1 VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT TRẦN THỊ KIM DUNG TẠO CÁC HẠT NANOCHITOSAN-TRIPOLYPHOSPHATE CÓ KÍCH THƢỚC KHÁC NHAU BẰNG PHƢƠNG PHÁP LIÊN KẾT ION VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH ĐỐI KHÁNG VI SINH VẬT CỦA CHÚNG Ngành: Sinh học Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60.42.40 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS PHẠM VIỆT CƢỜNG Hà Nội - 2013 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài luận văn thạc sĩ, bên cạnh nỗ lực cố gắng thân có hƣớng dẫn nhiệt tình quý Thầy Cô, nhƣ động viên ủng hộ gia đình bạn bè suốt thời gian học tập nghiên cứu thực luận văn thạc sĩ Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Phạm Việt Cƣờng Phòng Công nghệ sinh học - Viện Hoá sinh biển- Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, ngƣời hết lòng giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho hoàn thành luận văn Đồng thời, xin đƣợc gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Nguyễn Thị Kim Cúc anh chị em Phòng Công nghệ sinh học - Viện Hoá sinh biển- Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tận tình giúp đỡ trình nghiên cứu Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến toàn thể quý Thầy Cô môn Vi sinh vật học hết lòng truyền đạt kiến thức quý báu nhƣ tạo điều kiện thuận lợi suốt trình học tập nghiên cứu hoàn thiện đề tài Cuối xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, bạn bè, ngƣời không ngừng động viên, hỗ trợ tạo điều kiện tốt cho suốt thời gian học tập thực luận văn Hà Nội, Ngày tháng năm 2013 Học viên Trần Thị Kim Dung Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỤC LỤC trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ MỞ ĐẦU Chƣơng - TỔNG QUAN 1.1 Chitosan 1.1.1.Cấu trúc chitosan 1.1.2 Tính chất chitosan 1.1.3 Cơ chế kháng khuẩn Chitosan 1.1.4 Ứng dụng chitosan lĩnh vực khoa học công nghệ 1.2 Tổng quan nano chitosan 1.2.1 Các phương pháp chế tạo nano chitosan 1.2.2 Ứng dụng hạt nano chitosan 1.2.3 Hoạt tính kháng khuẩn nano chitosan 1.3 Các chủng vi sinh vật thử nghiệm 1.3.1 Bacillus subtilis 1.3.2 Bacillus cereus 1.3.3 Micrococcus luteus 1.3.4 Listonella damsela 1.3.5 Candida albicans 1.3.6 Fusarium oxysporum 1.3.7 Aspergillus awamori Nakazawa Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Chƣơng - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Hóa chất dụng cụ thiết bị 2.1.1 Hóa chất 2.1.2 Dụng cụ 2.1.3 Thiết bị 2.1.4 Các chủng vi sinh vật thử nghiệm 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình tạo hạt nano chitosan phương pháp liên kết ion 2.2.1.1 Khảo sát ảnh hƣởng khối lƣợng phân tử chitosan 2.2.1.2 Khảo sát ảnh hƣởng tỷ lệ CS/TPP 2.2.1.3 Khảo sát ảnh hƣởng thời gian khuấy, tốc độ khuấy 2.2.2 Tạo loại hạt nano chitosan có kích thước khác phương pháp liên kết ion 2.2.3 Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật loại hạt nano chitosan có kích thước khác Chƣơng - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát yếu tố ảnh hƣởng đến trình tạo hạt nano chitosan - TPP 3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng khối lượng phân tử chitosan 3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ CS TPP 3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng tốc độ khuấy thời gian khuấy lên trình tạo hạt nano chitosan 3.2 Tạo loại hạt nano chitosan có kích thƣớc khác 3.3 Đánh giá hoạt tính đối kháng vi sinh vật loại hạt nano chitosan có kích thƣớc khác (CF2: 1000 nm, CF1: 450 nm, CF6: 100 nm) 3.3.1 Đánh giá khả kháng khuẩn loại hạt nano chitosan có kích thước khác 3.3.2 Đánh giá khả kháng nấm loại hạt nano chitosan có kích thước khác Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 3.3.2.1 Khả kháng nấm men Candida albicans loại hạt nano chitosan 3.3.2.2 Khả kháng nấm mốc loại hạt nano chitosan có kích thƣớc khác KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT CF2 Hạt nanochitosan-tripolyphosphate kích thƣớc 1000nm CF1 Hạt nanochitosan-tripolyphosphate kích thƣớc 450nm CF6 Hạt nanochitosan-tripolyphosphate kích thƣớc 100nm MIC90 Minimum Inhibitory concentration - Nồng độ ức chế tối thiểu MBC Minimum bactericidal Concentration - Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu MFC Minimum Fungicidal Concentration - Nồng độ diệt nấm tối thiểu OD Optical Density DD Degree of Deacetylation (Độ deacetyl hóa) DNA Deoxyribonucleic Acid FE-SEM Field Emission Scanning Electron Microscopy (Kính hiển vi điện tử quét phát xạ trƣờng) TPP Tripolyphosphate B.s Bacillus subtilis M.lu Micrococcus luteus V23 Bacillus cereus V1 Listonella damsela M15 Aspergillus awamori Nakazawa F.oxys Fusarium oxysporum C.ab Candida albicans KLPTTB Khối lƣợng phân tử trung bình CS Chitosan không xử lý C5 Chitosan xử lý lò vi sóng 600w/ phút C10 Chitosan xử lý lò vi sóng 600w/ 10 phút ηo : Độ nhớt đặc trƣng M: Khối lƣợng phân tử trung bình NMR: Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy) - phổ cộng hƣởng từ hạt nhân cs: Cộng Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Tóm tắt phƣơng pháp điều chế hạt nano chitoan làm chất dẫn loại thuốc, protein gen khác Bảng 2.1 Thành phần môi trƣờng MPA Bảng 2.2 Thành phần môi trƣờng Hansen Bảng 2.3 Thành phần môi trƣờng Czapek-Dox Bảng 3.1 : KLPTTB Chitosan xử lý không xử lý Bảng 3.2: Kích thƣớc hạt nano chitosan thu đƣợc điều kiện khác Bảng 3.3: Khả ức chế vi khuẩn hạt nanochitosan (%) Bảng 3.4: Giá trị MIC90 MBC chế phẩm với chủng vi khuẩn nghiên cứu Bảng 3.5: Khả ức chế Candida albicans hạt nanochitosan (%) Bảng 3.6: Giá trị MIC90 MFC chế phẩm với chủng Candida albicans Bảng 3.7: Khả ức chế nấm mốc hạt nanochitosan (%) Bảng 3.8: Giá trị MIC90 MFC chế phẩm với chủng nấm sợi nghiên cứu Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Quy trình thu nhận chitin chitosan Hình 1.2: Công thức cấu tạo chitin chitosan Hình 1.3 : Sơ đồ tạo hạt phƣơng pháp khâu mạch nhũ tƣơng Hình 1.4 : Sơ đồ tạo hạt phƣơng pháp giọt tụ, kết tủa Hình 1.5 : Sơ đồ tạo hạt phƣơng pháp tạo giọt nhũ tƣơng Hình 1.6: Sơ đồ tạo hạt phƣơng pháp mixen đảo Hình 1.7: Sơ đồ tạo hạt phƣơng pháp liên kết ion Hình 1.8: Hình thái Bacillus subtilis Hình 1.9: Hình thái Bacillus cereus Hình 1.10: Hình thái Micorcoccus luteus Hình 1.11 Hình thái Photobacterium damselae Hình 1.12 Hình thái Candida albicans Hình 1.13 Hình thái Fusarium oxysporum Hình 1.14 Hình thái Aspergillus awamori Nakazawa Hình 3.1: Kích thƣớc hạt nanochitosan với chitosan xử lý lò vi sóng Hình 3.2: Kích thƣớc hạt nanochitosan với chitosan không xử lý Hình 3.3: Dung dịch nano chitosan điều chế từ tỷ lệ CS/TPP khác (từ trái qua phải): 4:1, 5:1, 6:1 Hình 3.4: Kích thƣớc hạt nanochitosan với tốc độ khuấy1500v/2h Hình 3.5: Kích thƣớc hạt nanochitosan với tốc độ khuấy 4000v/2h Hình 3.6: Kích thƣớc hạt nanochitosan với tốc độ khuấy 8000v/2h Hình 3.7: Kích thƣớc hạt nanochitosan với tốc độ khuấy 8000v/1h Hình 3.8: Kích thƣớc hạt nanochitosan với tốc độ khuấy 8000v/3h Hình 3.9: Kích thƣớc hạt nanochitosan đƣợc báo cáo theo số lƣợng (a) theo cƣờng độ (b) mẫu CF2 Hình 3.10: Điện zeta hạt nanochitosan thu đƣợc từ mẫu CF2 Hình 3.11 Ảnh FE-SEM hạt nano chitosan mẫu CF2 Hình 3.12: Kích thƣớc hạt nanochitosan đƣợc báo cáo theo số lƣợng (c) theo cƣờng độ (d) mẫu CF1 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Hình 3.13 : Điện zeta hạt nanochitosan thu đƣợc từ mẫu CF1 Hình 3.14 Ảnh FE-SEM hạt nano chitosan mẫu CF1 Hình 3.15 :Kích thƣớc hạt nanochitosan đƣợc báo cáo theo số lƣợng (c) theo cƣờng độ (d) mẫu CF6 Hình 3.16: Điện zeta hạt nanochitosan thu đƣợc từ mẫu CF6 Hình 3.17 Ảnh FE-SEM hạt nano chitosan mẫu CF6 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 10 MỞ ĐẦU Chitosan dạng deacetyl hóa từ chitin, có cấu trúc polysaccharide, đƣợc tìm thấy loài động vật giáp xác, côn trùng vài loại nấm Với nhiều tính nhƣ tƣơng thích sinh học, phân hủy sinh học, bám dính màng không độc hại, trở thành nguyên liệu cho nhiều ứng dụng dƣợc sinh học đƣợc sử dụng làm nguyên liệu điều chế hạt nano chitosan năm gần tính chất ƣu việt kích thƣớc nano Hạt nano chitosan đƣợc tạo nhiều phƣơng pháp khác nhƣ phƣơng pháp khâu mạch nhũ tƣơng (emulsion cross-linking), phƣơng pháp giọt tụ/kết tủa (coacervation/precipitation), phƣơng pháp hợp giọt nhũ tƣơng (emulsion-droplet coalescence), phƣơng pháp liên kết ion (ionic gelation) phƣơng pháp mixen đảo (reverse micellar) Hiện phƣơng pháp đƣợc sử dụng nhiều liên kết ion, ƣu điểm phƣơng pháp trình chuẩn bị đơn giản không cần phải sử dụng dung môi hữu hay sử dụng lực nén lớn, phƣơng pháp đƣợc nghiên cứu rộng rãi tổng hợp chất dẫn thuốc thực phẩm chức Hạt nano chitosan tạo giữ đƣợc tính chất chitosan ban đầu mà tỏ vƣợt trội kích thƣớc nhỏ gọn, có diện tích tiếp xúc lớn chitosan thông thƣờng nên có hiệu kháng khuẩn cao nhiều lần so với chitosan Hoạt tính đối kháng vi sinh vật nano chitosan không phụ thuộc vào chủng loại vi sinh khác mà phụ thuộc nhiều vào kích thƣớc zeta hạt, việc lựa chọn quy trình tạo hạt nano chitosan đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật chúng vấn đề cần đƣợc nghiên cứu để ứng dụng không lĩnh vực y sinh, mà ứng dụng lĩnh vực khác nhƣ bảo quản trái cây, thực phẩm nhằm đáp ứng nhu cầu nƣớc hƣớng tới xuất Nhƣ biết Việt Nam nƣớc có nhiều loại trái cây, phong phú chủng loại nhiều loại độc quyền toàn giới, có giá trị xuất cao, nhiên việc bảo quản loại trái vấn đề nan giải, bảo quản không Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 67 Phụ lục 2: Đồ thị C - (ηdd /ηdm -1)/C mẫu Chitosan xử lý vi sóng 600w/5 phút (C5), Đồ thị C - (ηdd /ηdm -1)/C mẫu Chitosan xử lý vi sóng 600w/10 phút (C10) Đồ thị C - (ηdd /ηdm -1)/C mẫu Chitosan không xử lý (CS) y = 164877x + 296.27 R2 = 0.9811 600 (ηdd/ηdm -1)/c 500 400 300 CS 200 100 0 0.0005 0.001 0.0015 Ccs (g/ml) Đồ thị C - (ηdd /ηdm -1)/C mẫu Chitosan không xử lý Đồ thị C - (ηdd /ηdm -1)/C mẫu Đồ thị C - (ηdd /ηdm -1)/C mẫu Chitosan xử lý vi sóng 600w/5 phút Chitosan xử lý vi sóng 600w/10 phút Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 68 Phụ lục 3: Mật độ phát triển Bacillus subtilis môi trƣờng thạch sau 24h phơi nhiễm với hạt nano chitosan Chế phẩm Kháng sinh Chitosan CF2 CF1 CF6 Nồng độ chế phẩm (μg/ml) 0,3125 0,15625 0,07813 100 75 50 25 100 75 50 25 50 40 25 50 40 25 Số hóa Trung tâm Học liệu Bacillus subtilis Mật độ vsv % ức chế (CFU/ml) (1 ± 0,3) x 109 99,99 (1,7 ± 0,45) x 10 92,2 (7,8 ± 0,35) x 10 (2,1 ± 0,65) x 10 79 (2,4 ± 0,25) x 10 100 89,58 (2,5 ± 0,26) x 10 54,16 (1,1 ± 0,61) x 10 37,5 (1,5 ± 0,49) x 10 (2,4 ± 0,25) x 10 100 90,83 (2,2 ± 0,41) x 10 50 (1,2 ± 0,3) x 10 41,66 (1,4 ± 0,36) x 10 (2,4 ± 0,25) x 10 100 89,16 (2,6 ± 0,62) x 10 45,83 (1,3 ± 0,46) x 10 (1 ± 0,3) x 10 100 91 (0.9 ± 0,26) x 10 55 (4.5 ± 0,15) x 108 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 69 Sự phát triển Bacillus subtilis môi trƣờng kháng sinh (1) môi trƣờng có bổ sung kháng sinh nồng độ khác (2,3,4) 10 Sự phát triển Bacillus subtilis Sự phát triển Bacillus subtilis môi trƣờng có bổ sung chitosan môi trƣờng có bổ sung nano chitosan kích Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ nồng độ khác (5,6,7) thƣớc 1000 nm nồng độ khác (8,9,10) 70 11 12 13 Sự phát triển Bacillus subtilis môi trƣờng có bổ sung nano chitosan kích thƣớc 450 nm nồng độ khác (11,12,13) Số hóa Trung tâm Học liệu 14 15 16 Sự phát triển Bacillus subtilis môi trƣờng có bổ sung nano chitosan kích thƣớc 100 nm nồng độ khác (14,15,16) http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 71 Phụ lục 4: Mật độ phát triển Bacillus cereus môi trƣờng thạch sau 24h phơi nhiễm với hạt nano chitosan Chế phẩm Kháng sinh Chitosan CF2 CF1 CF6 Bacillus cereus Nồng độ chế phẩm (μg/ml) Mật độ vsv (CFU/ml) % ức chế 0,625 0,3125 0,2 0,15625 200 150 100 50 200 150 100 200 100 75 50 200 100 75 50 (1,8 ± 0,65) x 108 (2 ± 0,3) x 102 (1,6 ±0,58) x 107 (5,2 ±0,47) x 107 (1,8 ± 0,65) x 108 (1,7 ± 0,43) x 107 (0,91± 0,4) x 108 (1.12 ± 0,44) x 108 (1,1 ± 0,45) x 1010 (9,56 ± 0,41) x 108 (4,8 ± 0,46) x 109 (1,1 ± 0,45) x 1010 (2,9 ± 0,21) x 106 (1,08 ± 0,6) x 109 (3 ± 0,4) x 109 (1,8 ± 0,65) x 108 (4,2 ± 0,38) x 104 (1,7 ± 0,5) x 107 (3,4 ± 0,57) x 107 100 99,99 87,77 71,11 100 90,55 49,46 37,77 100 91,3 56,36 100 99,97 90,18 72,72 100 99,97 90,55 81,11 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 72 Phụ lục 5: Mật độ phát triển Micrococcus luteus môi trƣờng thạch sau 24h phơi nhiễm với hạt nano chitosan Chế phẩm Kháng sinh Chitosan CF2 CF1 CF6 Nồng độ chế phẩm (μg/ml) 2,5 1,25 200 100 50 40 200 100 50 40 100 50 40 25 50 40 25 Số hóa Trung tâm Học liệu Micrococcus luteus Mật độ vsv % ức chế (CFU/ml) (2,7 ± 0,36) x109 100 94,8 (1,4 ± 0,3) x 10 90,74 (2,5± 0,38) x 10 (2,7 ± 0,36) x10 100 99,97 (7,2 ± 0,36) x 10 91,48 (2.3 ± 0,51) x 10 84,81 (4,1± 0,7) x 10 10 (1,1 ± 0,21) x 10 100 99,99 (1 ± 0,26) x 10 93,09 (7,6 ± 0,77) x 10 88,18 (1,3 ± 0,55) x 10 10 (1,1 ± 0,21) x 10 100 98 (2,2 ± 0,4) x 10 90,36 (1,06 ± 0,35) x 109 83,63 (1,8 ± 0,15) x 10 (2,1 ± 0,4) x 10 100 91,9 (1,7 ± 0,65) x 10 86,19 (2,9 ± 0,46) x 10 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 73 Phụ lục 6: Mật độ phát triển Listonella damsela môi trƣờng thạch sau 24h phơi nhiễm với hạt nano chitosan Chế phẩm Kháng sinh Chitosan CF2 CF1 CF6 Listonella damsela Nồng độ chế phẩm (μg/ml) Mật độ vsv (CFU/ml) % ức chế (3,1 ± 0,32) x 1010 1,25 0,625 0,3125 0,2 0,15626 200 100 50 25 20 12,5 100 50 25 12,5 10 6,25 50 25 12,5 10 6,25 50 25 (5,1 ± 0,41) x 106 (1,1 ± 0,36) x 108 (2,9 ± 0,4) x 109 (6,6 ± 0,55) x 109 (3,1 ± 0,32) x 1010 (7,9 ± 0,53) x 102 (1,4 ± 0,41) x 104 (8,5 ± 0,55) x 107 (2,7 ± 0,65) x 109 (6,5 ± 0,4) x 109 (3,1 ± 0,32) x 1010 (7 ± 0,5) x 103 (3,8 ± 0,86) x 107 (9,2 ± 0,26) x 107 (3,4 ± 0,41) x 109 (1,2 ± 0,45) x 1010 (3,1 ± 0,32) x 1010 (6 ± 0,74)x 105 (6,6 ± 0,32) x 107 (2,8 ± 0,37) x 109 (9,1 ± 0,36) x 109 (3,1 ± 0,32) x 1010 (8,8 ± 0,45) x 105 100 99,98 99,67 90,64 78,71 100 99,99 99,99 99,72 91,3 79,03 100 99,99 99,87 99,70 89,03 61,29 100 99,99 99,79 90,96 70,64 100 99,99 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 74 12,5 10 6,25 (8,8 ± 0,41) x 107 (2,66 ± 0,5) x 109 (8,7 ± 0,3) x 109 99,71 91,42 71,93 Phụ lục 7: Mật độ phát triển Candida albicans môi trƣờng thạch sau 24h phơi nhiễm với hạt nano chitosan Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 75 Chế phẩm Kháng sinh Chitosan CF2 CF1 CF6 Candida albicans Nồng độ chế phẩm (μg/ml) Mật độ vsv (CFU/ml) % ức chế 50 25 10 2,5 1,25 0,625 200 100 50 40 25 12,5 200 100 50 25 12,5 100 50 25 20 12,5 100 50 25 20 12,5 (1,1 ± 0,45) x 108 (4,7 ± 0,7) x 104 (1,1 ± 0,64) x 105 (2,4 ± 0,47) x 105 (5,4 ± 0,45) x 105 (7,56 ± 0,75) x 106 (1,16 ± 0,61) x 107 (2,8 ± 0,4) x 109 (1,2 ± 0,53) x 103 (3,6 ± 0,65) x 106 (2,5 ± 0,62) x 108 (4,8 ± 0,4) x 108 (7,3 ± 0,43) x 108 (2,8 ± 0,4) x 109 (2,8 ± 0,55) x 102 (2 ± 0,47) x 106 (2,9 ± 0,81) x 108 (6,8 ± 0,61) x 108 (2,8 ± 0,4) x 109 (1,1 ± 0,4) x 105 (1,4 ± 0,56) x 108 (2,56 ± 0,61) x 108 (6,1 ± 0,6) x 107 (2,8 ± 0,4) x 109 (2,5 ± 0,32) x 105 (1,7 ± 0,38) x 108 (2,4 ± 0,55) x 108 (4,4 ± 0,4) x 108 100 99,96 99,91 99,80 99,55 93,12 89,45 100 99,99 99,87 91,07 82,85 73,93 100 99,99 99,93 89,64 76,07 100 99.99 95 90,85 78,21 100 99,99 94,28 91,43 83,92 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 76 21 22 23 Sự phát triển Candida albicans môi trƣờng có bổ sung chitosan nồng độ khác (21,22,23) Số hóa Trung tâm Học liệu 24 25 26 Sự phát triển Candida albicans môi trƣờng có bổ sung nano chitosan kích thƣớc 1000 nm nồng độ khác (24,25,26) http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 77 Phụ lục 8: Mật độ phát triển Fusarium oxysporum môi trƣờng thạch sau 24h phơi nhiễm với hạt nano chitosan Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 78 Chế phẩm Kháng sinh Chitosan CF2 CF1 CF6 Nồng độ chế phẩm (μg/ml) 50 35 25 125 62,5 31,25 25 15,625 125 62,5 31,25 25 15,625 31,25 25 15,625 7,813 6,5 31,25 25 15,625 7,813 6,5 33 Số hóa Trung tâm Học liệu Fusarium oxysporum Mật độ vsv % ức chế (CFU/ml) (3,8 ± 0,41) x 105 100 90,63 (3,56 ± 0,81) x 10 86,48 (5 ± 0,15) x 10 (1 ± 0,45) x 10 100 99,99 (3,7 ± 0,55) x 10 99,31 (6,9 ± 0,3) x 10 89,4 (1,06 ± 0,6) x 107 62 (3,8 ± 0,37) x 10 (1 ± 0,45) x 10 100 99,99 (1,9 ± 0,3) x 10 99,95 (5,1 ± 0,8) x 10 91,87 (8,13 ± 0,68) x 10 77,27 (2,5 ± 0,4) x 10 (1 ± 0,45) x 10 100 99,98 (1,8 ± 0,55) x 10 97,27 (3 ± 0,3) x 106 92,72 (8 ± 0,72) x 10 85,4 (1,46 ± 0,25) x 10 (1 ± 0,45) x 10 100 99,99 (1,3 ± 0,4) x 10 96,9 (3,1 ± 0,57) x 10 91,54 (8,46 ± 0,35) x 106 86,4 (1,36 ± 0,3) x 10 35 34 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 36 79 37 38 39 Sự phát triển Fusarium oxysporum môi trƣờng có bổ sung chitosan nồng độ khác (37,38,39) Số hóa Trung tâm Học liệu 40 41 42 Sự phát triển Fusarium oxysporum môi trƣờng có bổ sung nano chitosan kích thƣớc 1000 nm nồng độ khác (40,41,42) http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 80 Phụ lục 9: Mật độ phát triển Aspergillus awamori Nakazawa môi trƣờng thạch sau 24h phơi nhiễm với hạt nano chitosan Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 81 Chế phẩm Kháng sinh Chitosan CF2 CF1 CF6 Aspergillus awamori Nakazawa Nồng độ chế phẩm (μg/ml) Mật độ vsv (CFU/ml) % ức chế 50 25 12,5 10 1000 500 250 125 1000 500 250 125 500 250 125 62,5 500 250 125 62,5 (4,9 ± 0,47) x 105 (3,9 ± 0,32) x 103 (5,7 ± 0,6) x 103 (4,43 ± 0,58) x 104 (7,2 ± 0,61) x 104 (4,4 ± 0,51) x 106 (1,1 ± 0,45) x 105 (4,8 ± 0,61) x 105 (5,6 ± 0,75) x 105 (4,4 ± 0,51) x 106 (7,2 ± 0,65) x 104 (2,63 ± 0,47) x 105 (4,46 ± 0,75) x 105 (4,4 ± 0,51) x 106 (1,1 ± 0,66) x 104 (4,2 ± 0,75) x 105 (7,3 ± 0,62) x 105 (4,4 ± 0,51) x 106 (2 ± 0,4) x 103 (4,1 ± 0,71) x 105 (5,8 ± 0,8) x 105 100 99,18 98,81 90,96 85,30 100 97,7 89,09 87,27 100 98,3 94,02 89,86 100 99,75 90,45 83,4 100 99,95 90,68 86,82 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ [...]... liên kết ion và đánh giá hoạt tính đối kháng vi sinh vật của chúng" sẽ là tiền đề cho những nghiên cứu tiếp theo nhằm tiến tới sử dụng nano chitosan để tạo chế phẩm bảo quản quả tƣơi sau thu hoạch Mục tiêu của đề tài: 1 Tạo hạt nano chitosan -tripolyphosphate với kích thƣớc khác nhau bằng phƣơng pháp liên kết ion 2 Đánh giá hoạt tính đối kháng vi sinh vật của các loại hạt nano chitosan tạo thành Nội dung... nhanh, tạo điều kiện cho sự xâm nhiễm của các loài vi sinh vật, từ đó làm giảm giá trị dinh dƣỡng cũng nhƣ giá thành của sản phẩm Vấn đề đặt ra là tạo các chế phẩm sinh học bảo quản vừa an toàn, hiệu quả vừa thân thiện với môi trƣờng để thay thế cho các chế phẩm hóa học trƣớc đây Vì vậy, đề tài luận văn "Tạo các hạt nano chitosan -tripolyphosphate có kích thƣớc khác nhau bằng phƣơng pháp liên kết ion và đánh. .. sát các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tạo hạt nano chitosan -tripolyphosphate bằng phƣơng pháp liên kết ion (khối lƣợng phân tử chitosan, tỷ lệ chitosan:TPP, thời gian khuấy, tốc độ khuấy)  Tạo các loại hạt nano chitosan -tripolyphosphate có kích thƣớc khoảng 1000 nm, 500 nm và 100 nm  Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn (gram âm, gram dƣơng) của các loại hạt nano chitosan thu đƣợc ở trên bằng phƣơng pháp. .. TPP vào dung dịch chitosan dƣới tác động của máy đồng hóa IKA T25 digital ULTRA - TURRAX (Đức) với tốc độ khuấy lần lƣợt là 4000 vòng/phút trong 2h, 4000 vòng/phút trong 4h và 8000 vòng/ phút trong 1h 2.2.3 Đánh giá hoạt tính đối kháng vi sinh vật của các loại hạt nano chitosan kích thƣớc khác nhau bằng phƣơng pháp nuôi cấy trên môi trƣờng đặc hiệu của Ing và cs (2012) B1: Hoạt hóa chủng vi sinh vật. .. hiệu Xác định đƣợc giá trị MIC90 (nồng độ ức chế tối thiểu) và MBC (nồng độ diệt khuẩn tối thiểu) của các hạt nano chitosan có kích thƣớc khác nhau đối với mỗi chủng vi khuẩn khác nhau  Đánh giá hoạt tính kháng nấm (nấm men, nấm sợi) của các loại hạt nano chitosan thu đƣợc ở trên bằng phƣơng pháp nuôi cấy trên môi trƣờng đặc hiệu Xác định đƣợc giá trị MIC90 (nồng độ ức chế tối thiểu) và MFC (nồng độ... : Sơ đồ tạo hạt bằng phƣơng pháp giọt tụ, kết tủa http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 21 một thiết bị nén phun vào dung dịch kiềm để tạo hạt nano [30] * Phƣơng pháp hợp nhất giọt nhũ tƣơng Phƣơng pháp này lần đầu đƣợc sử dụng vào năm 1999 Phƣơng pháp này sử dụng nguyên tắc của cả hai phƣơng pháp: tạo nối ngang nhũ tƣơng và kết tủa Thay vì sử dụng tác nhân tạo nối ngang, kết tủa tạo ra bằng cách cho các giọt... Phƣơng pháp liên kết ion Cơ chế của phƣơng pháp này dựa trên tƣơng tác tĩnh điện giữa chitosan tích điện dƣơng và một polyanion nhƣ tripolyphosphate Kỹ thuật này có ƣu điểm là giai đoạn chuẩn bị đơn giản và thực hiện trong môi trƣờng nƣớc Đầu tiên chitosan đƣợc hòa tan vào dung dịch acid acetic Sau đó chitosan đƣợc trộn lẫn với polyanion để tạo hạt nano Hình 1.7: Sơ đồ tạo hạt bằng phƣơng pháp liên kết ion. .. Khoa học và Công nghệ Vi t Nam - Tripolyphosphat (TPP) – Sigma - CH3COOH, 99,5%, Trung Quốc - Nƣớc khử ion: phòng Vi sinh phân tử - Vi n Công nghệ sinh học - Vi n Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Vi t Nam ♦ Hóa chất dùng để pha môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật Hóa chất dùng cho nuôi cấy vi sinh vật: Agar (Ấn Độ), peptone (Đức) và các vi lƣợng muối khác (Trung Quốc) Các hóa chất dùng cho thí nghiệm khác đều... mỡ, Vi n Hóa học vật liệu - Máy đo FE-SEM HITACHI-S4800, Nhật, Vi n Khoa học vật liệu - Vi n Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Vi t Nam - Máy đo Zetasizer Ver 6.20, Malvern Instruments Ltd, Vi n Khoa học vật liệu Vi n Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Vi t Nam 2.1.4 Các chủng vi sinh vật thử nghiệm từ bộ sƣu tập của phòng Công nghệ sinh học - Vi n Hóa sinh biển 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Khảo sát các. .. kích thích và điều chỉnh thời điểm ra hoa và kết quả theo ý muốn, ngoài ra bản thân chitosan khi bị phân hủy trong đất còn giúp cải thiện đáng kể hệ vi sinh vật đất một cách chọn lọc Cụ thể nhƣ trên các cánh đồng đƣợc bón chitosan, số lƣợng các vi sinh vật có ích nhƣ Acitnomyces tăng lên cùng với sự suy giảm số lƣợng của các vi sinh vật có hại.[5] + Vỏ bao của hạt Chitinase đƣợc gia tăng hoạt động trong ... 2.2.2 Tạo loại hạt nano chitosan có kích thước khác phương pháp liên kết ion 2.2.3 Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật loại hạt nano chitosan có kích thước khác Chƣơng - KẾT... học trƣớc Vì vậy, đề tài luận văn "Tạo hạt nano chitosan -tripolyphosphate có kích thƣớc khác phƣơng pháp liên kết ion đánh giá hoạt tính đối kháng vi sinh vật chúng" tiền đề cho nghiên cứu nhằm... để tạo chế phẩm bảo quản tƣơi sau thu hoạch Mục tiêu đề tài: Tạo hạt nano chitosan -tripolyphosphate với kích thƣớc khác phƣơng pháp liên kết ion Đánh giá hoạt tính đối kháng vi sinh vật loại hạt