TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH – KTNN *** NGUYỄN THỊ LAN PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN ACETOBACTER XYLINUM CÓ KHẢ NĂNG TẠO MÀNG BACTERIAL CELLULOSE CÓ ĐẶC TÍNH DAI MỎNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học Hà Nội – 2011 Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN MỤC LỤC Trang PHẦN MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Mục tiêu đề tài Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa đề tài PHẦN NỘI DUNG CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vị trí đặc điểm phân loại Acetobacter xylinum sinh giới: 1.1.1 Vị trí phân loại Acetobacter xylinum 1.1.2 Đặc điểm phân loại Acetobacter xylinum 1.2 Đặc điểm chế hình thành màng bacterial cellulose 1.2.1 Đặc điểm cấu trúc màng bacterial cellulose 1.2.2 Cơ chế hình thành màng bacterial cellulose 1.3 Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum giới Việt Nam 1.3.1 Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum giới 1.3.2 Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum Việt Nam 11 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu thiết bị 12 2.1.1 Vi sinh vật 12 2.1.2 Thiết bị hoá chất 12 2.1.3 Môi trường 13 2.2 Phương pháp nghiên cứu 13 GVHD: ThS Nguyễn Thị Thùy Vân ii SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN 2.2.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn Acetobacter 13 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái – nuôi cấy chủng A.xylinum 14 2.2.2.1 Phương pháp quan sát hình thái tế bào kính hiển vi 14 2.2.2.2 Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc [1] 14 2.2.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh lý - sinh hoá chủng Acetobacter xylinum 15 2.2.3.1 Phương pháp kiểm tra hoạt tính catalase [11] 15 2.2.3.2 Phương pháp kiểm tra khả oxy hoá rượu ethanol thành acid acetic [11] 15 2.2.3.3 Xác định khả oxy hoá acid acetic [11] 15 2.2.3.4 Phương pháp xác định khả tổng hợp cellulose 16 2.2.4 Phương pháp xác định trọng lượng khô màng BC 19 2.2.5 Phương pháp xác định khả thấm hút nước màng BC (g/100cm2) 16 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập chủng Acetobacter xylinum 17 3.1.1 Làm giàu mẫu nguyên liệu 18 3.1.2 Phân lập vi khuẩn Acetobacter 19 3.1.3 Tuyển chọn chủng A.xylinum tạo màng Bacterial Celullose (màng BC) GVHD: ThS Nguyễn Thị Thùy Vân 21 iii SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN Tuyển chọn chủng có khả tạo màng BC dai, mỏng 24 3.3 Nghiên cứu số đặc tính sinh học chủng Acetobacter xylinum tuyển chọn 27 3.3.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái tế bào học chủng Acetobacter xylinum 27 3.3.2 Đặc điểm nuôi cấy chủng Acetobacter xylinum 28 3.3.3 Đặc điểm sinh lý - sinh hoá chủng Acetobacter xylinum 29 3.3.3.1 Khả đồng hoá nguồn cacbon chủng Acetobacter xylinum 29 3.3.3.2 Khả đồng hoá nguồn nitơ chủng Acetobacter xylinum 30 3.3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng chủng R1 B4 31 PHẦN KẾT LUẬN 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 GVHD: ThS Nguyễn Thị Thùy Vân iv SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN DANH MỤC HÌNH BẢNG BIỂU Trang HÌNH Hình 1.1 Tế bào vi khuẩn A.xylinum Hình 1.2 Sợi cellulose màng BC sợi cellulose thực vật Hình 1.3 Sự hình thành dải ribbon màng BC A.xylinum Hình 3.1 Qui trình phân lập vi khuẩn A.xylinum 17 Hình 3.2 Một số mẫu màng thu sau làm giàu nguyên liệu 19 Hình 3.3 Chuyển hóa ethanol thành acid acetic vi khuẩn 20 Hình 3.5 Một số loại màng chủng vi khuẩn hình thành bề mặt môi trường dịch thể 23 Hình 3.6 Khả tạo màng cellulose chủng A.xylinum 23 Hình 3.7 Các loại màng bacterial cellulose (BC) 26 Hình 3.8 Hình dạng tế bào hai chủng vi khuẩn A.xylinum 27 Hình 3.9 Khuẩn lạc A.xylinum 28 BẢNG Bảng 1.1 Đặc điểm sinh hóa chủng vi khuẩn A.xylinum Bảng 1.2 Các đặc điểm phân biệt Acetobacter Gluconobacter ( so sánh với Pseudomonas ) Bảng 3.1 Một số đặc tính màng BC 25 Bảng 3.2 Đặc tính khuẩn lạc vi khuẩn Acetobacter xylinum 28 Bảng 3.3 Khả đồng hóa nguồn cacbon chủng R1 B4 30 Bảng 3.4 Khả đồng hóa nguồn nitơ chủng R1 B4 31 Bảng 3.5 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng chủng R1 B4 GVHD: ThS Nguyễn Thị Thùy Vân 32 v SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ đầy đủ A xylinum Acetobacter xylinum BC Bacterial cellulose R1 Acetobacter xylinum R1 B4 Acetobacter xylinum B4 BHN2 Acetobacter xylinum BHN2 cs Cộng Cty Công ty GVHD: ThS Nguyễn Thị Thùy Vân vi SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Bỏng tai nạn thường gặp lao động sinh hoạt hàng ngày Ngoài tổn thương da, trường hợp bỏng nặng để lại di chứng đến khả vận động, thẩm mĩ sức khỏe người bệnh Ở Việt Nam, riêng viện bỏng quốc gia Hà Nội năm tiếp nhận khoảng 3000 bệnh nhân bỏng đủ nguyên nhân mức độ khác Hơn nửa số bệnh nhân bỏng trẻ em ¼ số bệnh nhân nhập viện bị bỏng sâu TS Nguyễn Viết Lượng trưởng phòng hành tổng hợp đồng thời người điều hành đề tài nghiên cứu Viện Bỏng Quốc gia cho biết: “Trước ca bỏng sâu dễ tử vong hồi thiếu loại thuốc đặc hiệu Thuốc nhập đắt” Nếu bệnh nhân bị bỏng nhẹ, diện tích vết bỏng nhỏ tế bào xung quanh tự phát triển dần phủ kín vết thương Nhưng vết bỏng sâu buộc phải cấy ghép da Song song với việc cấy ghép da việc tìm kiếm loại da tự thân, da dị loại loại màng sinh học thay da tạm thời điều trị Mặc dù da tự thân vật liệu lí tưởng nhiều trường hợp không đủ đáp ứng thể trạng bệnh nhân không cho phép lấy… Việc tìm kiếm loại da dị loại màng sinh học thay cho da tạm thời trở thành phương pháp hiệu Tuy nhiên loại da dị loại da ếch tươi, đông khô; da lợn tươi, đông lạnh lại có nhược điểm định việc sử dụng bị động, bảo quản xử lý phức tạp, khó sử dụng rộng rãi lâm sàng Chính vậy, vật liệu che phủ tạm thời từ loại màng sinh học lựa chọn số một, có vai trò quan trọng điều trị bỏng Một loại màng sinh học quan tâm ngày màng cellulose vi khuẩn Cellulose vi khuẩn có cấu trúc hoá học đồng với cellulose thực vật lại có số tính chất hoá lý đặc biệt độ bền học, khả GVHD: ThS Nguyễn Thị Thùy Vân SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN thấm hút nước cao, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, độ polymer lớn thích hợp làm màng trị bỏng Thế giới có nhiều nghiên cứu màng trị bỏng từ cellulose vi khuẩn Ở Việt Nam nghiên cứu vấn đề ít, có nghiên cứu nhóm tác giả Nguyễn Văn Thanh (2008) nhóm tác giả Đinh Thị Kim Nhung (2009) công bố Các loại màng trị bỏng phần lớn nhập ngoại với giá đắt đỏ Từ lí nói trên, định chọn đề tài nghiên cứu: “Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum có khả tạo màng Bacterial Cellulose ( màng BC ) có đặc tính dai, mỏng” Mục tiêu đề tài - Phân lập chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum (A.xylinum) từ số nguồn nguyên liệu Việt Nam - Tuyển chọn chủng A.xylinum phân lập có khả tạo màng Bacterial Cellulose dai, mỏng - Nghiên cứu số đặc tính sinh học chủng tuyển chọn Nội dung nghiên cứu - Phân lập chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum - Tuyển chọn chủng A.xylinum có khả tạo màng Bacterial Cellulose (BC) dai, mỏng - Nghiên cứu số đặc tính sinh học chủng A.xylinum Ý nghĩa đề tài - Đề tài nghiên cứu lựa chọn chủng A.xylinum có khả tạo màng BC dai mỏng Có triển vọng ứng dụng chế tạo màng trị bỏng GVHD: ThS Nguyễn Thị Thùy Vân SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN NỘI DUNG CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vị trí đặc điểm phân loại Acetobacter xylinum sinh giới: 1.1.1 Vị trí phân loại Acetobacter xylinum Tên gọi: Acetobacter xylinum tên gọi thức theo hệ thống danh pháp quốc tế 1990 Năm 1957, theo “Bergey’s manual of determinative bacteriology” A.xylinum xếp vào chi Acetobacter, thuộc họ Pseudomonadaceae, Pseudomonadales, lớp Schizomycetes [13] Đến năm 1974, theo “Bergey’s manual of determinative bacteriology”, A.xylinum lại coi loài phụ Acetobacter aceti, thuộc chi Acetobacter nhóm vào chi không rõ nguồn gốc [14] Năm 1984 Theo Bergey [4], Acetobacter xylinum xếp vào chi Acetobacter thuộc họ Acetobacteraceae Họ vi khuẩn gồm chi Acetobacter Gluconobacter Ngày nay, tồn nhiều quan điểm khác việc phân loại vi khuẩn acetic nói chung A.xylinum nói riêng Vấn đề gây nhiều tranh cãi, đòi hỏi cần có nhiều nghiên cứu 1.1.2 Đặc điểm phân loại Acetobacter xylinum * Đặc điểm hình thái - tế bào học A.xylinum có dạng hình que, thẳng hay cong, kích thước khoảng 2μm, tế bào đứng riêng lẻ xếp thành chuỗi, khả di động, không sinh bào tử Các tế bào bao bọc chất nhày tạo váng nhăn có chứa hemicellulose GVHD: ThS Nguyễn Thị Thùy Vân SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN 1m Hình 1.1 Tế bào vi khuẩn A.xylinum [36] Vi khuẩn A.xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, hiếu khí bắt buộc, hoá dị dưỡng Tế bào chúng thường tìm thấy giấm, dịch rượu, nước ép hoa quả, đất * Đặc điểm nuôi cấy Trên môi trường thạch đĩa, vi khuẩn A.xylinum hình thành khuẩn lạc nhẵn xù xì, rìa mép khuẩn lạc phẳng hay gợn sóng, màu trắng suốt, khuẩn lạc phẳng lồi lên dễ tách khỏi môi trường Vi khuẩn A.xylinum nuôi cấy môi trường lỏng điều kiện tĩnh, chúng hình thành bề mặt môi trường lớp màng BC [18] Ngược lại điều kiện nuôi lắc, cellulose hình thành dạng hạt nhỏ với kích thước không phân tán môi trường dinh dưỡng tạo đặc tính hình thái khác hẳn cellulose điều kiện nuôi cấy tĩnh [13] *Đặc điểm sinh lý – sinh hoá + Đặc điểm sinh lý Vi khuẩn A.xylinum phát triển nhiệt độ 25 - 350C, pH = - Nhiệt độ pH tối ưu tuỳ thuộc vào giống Ở 370C, tế bào suy thoái hoàn toàn môi trường tối ưu Tuy nhiên ý kiến khác nhiều tranh cãi điều kiện nhiệt độ, pH tối thích cho chủng vi khuẩn A.xylinum sinh trưởng tạo màng GVHD: ThS Nguyễn Thị Thùy Vân SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN Mỏng Váng màng Nhăn, dễ vỡ Mỏng dai Hình Một số loại màng chủng vi khuẩn hình thành bề mặt môi trường dịch thể Bước 2: Kiểm tra chất cellulose màng theo phương pháp 2.2.3.4: Nhỏ lugol H2SO4 60% vào màng tạo môi trường dịch thể chủng vi khuẩn Nếu màng có chất cellulose chuyển hoá thành màu xanh (phản ứng hemicellulose) Hình Khả tạo cellulose chủng A.xylinum GVHD: ThS Nguyễn Thị Thùy Vân 23 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN Kết chủng Acetobacter có chủng có khả hình thành màng BC Cụ thể: - Rượu vang: R1 - Bia Hà Nội: B4 - Nguồn vô : VC1 Ngoài ra, kiểm tra thêm số đặc tính sinh hoá khác chủng Acetobacter nói hoạt tính catalase, chuyển hoá glycerol thành dihydroxyaceton, khả sinh sắc tố nâu 11 tạm khẳng định chủng Acetobacter xylinum Hình Hoạt tính catalase Tuyển chọn chủng có khả tạo màng BC dai, mỏng Chúng sử dụng môi trường để khảo sát khả tạo màng chủng: Đây môi trường dùng nước dừa để thay cho nước thường môi trường sinh dưỡng thích hợp cho sinh trưởng khả tạo màng chủng Acetobacter xylinum chứa nhiều yếu tố quan trọng cho sinh trưởng tế bào (vitamin, acid amin nhân tố khoáng) Nuôi cấy chủng R1, B4, VC1 môi trường dịch thể có chứa nước dừa (MT3) nhiệt độ phòng (mùa hè), quan sát khả tạo màng chủng Sau ngày quan sát số đặc tính màng Kết thu bảng 3.1 GVHD: ThS Nguyễn Thị Thùy Vân 24 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN Sự hình thành màng BC chủng vi khuẩn khác Màng BC chủng có độ dày mỏng đặc tính khác Trong thực tiễn, chúng dùng với nhiều mục đích khác Song mục đích nghiên cứu màng BC điều trị bỏng, cần lựa chọn loại màng có độ mỏng dai tốt phù hợp với việc điều trị Chính loại màng chủng VC1 tạo không lựa chọn Chỉ B4 R1 dùng cho nghiên cứu Hai chủng đem so sánh với BHN2 hiệu tạo màng đặc điểm màng gần giống Bảng Một số đặc tính màng BC Màng BC VC1 Khối lượng (g/l) (**) 5,90 Độ dày (mm) Khả thấm nước Đặc điểm màng (g/100cm3) 0,6 – 0,7 10,01 Màng mỏng, dễ rách, màng hình thành từ ngày thứ Màng mỏng, dai, bề mặt B4 3,67 0,8 - 1,3 11,03 nhẵn ẩm, màng hình thành từ ngày thứ R1 4,50 1,2 - 1,5 12,40 BHN2 6,80 2,0 - 4,0 14,06 Màng dày, dai, màng hình thành từ ngày thứ Màng dày, dai, nhẵn, màng hình thành từ ngày thứ (**) Khối lượng khô trung bình màng BC GVHD: ThS Nguyễn Thị Thùy Vân 25 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN R1 VC1 B4 BHN2 Hình Các loại màng bacterial cellulose (BC) GVHD: ThS Nguyễn Thị Thùy Vân 26 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN 3 Nghiên cứu số đặc tính sinh học chủng Acetobacter xylinum tuyển chọn 3.3.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái tế bào học chủng Acetobacter xylinum Quan sát hình dạng tế bào chủng A.xylinum phân lập kính hiển vi LABOMED với độ phóng đại 100 lần Kết nghiên cứu cho thấy hình dạng tế bào chủng vi khuẩn sau: B4 R1 BHN2 Hình Hình dạng tế bào chủng vi khuẩn A.xylinum Nhận thấy, chủng B4, V1 BHN2 có hình que đứng riêng rẽ xếp thành chuỗi, không di động, bắt màu hồng Fucshin Mặt khác, tế bào vi khuẩn dài, có kích thước khoảng - 2m Điều giải thích chúng thuộc loài Acetobacter GVHD: ThS Nguyễn Thị Thùy Vân 27 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN 3.3.2 Đặc điểm nuôi cấy chủng Acetobacter xylinum Khi phát triển bề mặt môi trường đặc vi sinh vật nói chung vi khuẩn nói riêng hình thành khuẩn lạc đặc trưng loài Vì việc miêu tả khuẩn lạc việc cần thiết nghiên cứu đặc tính sinh học chủng vi khuẩn Đặc điểm khuẩn lạc chủng trình bày bảng sau: Bảng Đặc tính khuẩn lạc vi khuẩn Acetobacter xylinum Đặc điểm Đặc tính Hình dạng khuẩn lạc quang học Màu sắc Bề mặt Cấu trúc B4 Tròn có vành Đục Vàng sẫm Bóng Dạng hạt nhỏ R1 Tròn Bán Vàng sẫm Bóng Dạng hạt nhỏ BHN2 Tròn có vành Đục Vàng sẫm Bóng Dạng hạt lớn CHỦNG BHN2 CHỦNG R1 CHỦNG B4 Hình Khuẩn lạc vi khuẩn A.xylinum GVHD: ThS Nguyễn Thị Thùy Vân 28 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN Khi sinh trưởng bề mặt môi trường đặc chủng vi khuẩn A.xylinum phân lập hình thành khuẩn lạc khác nhau: khuẩn lạc chủng B4 có dạng hạt lớn, tròn có vành, màu vàng sẫm bề mặt nhẵn bóng Chủng R1 khuẩn lạc lại có dạng hạt nhỏ, tròn, màu vàng sẫm bề mặt nhẵn bóng Tốc độ sinh trưởng chủng khác nhau: R1 (5- ngày), B4 (3- ngày) Nguyên nhân khác giải thích chủng nghiên cứu phân lập từ đa dạng nguồn vật liệu khác (R1 phân lập từ rượu vang, B4 phân lập từ bia chủng B4 có đặc điểm khuẩn lạc giống với BHN2 khác cấu trúc khuẩn lạc nhỏ hơn) 3.3.3 Đặc điểm sinh lý - sinh hoá chủng Acetobacter xylinum 3.3.3.1 Khả đồng hoá nguồn cacbon chủng Acetobacter xylinum Vi sinh vật đặc trưng khả sử dụng không giống loại hydrat carbon rượu khác Khi nghiên cứu đa số vi sinh vật dị dưỡng cần phải xác định nguồn hydrat carbon rượu đảm bảo cho loại vi sinh vật cần nghiên cứu phát triển biến đổi xảy môi trường chúng phát triển 11 Để khảo sát khả đồng hoá nguồn cacbon chủng Acetobacter xylinum phân lập sử dụng nguồn sau đây: Glucose, saccharose, ethanol Tiến hành thí nghiệm chủng Acetobacter xylinum R1, B4 Nuôi cấy chủng vi khuẩn nói môi trường dịch thể (môi trường 3) có thay đổi nguồn carbon khác Nuôi điều kiện tĩnh nhiệt độ 300C, sau 3-4 ngày kiểm tra sinh trưởng tế bào vi khuẩn, pH môi trường sau lên men Kết thí nghiệm trình bày bảng 3.3 GVHD: ThS Nguyễn Thị Thùy Vân 29 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN Bảng 3 Khả đồng hóa nguồn cacbon chủng R1 B4 so sánh với chủng BHN2 Chủng Glucose Saccharose Ethanol R1 + + + B4 + + + BHN2 + + + (+) : sinh trưởng tốt Kết bảng 3.3 cho thấy khả đồng hoá nguồn cacbon chủng nghiên cứu giống Theo dõi biến đổi pH môi trường trước sau lên men ta thấy hầu hết chủng làm acid hoá môi trường, pH môi trường sau lên men giảm lượng acid acetic tích luỹ dịch lên men 11 3.3.3.2 Khả đồng hoá nguồn nitơ chủng Acetobacter xylinum Tiếp tục khảo sát khả đồng hoá nguồn nitơ chủng A.xylinum kể Nguồn Nitơ sử dụng bao gồm: + Nguồn nitơ hữu cơ: pepton + Nguồn nitơ vô cơ: Amon ( (NH4)2SO4); Nitrat ( NaNO3); Nitrit ( NaNO2) Cấy chủng nghiên cứu lên môi trường dịch thể (môi trường 3) có thay đổi nguồn nitơ khác Nuôi điều kiện tĩnh nhiệt độ 300C Sau 3-4 ngày kiểm tra sinh trưởng tế bào vi khuẩn mẫu thí nghiệm Kết thí nghiệm trình bày bảng 3.4 GVHD: ThS Nguyễn Thị Thùy Vân 30 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN Bảng 3.4 Khả đồng hóa nguồn nitơ chủng R1 B4 so sánh với chủng BHN2 Chủng Pepton Amon Nitrat Nitrit R1 ++ + - - B4 ++ + + - BHN2 ++ + + - Chú thích: + + : Sinh trưởng tốt + : Sinh trưởng yếu - : Không sinh trưởng Nhận thấy chủng phân lập củng BHN2 sinh trưởng tốt môi trường có chứa nitơ hữu cơ, sinh trưởng yếu môi trường có chứa nitơ vô Hầu hết chủng nghiên cứu khả sử dụng nguồn nitơ nitrit Kết cho thấy khác nhiều khả sử dụng nguồn nitơ chủng A.xylinum phân lập từ nguồn vật liệu khác chủng A.xylinum có hình dạng tế bào hình thái khuẩn lạc khác 3.3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng chủng R1 B4 Tiến hành cấy chủng trên môi trường thạch nghêng Nuôi nhiệt độ 27 – 350C ( nhiệt độ phòng), 200C ( điều hòa), 450C (tủ ấm) ( chủng sử dụng ống nghiệm / nhiệt độ) Sau – ngày ta lấy để quan sát mắt thường mức độ phát triển chủng Sau lại cấy thạch nghiêng lần thứ 2, nguyên liệu dùng để cấy tế bào lần cấy thứ Sau lại nuôi nhiệt độ khác kể Sau – ngày tiếp tục lấy quan sát mức độ sinh trưởng mắt thường Theo dõi mức độ: không GVHD: ThS Nguyễn Thị Thùy Vân 31 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN sinh trưởng, sinh trưởng yếu, sinh trưởng tốt Kết thí nghiệm trình bày bảng 3.5 Bảng Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng chủng R1 B4 so vói BHN2 Chủng 200C 27 - 350C 450C R1 + ++ - B4 - ++ - BHN2 + ++ - (-): không sinh trưởng (+): sinh trưởng yếu (++): sinh trưởng tốt Nhận thấy chủng phân lập chủng BHN2 đối chứng sinh trưởng tốt nhiệt độ phòng (27- 350C), sinh trưởng nhiệt độ 450C Ở nhiệt độ 200C có chủng R1 BHN2 sinh trưởng với tốc độ chậm Như vậy, kết luận được: chủng A.xylinum phân lập thuộc loại ưa ấm, sinh trưởng tốt khoảng nhiệt độ từ 27- 350C GVHD: ThS Nguyễn Thị Thùy Vân 32 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Từ nguồn nguyên liệu phân lập chủng có khả hình thành màng môi trường lỏng - Trong chủng phân lập chủng ( R1; B4) có khả hình tạo màng BC dai, mỏng - Hai chủng có đặc điểm hình thái: tế bào có dạng hình que, hình elip, đứng độc lập hay xếp thành chuỗi Khuẩn lạc có hình tròn, màu vàng sẫm, bề mặt nhẵn bóng Chúng sinh trưởng tốt môi trường có nguồn cacbon glucose, saccharose , ethanol nguồn nitơ hữu sinh trưởng tốt nguồn nitơ vô Chúng sinh trưởng tốt nhiệt độ từ 27 – 350C Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng môi trường điều kiện nuôi cấy tới khả tạo màng BC hai chủng R1 B4 - Nghiên cứu đặc điểm màng BC từ chủng R1 B4 bước đầu ứng dụng chế tạo màng trị bỏng GVHD: ThS Nguyễn Thị Thùy Vân 33 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Lân Dũng (1976) Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập 1- 2- 3, Nhà xuất khoa học kỹ thuật Hà Nội Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo, Vương Trọng Hào (1990) Thực hành vi sinh vật Nxb giáo dục, tr 17-34, 63-74, 89-92 Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo, Vương Trọng Hào (1990) Thực hành vi sinh vật Nxb giáo dục, tr 17-34, 63-74, 89-92 Vũ Thị Minh Đức (2001) Thực tập vi sinh vật Nxb ĐHQG Hà Nội, tr 150 Đặng Thị Hồng (2007), phân lập, tuyển chọn nghiên cứu số đặc tính sinh học vi khuẩn Acetobacter xylinum chế tạo màng sinh học, Luận văn thạc sỹ sinh học ĐHSP Hà Nội Huỳnh Thị ngọc Lan, Nguyễn Văn Thanh Nghiên cứu đặc tính màng cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum sử dụng làm màng trị bỏng số 361, Tạp chí dược học số 361, 2006 Nguyễn Thị Nguyệt, Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng Bacterial cellulose làm mặt nạ dưỡng da Luận văn Thạc sỹ sinh học ĐHSP Hà Nội, 2008 Đinh Thị Kim Nhung (1996), Nghiên cứu số đặc điểm sinh học vi khuẩn Acetobacter ứng dụng chúng lên men acid acetic theo phương pháp chìm, Luận án Tiến sỹ Sinh học Trường Đại học Tổng hợp Hà Nội Lương Đức Phẩm Công nghệ vi sinh vật Nxb Nông nghiệp, 2004, tr – 143 10 Trần Linh Thước (2006) Phương pháp phân tích vi sinh vật Nxb giáo dục, 2006, tr 1- 29, 40- 69 GVHD: ThS Nguyễn Thị Thùy Vân 34 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN 11 Nguyễn Thị Thùy Vân (2009) Nghiên cứu đặc tính sinh học khả tạo màng Bacterial cellulose vi khuẩn Acetobacter xylinum phân lập từ số nguồn nguyên liệu Việt Nam, Luận văn Thạc sỹ khoa học sinh học, trường ĐHSP Hà Nội 12 Alexander Steinbuchel, Sang Ki Rhee (2005) Polysaccharides and polyamides in the food industry, www.wiley vch pp 31-85 13 Alina Krystynowicz, Marianna Turkiewicz, Stanislaw Bielecki, Emilia Klemenska, Aleksander Masny, Andrzej Plucienniczak (2005) Molecular basis of cellulose biosynthesis disappearance in submerged culture of Acetobacter xylinum, Acta biochimica polonica, Vol 52, pp 691-698 14 Barbara Surma – S’lusarska, Sebastion, Presler, Dariusz Danielewicz (2008) Characteristics of Bacterial Cellulose Obtained from Acetobacter xylinum culture for applycation in papermarking FIBRES TEXTILES in Eastem Europe, vol.16, No.4,pp.108 – 111 15 Breed R.S., Murray E.G.D, Smith N.R (1957) Bergey’s manual of determinative bacteriology The Williams and Wilkins company, Baltimore 16 Brown R.M (1999), “Cellulose structure and biosynthesis”, Pure Appl Chem 71 (5), p 765-775 17 Brown R.M (1999), Microbial c as a building block resource for specialty product and processes there fore, PCT Int Appl Wo 8912107 Al 18 Bungay H.R, Improved production of microbial cellulose, Email: bungah@rpi.edu 19 Bworn E (2007) Bacterial Cellulose – Thermoplastic polime nanocomposites, Master of scien in chemical engineering, Washington state university GVHD: ThS Nguyễn Thị Thùy Vân 35 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN 20 Coucheron D.H (1991), “An Acetobacter xylinum insertion sequence element associated with inactivation of cellulose production”, Journal of bacteriology, pp.5723 – 5731 21 Coucheron D.H (1993), “A family of IS 1030 element in the genome of Acetobacter xylinum: nucleotide sequences and strain distribution”, Molecular microbiology, Vol 9(1), pp 211-218 22 Elvie Escoro Brown (2007) Bacterial cellulose thermoplastic polymer nanocompositer Master of science in chemical engneering, Washington state university, Department of chemical engineer,pp.1-6 23 Frateur J (1950) Essai sur la systématique des Acétobacter La cellule, Vol 53, pp 278-398 24 Gromet Z., Hestrin S (1962), “Synthesis of cellulose by Acetobacter xylinum”, J Bacieriol, Vol.85, No 2, pp 284 – 292 25 Jonas and Farah, 1998 R Jonas and L.F Farah, Production and application of microbial cellulose, Polymer Degradation and Stability 59 (1998), pp 101–106 26 Kadebe T.T., Miyanmoto T., Oniang K R., Kutima M.P.O., Njoroge M.S (2008), “Isolation and identifican of the genara Acetobacter and Gluconobacter in coconut toddy (mnazi)”, African Journal of biotechlogy, Vol 7, No 16, pp 2963 – 2971 27 Koichi Nabe, Nobuhiko Izuo, Shigeki Yamada, and Ichiro Chibata (1997) “Conversion of Glycerol to Dihydroxyacetone by Immobilized Whole Cells of Acetobacter xylinum”, Applied and invironmental microbiology, Vol.36, No.6, pp.1056 – 1060 28 Neelobon Suwannapinunt, Jiraporn Burakorn, Suwanncee Thaenthanee “Effect of culture conditions on bacterial cellulosee (BC) production from Acetobacter xylinum TISTR976 and physical properties of GVHD: ThS Nguyễn Thị Thùy Vân 36 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN BC parchment paper” Vol 14, N o 4, Suranaree J.Sci Technol, 2007, p 357- 365 29 Ring D.F., Nashed W., Dow T (1998), Liqid loaded pad for medical applications, United states Johnson & Johnson Patient Care, InC ( New Bruns wick, NJ) 4788146 30 Schramm M., Gromet Z., Hestrin S (1957) Synthesis of cellulose by Acetobacter xylinum, Vol 67, pp 284 – 292, 699 – 679 31 Schramm M., Hestrin S (1954) “Factor affecting production of cellulose at the air/liquid interface of a culture of Acetobacter xylinum”, J.gen Microbiol, Vol 11, pp 123-129 32 Wong H.C., Fear A.L., Calhoon R.D., Eichinger G.H., Mayer R., Amikam D., Benziman M., Gelfand D.H, Meade J.H., Emrick A.W., Bruner R., Tal R., (1990), “ Genetic organization of the cellulose synthase operon in Acetobacter xylinum”, Genetics, Vol.87, pp 8130 – 8134 33 Zaar K (1979), Visualization of pores (export sites) correlated with cellulose production in the envelope of gram-negative bacterium Acetobacter xylinum”, J.Cell Biology, Vol 80,pp.773 – 777 TL62 34 http://www.esf.edu/cellulose/conferences/cel-phf/saxena.pdf 35 http://.www.res.titech.ac.fp/rfukan/english/cellulose/index.html 36 http://.www.azonano.com/news.aspx?.news.ID=8590 GVHD: ThS Nguyễn Thị Thùy Vân 37 SV: Nguyễn Thị Lan [...]... Thị Ngọc Lan (2006) đã tuyển chọn chủng có khả năng tạo màng trị bỏng có màu trắng với độ dày 0,5mm và có kích thước khác nhau tùy theo yêu cầu sử dụng; nhóm nghiên cứu của PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung khi tiến hành khảo sát khả năng tạo màng của vi khuẩn Acetobacter xylinum đã phân lập tuyển chọn được 65 chủng vi khuẩn trong đó có chủng BHN2 có triển vọng ứng dụng tốt Ngoài ra còn có các nghiên cứu của... các môi trường đặc thì vi sinh vật nói chung và vi khuẩn nói riêng sẽ hình thành các khuẩn lạc đặc trưng của loài đó Vì vậy vi c miêu tả khuẩn lạc là một trong những vi c cần thiết khi nghiên cứu đặc tính sinh học của các chủng vi khuẩn Đặc điểm của khuẩn lạc của 2 chủng được trình bày trong bảng sau: Bảng 3 2 Đặc tính khuẩn lạc vi khuẩn Acetobacter xylinum Đặc điểm Đặc tính Hình dạng khuẩn lạc quang... trên các môi trường lỏng; Acetobacter pasteurianum tạo váng khô và nhăn nheo 11 Vì thế để tuyển chọn được các chủng Acetobacter xylinum có khả năng tạo màng BC từ các chủng Acetobacter đã phân lập được ở trên cần tiến hành theo các bước như sau: Bước 1: Khảo sát khả năng tạo màng BC của các chủng Acetobacter đã phân lập trên môi trường 3 Tiến hành nuôi cấy 8 chủng vi khuẩn Acetobacter trong môi trường... LUẬN 3 1 Phân lập chủng Acetobacter xylinum Nguyên liệu được sử dụng để phân lập vi khuẩn A .xylinum gồm 4 nguồn được chia làm 2 nhóm: - Nhóm có nồng độ rượu cao: Rượu vang, bia Hà Nội - Nhóm có nồng độ đường cao: chuối, nguồn vô cơ (saccharose và ethanol) Qui trình phân lập vi khuẩn A .xylinum 1.Làm giầu mẫu nguyên liệu 2 .Phân lập, thu các chủng vi khuẩn từ mẫu màng 3 .Tuyển chọn các chủng có khả năng sinh... chủng vi khuẩn từ mẫu màng 3 .Tuyển chọn các chủng có khả năng sinh acid 4 .Tuyển chọn các chủng có khả năng oxy hóa ethanol thành acid 5 .Tuyển chọn các chủng có khả năng oxy hóa acetate 6 .Tuyển chọn các chủng có khả năng tạo màng trên bề mặt môi trường 7.Kiểm tra bản chất cellulose của màng Hình 3.1 Qui trình phân lập vi khuẩn A .xylinum GVHD: ThS Nguyễn Thị Thùy Vân 17 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt... (2006) đã nghiên cứu chọn lọc dòng A .xylinum thích hợp cho các loại môi trường dùng trong sản xuất cellulose vi khuẩn với quy mô lớn Nguyễn Thị Nguyệt (2008) đã nghiên cứu vi khuẩn A .xylinum cho màng Bacterial cellulose làm mặt nạ dưỡng da, Nguyễn Thị Thùy Vân (2009) đã nghiên cứu đặc tính sinh học và khả năng tạo màng Bacterial cellulose của vi khuẩn A .xylinum và đã phân lập được 14 chủng từ một số nguồn... quả tạo màng và đặc điểm màng gần giống nhau Bảng 3 1 Một số đặc tính của màng BC Màng BC VC1 Khối lượng (g/l) (**) 5,90 Độ dày (mm) Khả năng thấm nước Đặc điểm màng (g/100cm3) 0,6 – 0,7 10,01 Màng mỏng, dễ rách, màng hình thành từ ngày thứ 3 Màng mỏng, dai, bề mặt B4 3,67 0,8 - 1,3 11,03 nhẵn ẩm, màng hình thành từ ngày thứ 3 R1 4,50 1,2 - 1,5 12,40 BHN2 6,80 2,0 - 4,0 14,06 Màng khá dày, dai, màng. .. kiitzingianum, Acetobacter linderni, Acetobacter acetosum, Acetobacter suboxydans 11 Trong đó có một số loài cũng hình thành lớp màng hoặc lớp váng trên bề mặt môi trường lỏng trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, lớp màng này rất dễ nhầm với màng Bacterial Cellulose do vi khuẩn Acetobacter xylinum tạo ra Ví dụ như Acetobacter schiitzenbachii có khả năng tạo váng dày không bền vững; Acetobacter kiitzingianum tạo màng. .. Acetobacter có 3 chủng có khả năng hình thành màng BC Cụ thể: - Rượu vang: R1 - Bia Hà Nội: B4 - Nguồn vô cơ : VC1 Ngoài ra, kiểm tra thêm một số đặc tính sinh hoá khác của 3 chủng Acetobacter nói trên như hoạt tính catalase, chuyển hoá glycerol thành dihydroxyaceton, khả năng sinh sắc tố nâu 11 có thể tạm khẳng định các chủng này đều là Acetobacter xylinum Hình 3 6 Hoạt tính catalase 3 2 Tuyển chọn các chủng. .. 3 2 Tuyển chọn các chủng có khả năng tạo màng BC dai, mỏng Chúng tôi sử dụng môi trường 3 để khảo sát khả năng tạo màng của 3 chủng: Đây là môi trường dùng nước dừa để thay thế cho nước thường là môi trường sinh dưỡng rất thích hợp cho sự sinh trưởng cũng như khả năng tạo màng của các chủng Acetobacter xylinum vì nó chứa nhiều yếu tố quan trọng cho sự sinh trưởng của tế bào (vitamin, acid amin và các ... BC ) có đặc tính dai, mỏng Mục tiêu đề tài - Phân lập chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum (A .xylinum) từ số nguồn nguyên liệu Vi t Nam - Tuyển chọn chủng A .xylinum phân lập có khả tạo màng Bacterial. .. Bacterial Cellulose dai, mỏng - Nghiên cứu số đặc tính sinh học chủng tuyển chọn Nội dung nghiên cứu - Phân lập chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum - Tuyển chọn chủng A .xylinum có khả tạo màng Bacterial. .. trình phân lập vi khuẩn A .xylinum 1.Làm giầu mẫu nguyên liệu 2 .Phân lập, thu chủng vi khuẩn từ mẫu màng 3 .Tuyển chọn chủng có khả sinh acid 4 .Tuyển chọn chủng có khả oxy hóa ethanol thành acid 5.Tuyển