN GIỐNG CÁ TRA Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage 1878) Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TS NGUYỄN TƯỜNG ANH TS NGUYỄN VĂN SÁNG Thành phố Hồ Chí Minh - 2013 LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình thực đề tài, nhận quan tâm, giúp đỡ nhiều cá nhân tập thể Luận văn hồn thành, lúc tơi có hội bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến: TS Nguyễn Văn Sáng tận tình hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn PGS TS Nguyễn Tường Anh tận tình hướng dẫn, động viên truyền đạt cho nhiều kinh nghiệm trình thực luận văn Các Thầy, Cô khoa Sinh, trường Đại học Sư phạm Tp Hồ Chí Minh truyền đạt tri thức hướng dẫn tơi suốt khố học Các anh chị, bạn bè làm việc Trung tâm Quốc Gia Giống Thủy Sản Nước Ngọt Nam Bộ tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ thời gian làm đề tài nghiên cứu Ba Má hai bên gia đình, em gái người bạn đời hỗ trợ, động viên thời gian thực luận văn Ban Giám Hiệu đồng nghiệp trường THPT Phan Bội Châu (Bình Thuận) tạo điều kiện tốt cho chuyên tâm vào việc nghiên cứu hoàn thành luận văn Tất bạn bè giúp đỡ, đóng góp ý kiến, chia sẻ động viên thời gian làm luận văn, công việc sống Ngơ Lê Minh Thư MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cảm ơn Mục lục Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm sinh học cá Tra 1.1.1 Phân loại 1.1.2 Phân bố 1.1.3 Hình thái, sinh lý 1.1.4 Ðặc điểm dinh dưỡng 1.1.5 Ðặc điểm sinh trưởng 1.1.6 Ðặc điểm sinh sản 1.2 Bệnh gan thận mủ cá da trơn cá Tra 1.2.1 Nguyên nhân gây bệnh 1.2.2 Lịch sử bệnh gan thận mủ cá da trơn cá Tra 1.2.3 Đặc tính vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ cá Tra 1.2.4 Đường lây truyền 1.2.5 Triệu chứng 1.2.6 Một số phương pháp điều trị phòng bệnh gan thận mủ cá Tra 1.3 Các chương trình chọn giống số loài thủy sản 10 1.3.1 Ngoài nước 10 1.3.2 Trong nước 13 1.4 Phương pháp lai, mơ hình toán phương pháp chọn lọc chọn giống cá Tra 16 1.4.1 Phương pháp lai 16 1.4.2 Các mơ hình tốn áp dụng cho ước tính thơng số di truyền tính trạng tăng trưởng tính trạng kháng bệnh gan thận mủ, tương quan di truyền hai tính trạng 16 1.4.3 Phương pháp chọn lọc 18 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 20 2.1.1 Thời gian nghiên cứu đề tài 20 2.1.2 Nơi thực đề tài nghiên cứu 20 2.2 Vật liệu nghiên cứu 20 2.3 Phương pháp nghiên cứu 21 2.3.1 Cho sinh sản ương nuôi gia đình từ quần đàn cá tra phục vụ đánh giá tăng trưởng khả kháng bệnh gan thận mủ 21 2.3.2 Đánh dấu PIT phân biệt cá thể 25 2.3.3 Gây bệnh gan thận mủ thực nghiệm cho cá giống gia đình sản xuất 27 2.3.4 Ước tính thơng số di truyền tính trạng tăng trưởng 30 2.3.5 Ước tính thơng số di truyền tính trạng kháng bệnh gan thận mủ 33 2.3.6 Ước tính tương quan di truyền tính trạng tăng trưởng kháng bệnh gan thận mủ 36 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 3.1 Kết sinh sản, ương ni đánh dấu từ PIT gia đình từ quần đàn cá Tra phục vụ đánh giá tăng trưởng khả kháng bệnh gan thận mủ 37 3.1.1 Kết sinh sản ương nuôi 37 3.1.2 Kết đánh dấu PIT cho cá Tra giống 38 3.2 Hệ số di truyền ước tính (h2), hệ số di truyền thực tế (H2) hiệu chọn lọc thực tế (R) tính trạng tăng trưởng 38 3.3 Kết thí nghiệm gây bệnh thực nghiệm gia đình chọn giống 39 3.3.1 Các yếu tố môi trường 39 3.3.2 Kết thí nghiệm gây bệnh thực nghiệm 42 3.4 Ước tính tương quan di truyền tính trạng tăng trưởng kháng bệnh gan thận mủ 51 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT BNP : Bacillary Necrosis of Pangasius BHIA : Brain Heart Infusion Agar cs : Cộng DO : Dissolved Oxygen EMB : Eosine Methylene Blue lactase Agar EBV : Estimated Breeding Value GIFT : Genetic Improvement of Farmed Tilapia HCG: : Human Chrionic Gonadotropin ID : Identification IPN : Infectious Pancreatic Necrosis LD : Letalisdosis LRM : Linear Repeatability model MSE : Mean Square Error PIT : Passive Integrated Transponder pH : potential Hydrogenii RPS : Relative Percent Survival SD : Standard Deviation SE: : Standard Error SUFA : Support of Freshwater Aquaculture TBM : Threshold Binary model TLM : Threshold liability model TSA : Trytone Soya Agar TSV : Taura Syndrome Virus WFM : Weibull Frailty model WSSV : White Spot Syndrome Virus DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) Hình 1.2 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri nhuộm gram Hình 1.3 Biểu bệnh gan (L), thận (K) tụy tạng (S) Hình 2.1 Vật liệu thiết bị đánh dấu cá 20 Hình 2.2 Sơ đồ chương trình chọn giống cá Tra .21 Hình 2.3 Vuốt tinh vuốt trứng cá Tra 23 Hình 2.4 Ấp trứng gia đình cá Tra lưới hình phễu 23 Hình 2.5 Các giai lưới ương cá hương thành cá giống 24 Hình 2.6 Đánh dấu PIT cho cá Tra giống 25 Hình 2.7 Bể composite 30 m3 để dưỡng cá thí nghiệm 26 Hình 2.8 Ao nuôi cá thương phẩm 26 Hình 2.9 Tiêm vi khuẩn tạo cá bệnh cohabitant 27 Hình 2.10 Phịng thí nghiệm cảm nhiễm cho cá 28 Hình 2.11 Cấy kiểm tra tác nhân vi sinh gây chết cá 30 Hình 2.12 Cân cá thương phẩm 31 Hình 3.1 Đồ thị biến động DO q trình thí nghiệm .40 Hình 3.2 Đồ thị biến động pH qúa trình thí nghiệm 41 Hình 3.3 Đồ thị biến động NH3 tự trình thí nghiệm 41 Hình 3.4 Đồ thị tỷ lệ chết cá thí nghiệm theo ngày (bể 1) 43 Hình 3.5 Đồ thị tỷ lệ chết cá thí nghiệm theo ngày (bể 2) 44 Hình 3.6 Đồ thị tỷ lệ chết theo gia đình cá thí nghiệm (Bể 1) 48 Hình 3.7 Đồ thị tỷ lệ chết theo gia đình cá thí nghiệm (Bể 2) 49 Hình 3.8 Đồ thị giá trị chọn giống EBV theo gia đình ước tính mơ hình tốn Threshold Binary model (TBM) 51 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Thí nghiệm gây bệnh thực nghiệm gan thận mủ đàn cá chọn giống 29 Bảng 3.1 Bảng phối hợp quần đàn bố mẹ .37 Bảng 3.2 Số lượng cá phục vụ đánh giá tăng trưởng kháng bệnh gan thận mủ .38 Bảng 3.3 Hệ số di truyền ước tính (h2), hệ số di truyền thực tế (H2) hiệu chọn lọc thực tế (R) tính trạng tăng trưởng quần đàn chọn giống 39 Bảng 3.4 Kết thí nghiệm gây bệnh thực nghiệm quần đàn chọn giống 42 Bảng 3.5 Số gia đình tham gia, tỷ lệ chết, số lượng cá chết, khối lượng trước sau thí nghiệm gây bệnh thực nghiệm 47 Bảng 3.6 Tỷ lệ chết theo gia đình cá thí nghiệm .48 Bảng 3.7 Hệ số di truyền (h2 ± Se) tính trạng kháng bệnh gan thận mủ ước tính mơ hình tốn TBM, LRM, WFM theo (WFMh), WFM theo ngày (WFMd) Giá trị bảng = ước tính ± sai số chuẩn 50 Bảng 3.8 Tương quan di truyền (rg) tính trạng tăng trưởng với tính trạng kháng bệnh gan thận mủ, ước tính mơ hình tốn TBM, LRM, WFM theo (WFMh), WFM theo ngày (WFMd) Giá trị bảng = ước tính ± sai số chuẩn 52 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Nuôi cá Tra nghề truyền thống Đồng sông Cửu Long Nghề nuôi cá Tra bắt đầu xuất từ nửa đầu kỷ 20; đến năm 1979, Việt Nam có nghiên cứu thành cơng sinh sản nhân tạo loại cá [1] Đến năm 2000, nhu cầu thị trường xuất tăng sản xuất giống cá Tra chủ động, nghề nuôi ngày phát triển Nghề nuôi cá Tra, Basa chuyển sang hướng sản xuất hàng hóa với qui mơ lớn Mơ hình ni phổ biến nuôi ao với mức độ thâm canh cao, suất lên đến 300-500 tấn/ha vụ nuôi Tuy nhiên, nghề nuôi bùng phát bộc lộ nhiều mặt yếu chất lượng giống kém, mơi trường ngày suy thối dẫn đến dịch bệnh Môi trường ô nhiễm dịch bệnh làm tỷ lệ sống trung bình cá Tra ni giảm từ 90% xuống cịn 80% vịng năm (2003 – 2008) [10] Các loại bệnh phổ biến nguy hiểm cá Tra Đồng sông Cửu Long năm 2007 gan thận mủ (51,2%), trắng mang trắng da, xuất huyết (42,5%), phù đầu phù mắt (20,7%) vàng da (21,6%) [10] Trong số này, bệnh gan thận mủ gây thiệt hại lớn cho nghề ni Trong vụ ni, bệnh xuất từ - lần, đặc biệt giai đoạn cá giống, tỷ lệ hao hụt đến 90% không chữa trị [4] Người nuôi sử dụng nhiều loại hóa chất, chế phẩm sinh học kháng sinh khác để cải thiện mơi trường phịng trị bệnh Tuy nhiên hiệu điều trị thấp, đồng thời xuất nguy suy giảm chất lượng sản phẩm sử dụng nhiều kháng sinh hóa chất Hiện chưa có vaccine phịng bệnh gan thận mủ cho cá Tra Trong vài năm tới, khả sản xuất vaccine phòng bệnh gan thận mủ cho cá tương đối cao hộ ni chủng ngừa cho cá trước thả nuôi Tuy nhiên phương pháp tăng khả kháng bệnh cho cá vaccine có số nhược điểm như: khó áp dụng rộng rãi phải tiêm tiêm nhắc lại, cá kháng bệnh tạm thời mà không di truyền cho đời sau, giá thành cao làm tăng chi phí sản xuất Nếu giống tạo có khả kháng bệnh phương pháp chọn lọc có nhiều ưu điểm so với phương pháp khác nhờ chúng có khả di truyền cho hệ sau Do chí phí thấp hiệu mang lại cao Chương trình chọn giống cá Tra Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II (Viện NCNTTS II) ước tính thơng số di truyền tính trạng kháng bệnh gan thận mủ hệ cá Tra chọn giống, cần ước tính thêm hệ để có sở kết luận chắn chắn Chính thế, đề tài “Ước tính thơng số di truyền tính trạng tăng trưởng kháng bệnh gan thận mủ phục vụ chương trình chọn giống cá Tra Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage 1878)” tiếp tục việc tính tốn thơng số di truyền tính trạng giúp chương trình xác định mục tiêu chọn giống phương pháp chọn lọc Chương trình chọn giống cá Tra theo hướng kháng bệnh nằm đề tài nghiên cứu thuộc Chương trình Cơng nghệ Sinh học cấp Nhà nước Viện NCNTTS II với đề tài: ”Đánh giá hiệu chọn giống cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) tăng trưởng, tỷ lệ philê” thực giai đoạn 2010 – 2012 Mục tiêu đề tài Tiếp tục đánh giá thông số di truyền để làm sở cho chọn giống cá Tra theo hướng kháng bệnh gan thận mủ nhằm góp phần giảm thiểu rủi ro, thiệt hại cho nghề nuôi, tăng suất, nâng cao chất lượng sản phẩm tính bền vững nghề nuôi cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) Nội dung nghiên cứu Ước tính thơng số di truyền tính trạng tăng trưởng, tính trạng kháng bệnh gan thận mủ tương quan di truyền hai tính trạng 152 100 88,24 153 94 100 154 93 100 155 100 77,78 156 100 100 157 100 90 158 94 81,25 159 87 89,47 160 73 60 161 100 100 163 100 100 164 94 87,5 165 50 55,56 166 75 81,82 167 80 77,78 168 88 83,33 169 83 75 170 88 95,24 171 100 95,24 172 93 93,33 173 88 100 174 93 100 175 80 66,67 176 100 90 177 100 100 178 87 90,91 179 93 90,91 180 100 100 181 92 100 182 100 93,75 183 100 100 184 100 100 185 75 58,33 186 100 100 187 100 88,24 188 94 100 189 100 100 190 100 100 191 100 100 192 100 92,86 193 100 100 194 100 100 195 82 75 196 75 100 197 100 100 198 75 72,73 199 100 100 202 100 91,67 203 93 73,33 204 73 75 205 100 100 206 40 72,73 207 78 100 208 100 100 209 100 100 210 60 60 10 211 100 92,86 212 91 100 213 59 72,73 214 84 100 215 88 72,73 216 80 66,67 217 92 83,33 218 46 100 219 93 75 220 94 91,67 221 83 100 222 82 80 223 93 100 224 71 91,67 226 85 100 227 83 66,67 228 80 100 229 100 93,33 230 67 100 231 100 87,5 232 50 73,33 233 100 77,78 234 100 100 235 100 100 236 94 100 237 70 85,71 238 91 100 239 36 54,55 11 240 88 100 241 82 100 242 86 90 243 67 88,89 244 75 100 245 75 75 246 75 66.67 247 53 80 248 63 83,33 249 100 88,89 250 100 71,43 251 83 83,33 252 70 100 253 79 100 254 78 85,71 255 70 40 256 93 73,33 257 83 93,33 258 63 66,67 259 65 37,5 260 93 92,86 261 46 73,33 262 100 87,5 264 58,33 81,82 266 46,15 75 267 92,31 100 268 83,33 81,82 269 78,57 100 12 Phụ lục 4: Kết khối lượng cá sống chết, trước sau thí nghiệm  CÁ CHẾT BỂ One-way ANOVA: TL versus NT Source DF NT SS MS F P 2737.5 2737.5 39.46 0.000 Error 5980 414807.7 69.4 Total 5981 417545.2 S = 8.329 R-Sq = 0.66% R-Sq(adj) = 0.64% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev -+ -+ -+ -+ S 2991 21.178 8.096 ( -* -) T 2991 19.825 8.555 ( * -) -+ -+ -+ -+ 20.00 20.50 21.00 Pooled StDev = 8.329 Grouping Information Using Tukey Method NT N Mean Grouping S 2991 21.178 A T 2991 19.825 B  CÁ CHẾT BỂ One-way ANOVA: TL versus NT Source DF NT SS MS F P 3422.7 3422.7 62.16 0.000 Error 5514 303625.5 55.1 Total 5515 307048.2 S = 7.421 R-Sq = 1.11% R-Sq(adj) = 1.10% 21.50 13 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev + -+ -+ -+- S 2737 19.978 7.316 ( * ) T 2779 18.402 7.522 ( * -) + -+ -+ -+18.60 19.20 19.80 20.40 Pooled StDev = 7.421 Grouping Information Using Tukey Method NT N Mean Grouping S 2737 19.978 A T 2779 18.402 B  CÁ SỐNG BỂ One-way ANOVA: TL versus NT Source DF NT SS MS F P 67.2 67.2 0.73 0.393 Error 784 72138.2 92.0 Total 785 72205.5 S = 9.592 R-Sq = 0.09% R-Sq(adj) = 0.00% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev -+ -+ -+ -+ S 393 23.816 8.895 ( * -) T 393 24.401 10.243 ( -* ) -+ -+ -+ -+ -23.10 23.80 24.50 25.20 Pooled StDev = 9.592 Grouping Information Using Tukey Method NT N Mean Grouping 14 T 393 24.401 A S 393 23.816 A  CÁ SỐNG BỂ One-way ANOVA: TL versus NT Source DF NT SS MS F P 32 32 0.30 0.584 Error 700 75241 107 Total 701 75273 S = 10.37 R-Sq = 0.04% R-Sq(adj) = 0.00% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev -+ -+ -+ -+ S 351 23.55 9.91 ( * -) T 351 23.12 10.81 ( * -) -+ -+ -+ -+ -22.40 23.10 23.80 24.50 Pooled StDev = 10.37 Grouping Information Using Tukey Method NT N Mean Grouping S 351 23.55 A T 351 23.12 A 15 Phụ lục 5: Tính toán LSM cho đàn G3-2001 ( DC: Đối chứng, TN: tự nhiên, * có ý nghĩa thống kê, P F