TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH – KTNN ĐỖ THỊ NGA TỐI ƢU HÓA MÔI TRƢỜNG DINH DƢỠNG CHO VIỆC TẠO MÀNG BC TỪ CHỦNG VI KHUẨN ACETOBACTER XYLINUM BHN2 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Chuyên ngành: Vi sinh vật GVHD: TS Dƣơng Minh Lam PGS TS Đinh Thị Kim Nhung Hà Nội, 2012 LỜI CẢM ƠN Em xin gƣ̉i lời cảm ơn chân thành tới TS Dƣơng Minh Lam PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung Em xin gửi lời cảm ơn tới ThS Nguyễn Khắc Thanh đã hƣớng dẫn, chỉ bảo tận tình, giúp đỡ tạo điều kiện cho để em thƣ̣c hiện và hoàn thành tốt khóa luận này Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trƣờng ĐHSP Hà Nội 2, khoa Sinh-KTNN, phòng thí nghiệm vi sinh vật, cùng các thầy cô tổ môn vi sinh, ban bảo vệ đã tạo điều kiện giúp đỡ em Em xin cảm ơn sƣ̣ giúp đỡ quan tâm động viên của bạn bè, gia đì nh suốt quá trì nh hoàn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 05 năm 2012 Sinh viên Đỗ Thị Nga LỜI CAM ĐOAN Để đảm bảo tí nh trung thƣ̣c của đề tài, xin cam đoan: Đề tài của không chép bất cƣ́ tài liệu sẵn có Đề tài của không trùng lặp với một đề tài nào khác Kết quả thu đƣợc đề tài là tƣ̣ bản thân nghiên cƣ́u thƣ̣c tiễn đảm bảo tí nh chí nh xác và trung thƣ̣c Hà Nội, tháng 05 năm 2012 Tác giả Đỗ Thị Nga MỤC LỤC Lời cảm ơn Lời cam đoan Danh mục các từ viết tắt Danh mục hình bảng biểu MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài 2 Nội dung của đề tài 3 Ý nghĩa của đề tài Mục tiêu của đề tài CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vị trí đặc điểm phân loại của A.xylinum sinh giới 1.1.1 Vị trí phân loại của A.xylinum 1.1.2 Đặc điểm phân loại của A.xylinum 1.2 Nhu cầu dinh dƣỡng của vi khuẩn A.xylinum 1.2.1 Ảnh hƣởng của nguồn cacbon 1.2.2 Nhu cầu nitơ của vi sinh vật 1.2.3 Nguồn dinh dƣỡng khoáng 1.2.4 Các chất kích thích sinh trƣởng 1.3 Đặc điểm chế hình thành màng Bacterial cellulose 10 1.3.1 Đặc điểm cấu trúc của Bacterial cellulose 10 1.3.2 Cơ chế tổng hợp Bacterial cellulose 11 1.3.3 Chức của cellulose vi khuẩn A.xylinum 12 1.4 Tình hình nghiên cứu sản xuất màng BC 12 1.4.1 Trên giới 12 1.4.2 Tại Việt Nam 13 CHƢƠNG PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu hóa chất 14 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 14 2.1.2 Hóa chất 14 2.1.3 Dụng cụ, thiết bị 14 2.1.4 Môi trƣờng nghiên cứu 15 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 15 2.2.1 Phƣơng pháp vi sinh 15 2.2.1.1 Phƣơng pháp bảo quản chủng giống thạch nghiêng 15 2.2.1.2 Phƣơng pháp hoạt hoá giống 16 2.2.1.3 Phƣơng pháp lên men tạo màng 16 2.2.2 Phƣơng pháp hoá sinh 16 2.2.2.1 Phát hoạt tính catalase 16 2.2.2.2 Phát khả oxy hoá rƣợu êtylic thành acid acetic 17 2.2.2.3 Phát khả oxy hoá acid acetic 17 2.2.2.4 Phát khả chuyển hoá glucose thành acid 18 2.2.2.5 Phát khả chuyển hoá glycerol thành dihydroxyaceton 18 2.2.2.6 Sinh trƣởng môi trƣờng Hoyer 18 2.2.2.7 Phát khả tổng hợp cellulose 19 2.2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu khả tạo màng BC của môi trƣờng tuyển chọn 19 2.2.4 Phƣơng pháp xác định trọng lƣợng tƣơi của màng BC 19 2.2.5 Phƣơng pháp quy hoạch hóa toán học thực nghiệm (phƣơng pháp Box – Wilson) 19 2.2.5.1 Thiết lập mô hình toán học 19 2.2.5.2 Tối ƣu hóa 23 2.2.6 Phƣơng pháp xử lý số liệu thống kê 24 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Nghiên cứu khả tạo màng của chủng A.xylinum BHN2 các môi trƣờng khác 25 3.2 Nghiên cứu động thái sinh trƣởng phát triển của chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 26 3.3 Tối ƣu hóa môi trƣờng dinh dƣỡng cho chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 29 3.3.1 Thiết lập mô hình toán học tối ƣu môi trƣờng nuôi cấy 30 3.3.2 Tối ƣu 39 3.4 Xây dựng quy trình đóng gói bảo quản màng BC quy mô phòng thí nghiệm 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 Kết luận 43 Kiến nghị 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 DANH MỤC CÁC TƢ̀ VIẾT TẮT A.xylinum : Acetobacter xylinum MC : Microbial cellulose BC : Bacterial cellulose PC : Plant cellulose CFU : Colony Forming Unit OD : Optical Density cs : Cộng sƣ̣ DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Đặc điểm sinh hoá của chủng vi khuẩn A.xylinum theo Frateur (1950) Bảng 1.2 Ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến suất sản xuất màng BC Bảng 1.3 Thành phần hóa học của nƣớc dừa Bảng 1.4 Các vitamin có nƣớc dừa Bảng 1.5 Các acid amin có nƣớc dừa Bảng 2.1 Ma trận thực nghiệm Bảng 3.1 Khảo sát khả tạo màng của A.xylinum BHN2 Bảng 3.2 Động thái sinh trƣởng tổng hợp cellulose của chủng A.xylinum BHN2 Bảng 3.3 Ảnh hƣởng của hàm lƣợng glucose đến màng BC Bảng 3.4 Ảnh hƣởng của hàm lƣợng (NH4)2SO4 đến khối lƣợng tƣơi của màng BC Bảng 3.5 Ảnh hƣởng của hàm lƣợng KH2PO4 đến khối lƣợng tƣơi của màng BC Bảng 3.6 Các yếu tố mức khảo sát Bảng 3.7 Ma trận thực nghiệm Bảng 3.8 Bảng kiểm tra thích ứng của mô hình Bảng 3.9 Tối ƣu hóa thành phần môi trƣờng dinh dƣỡng DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Vi khuẩn A.xylinum BHN2 Hình 1.2 Khuẩn lạc của A.xylinum BHN2 Hình 1.3 Sợi cellulose của màng BC Hình 1.4 Sợi cellulose của thực vật Hình 1.5 Con đƣờng sinh tổng hợp cellulose A.xylinum Hình 2.1 A.xylinum BHN2 môi trƣờng thạch nghiêng Hình 2.2 Hoạt tính calatase của A.xylinum BHN2 Hình 3.1 Ảnh hƣởng của hàm lƣợng glucose đến màng BC Hình 3.2 Ảnh hƣởng của hàm lƣợng (NH4)2SO4 đến khối lƣợng tƣơi của màng BC Hình 3.3 Ảnh hƣởng của hàm lƣợng (NH4)2SO4 đến độ dày của màng BC Hình 3.4 Ảnh hƣởng của hàm lƣợng KH2PO4 đến khối lƣợng tƣơi của màng BC Hình 3.5 Ảnh hƣởng của hàm lƣợng KH2PO4 đến khối lƣợng tƣơi của màng BC Hình 3.6 Màng BC thu đƣợc sau lên men chƣa xử lý Hình 3.7 Màng BC sau xử lý đem sấy khô TÓM TẮT LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Acetobacter xylinum loài vi khuẩn có khả sinh tổng hợp màng BC môi trƣờng dịch thể điều kiện nuôi cấy tĩnh hiệu tự nhiên Màng BC có chất kết hợp cellulose tế bào vi khuẩn A.xylinum Màng BC có cấu trúc hóa học đặc tính học giống với cellulose của thực vật nhƣng có thêm số tính chất hóa lý đặc biệt nhƣ: độ bền học, đƣờng kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, tính đàn hồi lớn, khả polymer hóa lớn Ngoài ra, màng BC hàng rào c ản oxi các sinh vật khác, ngăn cản sƣ̣ phân hủy các chất ở tế bào và ngăn cản tác động của tia UV… Nhờ thuộc tính đặc biệt mà màng BC đƣợc sử dụng nhiều các nƣớc phát triển, ứng dụng rộng rãi các lĩnh vực: công nghệ thực phẩm sản xuất thạch dừa, công nghiệp giấy sản xuất giấy chất lƣợng cao, lĩnh vực mỹ phẩm dùng làm mặt nạ dƣỡng da Trong lĩnh vực y học, màng BC bƣớc đầu đƣợc nghiên cứu làm màng trị bỏng, da nhân tạo thay da tạm thời, mạch máu nhân tạo Một các ứng dụng đƣợc quan tâm sản xuất màng BC điều trị bỏng tổn thƣơng da [6] Đặc biệt, nhu cầu về màng trị bỏng cao nhƣng đều phải nhập ngoại với giá thành lớn chất lƣợng không nhƣ mong muốn Công trình tập trung nghiên cứu môi trƣờng tối ƣu cho chủng A.xylinum lên men tạo màng BC, xử lí bảo quản màng BC So với các nghiên cứu về A.xylinum trƣớc thì công trình của tìm đƣợc số kết là: môi trƣờng tối ƣu cho chủng A.xylinum cho màng dày, dai, nhẵn glucose 19,347g; KH2PO4 1g; (NH4)2SO4 2,549g; tiến hành xử lý, bảo quản màng quy mô phòng thí nghiệm định sử dụng hàm lƣợng g/l (NH4)2SO4 để tiến hành các thí nghiệm + Hàm lượng KH2PO4: Sự có mặt các hợp chất phospho nồng độ của chúng môi trƣờng có ảnh hƣởng lớn đến quá trình trao đổi chất của tế bào vi sinh vật Thay đổi nồng độ các hợp chất phospho môi trƣờng dẫn đến thay đổi các quá trình tổng hợp hàng loạt các chất hợp phần của tế bào có chứa phospho, tế bào chất chất nhân Ngoài ra, phospho môi trƣờng có tác dụng điều chỉnh hoạt tính enzyme đồng hóa thức ăn cacbon [17] Phospho vai trò tham gia cấu trúc các thành phần của tế bào, có vai trò quan trọng tổng hợp cellulose vi khuẩn A.xylinum [31] Tôi tiến hành khảo sát ảnh hƣởng của KH2PO4 đến khả hình thành màng BC của vi khuẩn A.xylinum BHN2 các hàm lƣợng khác Sau ngày nuôi cấy điều kiện tĩnh tiến hành thu kiểm tra khối lƣợng màng môi trƣờng có hàm lƣợng KH2PO4 khác Kết thu đƣợc nhƣ sau: Bảng 3.5 Ảnh hƣởng hàm lƣợng KH2PO4 đến khối lƣợng tƣơi màng BC Hàm lƣợng KH2PO4 (g/l) Đặc điểm màng BC 0,0 0,1 M ± m (g/l) 0,44 ± 0,02 Màng mỏng 1,24 ± 0,03 0,5 2,35 ± 0,03 1.0 3,12 ± 0,02 1,5 3,36 ± 0,03 2,0 Màng mỏng 2-3 mm, nhẵn, dai 3,67 ± 0,01 2,5 3,33 ± 0,02 3,0 3,02 ± 0,02 3,5 4,0 Màng mỏng nhẵn, dai 34 2,85 ± 0,02 2,17 ± 0,01 Khối lượng màng tươi màng BC (g) 3.5 2.5 1.5 0.5 0 0.1 0.5 1.5 2.5 3.5 Hàm lượng KH2PO4 (g/l) Hình 3.4 Ảnh hƣởng hàm lƣợng KH2PO4 đến khối lƣợng tƣơi màng BC Hình 3.5 Ảnh hƣởng hàm lƣợng KH2PO4 đến khối lƣợng tƣơi màng BC Nguyên nhân có khác photphat kali có mặt trog nhiều thành phần cấu tạo quan trọng của tế bào nhƣ acid nucleic, protein, photpholipid, nhiều coenzim quan trọng nhƣ ADP, ATP, NADP, flavin, vitamin…tham gia vào quá trình oxy hóa rƣợu etylic thành acid acetic đến CO2 H2O [4] Với hàm lƣợng KH2PO4 cao g/l môi trƣờng gây tƣợng thừa phospho kali, tế bào không dùng hết vào quá trình sinh trƣởng, phát triển oxy hóa rƣợu etylic thành acid acetic Hơn lƣợng 35 dƣ thừa làm thay đổi đặc tính lý hóa của môi trƣờng, ức chế quá trình sinh trƣởng, phát triển từ ảnh hƣởng đến hình thành màng BC Ngƣợc lại, lƣợng phospho kali quá thấp (thấp 0,5 g/l) ảnh hƣởng đến việc tham gia cấu tạo coenzim xúc tác cho các phản ứng quá trình sinh trƣởng Ở hàm lƣợng KH2PO4 từ - g/l cho lƣợng BC cao Theo tác giả Schramm Hestrin (1954) sử dụng nguồn muối phôt phát KH 2PO4 2,7 g/l [29] Kết phù hợp với nghiên cứu của tôi, định sử dụng hàm lƣợng g/l KH2PO4 cho các nghiên cứu Từ nghiên cứu về hàm lƣợng glucozo, KH2PO4, (NH4)2SO4 ta tạo các bƣớc nhảy để thay đổi yếu tố quá trình tối ƣu hóa chọn môi trƣờng tốt để lên màng Qua nghiên cứu thử nghiệm xác định khoảng có nghĩa của các biến số x1, x2, x3 nhƣ bảng sau: (với khoảng biến thiên 2) Bảng 3.6 Các yếu tố mức khảo sát Các yếu tố khảo sát Đƣờng Glucozo (x1, g) KH2PO4 (x2, g) (NH4)2SO4 (x3, g) Mức thấp (-) 18 Mức sở (0) 20 Mức cao(+) 22 Mô hình toán học cần thiết lập biểu diễn mối quan hệ hàm mục tiêu với các biến số có dạng: y = b0 + b1x̃1 + b2x̃2 + b3x̃3 Trong : y : hàm mục tiêu (khối lƣợng màng) x̃1, x̃2, x̃3 : các biến mã của yếu tố đƣờng, KH2PO4, (NH4)2SO4 b0, b1, b2, b3 : các hệ số Thiết lập ma trận theo phƣơng pháp “Thực nghiệm yếu tố đầy đủ”: Ma trận thực nghiệm với n = 3, với số thí nghiệm N = 8, kết thí nghiệm đƣợc trình bày bảng sau: 36 Bảng 3.7 Ma trận thực nghiệm N x̃1 x̃2 x̃3 x1 x2 Sj2 Khối lƣợng màng tƣơi (g) x3 y1 y2 y3 y̅ + + + 22 3,418 3,632 3,303 3,451 0,028 + + - 22 3,256 3,005 3,368 3,210 0,035 + - + 22 3,162 3,102 2,954 3,073 0,011 + - - 22 2,835 2,746 2,937 2,893 0,009 - + + 18 2,632 2,913 2,742 2,762 0,200 - + - 18 2,723 2,598 2,868 2,730 - - + 18 2,511 2,326 2,012 2,283 0,064 - - - 18 2,153 1,979 2,005 2,165 0,030 0,18 * Kiểm tra hội tụ các số liệu theo tiêu chuẩn Cochran GTT  max S 2j N S j 1 = = 0,359 < GB = 0,516 j Trong GB đƣợc tìm cách tra bảng chuẩn Cochran biết bậc tự f1 = k-1 f2 = N = 23 = Nhƣ các sai số hội tụ hay các thí nghiệm đƣợc đo cùng độ chính xác nhƣ * Tính các hệ số của phƣơng trình hồi quy: b0  N  yj N j 1 bi  N ~  y j xi N j 1 b0 = b2 = = 2,814 = 0,412 37 b1 = = 0,269 b3 = = 0,186 Mô hình toán học đƣợc thiết lập là: y = 2,814 + 0,269 x̃1 + 0,412 x̃2 + 0,186 x̃3 * Kiểm tra có nghĩa của các hệ số theo tiêu chuẩn Student Hệ số của mô hình có nghĩa: |bi| > Sb.t Với N = 8, f = N(K-1) = 16 tra bảng phân phối Student tìm đƣợc t = 2,12 với α = 0,05 Phân phối trung bình cho thí nghiệm: S y2  N N S j 1 j = = 0,07 Phân phối trung bình cho lần đo: S y2  N S j = kN j 1 = 0,023 Phân phối mà các hệ số xác định: S  b S y2 B = 0,076 Với i=1,2,3 ta đều có |bi| > Sb.t = 0,076.2,12 = 0,161 Nhƣ hệ số của phƣơng trình hồi quy xác định đều có nghĩa Kiểm tra thích ứng của mô hình, ta có bảng sau: Bảng 3.8 Bảng kiểm tra thích ứng mô hình N Khối lƣợng màng BC tƣơi (g) Mô hình yTT yTN (yTT - yTN)2 2,814 + 0,269 + 0,412 + 0,186 3,681 3,451 0,053 2,814 + 0,269 + 0,412 - 0,186 3,309 3,210 0,01 2,814 + 0,269 - 0,412 + 0,186 2,857 3,073 0,047 2,814 + 0,269 - 0,412 - 0,186 2,485 2,893 0,125 2,814 - 0,269 + 0,412 + 0,186 3,143 2,762 0,145 2,814 - 0,269 + 0,412 - 0,186 2,771 2,730 0,002 2,814 - 0,269 - 0,412 + 0,186 2,319 2,283 0,001 2,814 - 0,269 - 0,412 - 0,186 1,947 2,165 0,047 38 Ta có: S T2¦  N TN ( y j  y TT  j ) N  B j 1 = = 0,107 FTT  Max( S y2 ; S T2¦ ) Min( S y2 ; S T2¦ ) = = 3,08 < FB = 4,77 Mô hình: Y = 2,814 + 0,269 x̃1 + 0,412 x̃2 + 0,186 x̃3 hoàn toàn thích ứng 3.3.2 Tối ƣu Tìm giá trị tuyệt đối bi z i |b1z1| = 0,269.2 = 0,538 |b2z2| = 0,412.2 = 0,824 |b3z3| = 0,186.2 = 0,372 Vậy: max |bizi| = |b2z2| = 0,824 Chọn lƣợng KH2PO4 biến sở (  xcs)  xcs =  x2 =  x1=  x3 = = 0,653 = 0,451 Bảng 3.9 Tối ƣu hóa thành phần môi trƣờng dinh dƣỡng Đƣờng KH2PO4 (NH4)2SO4 (g) (g) (g) y1 y2 y3 y̅ 18,694 2,098 2,906 2,893 2,742 2,577 19,347 2,549 3,268 3,401 3,169 3,279 20 3,368 3,021 3,284 3,224 20,653 3,451 3,210 3,002 2,985 3,066 21,360 3,902 3,567 2,769 3,215 3,184 N Khối lƣợng màng tƣơi (g) Qua bảng ta thấy: để đạt hàm mục tiêu (ymax) thì thí nghiệm thích hợp thí nghiệm số với lƣợng đƣờng 19,347 g, KH2PO4 g, (NH4)2SO4 2,549 g Kết thu đƣợc có thể giải thích: glucose tham gia 39 vào quá trình chuyển hóa, có vai trò hình thành tính dày mỏng của màng BC Theo tác giả Hong – Joo Son, 2001 sản xuất màng BC đƣa vào môi trƣờng 20 g đƣờng glucose Theo để tạo màng mỏng bổ sung 19,347 g hoàn toàn phù hợp Với P có vai trò tham gia vào cấu trúc các thành phần của tế bào, còn có vai trò quan trọng tổng hợp cellulose vi khuẩn A.xylinum Kết nghiên cứu khẳng định lƣợng KH2PO4 phù hợp g Với N có vai trò tham gia vào cấu trúc các thành phần của tế bào Kết nghiên cứu đều khẳng định nguồn N hữu vô đều có ý nghĩa với việc tổng hợp cellulose của chủng A.xylinum BHN2 Kết nghiên cứu khẳng định lƣợng (NH4)2SO4 phù hợp 2,549 g Với mục đích chế tạo màng BC mỏng nên chọn môi trƣờng chứa hàm lƣợng glucose 19,347 g, KH2PO4 g, (NH4)2SO4 2,549 g làm môi trƣờng dinh dƣỡng chế tạo màng 3.4 Xử lý bảo quản màng BC quy mô phòng thí nghiệm Bao gồm bƣớc bản:  Bƣớc 1: Xử lý màng Các bƣớc Cách xử lý Kết Rửa lại nƣớc máy nhiều lần Loại bỏ bớt acid acetic Đun với NaO 0,5N 1000C Màng có màu vàng sậm, mùi 30 phút khét Trung hoà acid citric loãng Ngâm với NaOH 0,5N nhiệt độ phòng 12h ( lặp lại lần) Trung hoà acid citric loãng 40 Màng từ màu vàng sậm chuyển thành màu trắng Màng BC trắng trong, không mùi Màng BC trắng trong, không mùi đạt về mặt cảm quan  Bƣớc 2: Diệt khuẩn lần (hấp vô trùng)  Bƣớc 3: Sấy  Bƣớc 4: Tẩm Becberin clorid 0,1% 12  Bƣớc 5: Diệt khuẩn lần (chiếu xạ UV)  Bƣớc 6: Đóng gói máy hút chân không Hình 3.6 Màng BC thu đƣợc sau lên men chƣa xử lý Hình 3.7 Màng BC sau xử lý đem sấy khô 41 Sơ đồ quy trình đóng gói màng BC phòng thí nghiệm Màng BC thu đƣợc sau lên men - Tẩy rửa: Rửa nhiều lần nƣớc máy - Loại bỏ acid acetic NaOH - Trung hòa acid citric loãng Bƣớc 1: Xử lý màng Màng BC có màu trắng, không mùi Hấp vô trùng Sấy 12 400C Bƣớc 2: Diệt khuẩn lần Bƣớc 3: Sấy Tẩm Berberin clorid 0,1% 12 Bƣớc 4:Tẩm ƣớp phụ gia Chiếu xạ UV Bƣớc 5: Diệt khuẩn lần Màng BC khuẩn Đóng gói màng BC máy hút chân không Chế phẩm màng BC 42 Bƣớc 6: Đóng gói KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 1.1 Đã nghiên cứu ảnh hƣởng của các nguồn dinh dƣỡng đến khả tạo màng của vi khuẩn A.xylinum BHN2, kết thu đƣợc nhƣ sau: Nguồn cacbon 20 g/l, nguồn khoáng thích hợp KH2PO4 g/l, nguồn nitơ (NH4)2SO4 g/l Môi trƣờng dinh dƣỡng tối ƣu tạo màng BC của chủng A.xylinum BHN2 glucose 19,347 g; KH2PO4 g; (NH4)2SO4 2,549 g 1.2 Đã xử lý, bảo quản màng BC quy mô phòng thí nghiệm Kiến nghị Do giới hạn về thời gian điều kiện thí nghiệm nên đề tài còn nhiều hạn chế Nếu đƣợc tiếp tục nghiên cứu với điều kiện tốt hơn, xin đề nghị số ý kiến sau: Tiến hành các thí nghiệm quy mô lớn hơn, lặp lại thí nghiệm nhiều lần để kiểm chứng các kết thu đƣợc Tiến hành các nghiên cứu để tìm kiếm các nguồn nguyên liệu rẻ tiền khác phục vụ cho việc sản xuất màng BC quy mô công nghiệp (nƣớc mía, nƣớc chiết bã men bia, rỉ đƣờng ) 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT [1] Chu Văn Mẫn (2003), Ứng dụng tin học sinh học, Nxb ĐHQG Hà Nội [2] Đặng Hùng Thắng (1999), Thống kê ứng dụng, Nxb Giáo dục, Hà Nội, tr 214-267 [3] Đặng Thị Hồng (2007), Phân lập, tuyển chọn nghiên cứu số đặc tính sinh học vi khuẩn A.xylinum chế tạo màng sinh học, Luận văn thạc sĩ sinh học ĐHSP Hà Nội [4] Đinh Thị Kim Nhung (1996), Nghiên cứu số đặc điểm sinh học vi khuẩn Acetobacter ứng dụng chúng lên men acid acetic theo phương pháp chìm, Luận án tiến sĩ sinh học Trƣờng Đại Sƣ phạm Hà Nội [5] Huỳnh Thị Ngọc Lan, Nguyễn Văn Thanh (2006), Nghiên cứu đặc tính màng cellulose vi khuẩn từ A.xylinum sử dụng làm màng trị bỏng, số 361, Tạp chí dƣợc học [6] Lƣơng Đức Phẩm (2004), Công nghệ vi sinh vật, Nxb Nông nghiệp [7] Nguyễn Lân Dũng, Phạm Văn Ty, Dƣơng Đức Tiến (1980), Vi sinh vật học, tập 1-2, Nxb Khoa học kỹ thuật, Hà Nội [8] Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo, Vƣơng Trọng Hào (1990), Thực hành vi sinh vật, Nxb Giáo dục, Hà Nội, tr 17- 34, 63-74, 89-92 [9] Nguyễn Thị Nguyệt (2008), Nghiên cứu vi khuẩn A.xylinum cho màng Bacterial cellulose làm mặt nạ dưỡng da, Luận văn Thạc sỹ sinh học ĐHSP Hà Nội 44 [10] Nguyễn Thị Thùy Vân cs (2011), Nghiên cứu số đặc tính màng Bacterrial cellulose từ vi khuẩn A.xylinum BHN2, ứng dụng trị bỏng [11] Nguyễn Thúy Hƣơng (2006), Chọn lọc dùng A.xylinum thích hợp cho loại môi trường dùng sản xuất cellulose vi khuẩn với quy mô lớn [12] Phạm Thành Hổ (2000), Di truyền học, Nxb Giáo dục, Hà Nội [13] Phạm Thị Ngọc Đoài, Nguyễn Thị Diễm Chi, Nghiên cứu tạo màng sinh học trị từ A.xylinum, Tạp chí hội dƣợc học [14] Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng (1992), Hóa sinh học, Nxb Giáo dục, Hà Nội, tr 80-81 [15] Trần Linh Thƣớc (2006), Phương pháp phân tích vi sinh vật, Nxb Giáo dục, Hà Nội, tr 1-29, 40-69 [16] Trần Nhƣ Quỳnh (2009), Nghiên cứu số đặc tính vật lý màng BC từ A.xylinum, ứng dụng trị bỏng, Luận văn Thạc sỹ sinh học ĐHSP Hà Nội [17] Trần Thị Thanh (2003), Công nghệ vi sinh, Nxb Giáo dục [18] Trịnh Hữu Hằng, Đỗ Công Quỳnh, (2001), Sinh lý học người động vật, Nxb Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr 173, 184-187 [19] Trƣơng Thị Ngọc Hoa, Trƣơng Nguyễn Quỳnh Hƣơng (2007), Đa dạng hóa môi trường sản xuất Natadecoco từ vi khuẩn A.xylinum chế tạo màng sinh học, Luận văn thạc sĩ sinh học ĐHSP Hà Nội, [20] Vũ Thị Minh Đức (2001), Thực tập vi sinh, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội , tr 1-50 45 TIẾNG ANH [21] Alaban C.A (1967), Studies on the optimum conditions for „nata de coco‟ bacterium or „nata‟ formation in coconut water, The Philippnie Agriculturist 45, pp 490-515 [22] Bae S., Sugano Y., Shoda M (2004), Improvement of bacterial cellulose [23] Bergey H, John G Holt (1992), Bergey‟s manual of dererminativa bacteriology, Wolters kluwer health, pp.71- 84 [24] Brown R.M (1999), Cellulose structure and biosynthesis, Pure Appl Chem 71 (5), pp 765-775 [25] Budhiono A., Rosidi B., Taher H., Iguchi M (1999), Kinetic aspects of bacterial cellulose formation in nata-de-coco culture system, Carbohydrate Polymers 40, pp 137-143 [26] Bworn (2007), E Bacterial cellulose/ Thermoplastic polymer nanocomposites, Master of science in chemical engineering, Washington state university [27] Candace.H, Haigler, Paul.J, Weimer.R (1991), Biosynthesis and biodegradation of cellulose, CPC Press, pp 99-125, 165-177, 219- 259 [28] Elvie Escoro Brown (2007) Bacterial cellulose thermoplastic polymer nanocompositer, Master of science in chemical engneering, Washington state university, Department of chemical engineer, pp.1-6 [29] Hong Joo Son, Hee Goo Kim, Keun Ki Kim, Han Soo Kim, Young Gyun Kim, Sang Joon Lee (2002), Increased production of bacterial cellulose by Acetobacter sp, V6 in synthetic media under shaking culture conditions Bioresourse technology, (Vol 86), pp 215-219 [30] Hong Joo Son, Moon Su Heo, Young Gyun Kim, Sang Joon Lee (2001), Optimization of fermentation conditions for the production of bacterial 46 cellulose by a newly isolated Acetobacter sp A9 in shaking cultures, Biotechnol Appl Biochem, Vol 33, pp 1-5 [31] Jonas, R & Frarad, L.F (1998), Production and application of microbial cellulose Polymer Degradation and Stability, pp59, 101 – 106 [32] Wan, WK & Millon E (2005) Poly (vinyl alcohol) - bacterial cellulose nanocomposite V S Pat Appl Publ US 2005037082 Al, 16 47 TÀI LIỆU INTERNET http://www.botany.utexas.edu/facstaff/facpages/mbrown/position1.htm http://www.en.wikipedia.org/wiki/Microbial_cellulose http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1200212/ http://www.res.titech.ac.jp/~junkan/english/cellulose/ http://www.sinhhocvietnam.com http://www.wiley-vch.de/books/biopoly/pdf_v05/bpol5003_37_46.pdf http://giaoan.violet.vn/present/showprint/entry_id/1139260/cat_id/57992 aicheproceedings.org allenfiltersinc.com 48 [...]... tìm ra môi trƣờng dinh dƣỡng tối ƣu cho chủng vi khuẩn A.xylinum và những ứng dụng hữu ích của màng BC trên cơ sở kế thừa những kết quả thu đƣợc của các tác giả đã nghiên cứu trƣớc tôi quyết định chọn đề tài: Tối ưu hóa môi trường dinh dưỡng cho vi c tạo màng BC từ chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 2 2 Mục tiêu của đề tài Nghiên cứu chọn lựa môi trƣờng tối ƣu cho vi c tạo màng BC của... Nghiên cứu khả năng tạo màng của chủng A.xylinum BHN2 trên các môi trƣờng khác nhau Vi c tìm ra môi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp nhất cho chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 sinh trƣởng, phát triển cho màng trong thời gian ngắn nhất và màng thu đƣợc đảm bảo các yêu cầu với mục đích chế tạo màng sinh học là hết sức cần thiết Do vậy, tôi khảo sát khả năng tạo màng của chủng trên các môi trƣờng số 2,... màng BC và chọn ra đƣợc các nguồn dinh dƣỡng và hàm lƣợng thích hợp của chúng cho quá trình tạo màng BC Tôi tiến hành xây dựng công thức môi trƣờng tuyển chọn cho quá trình tạo màng BC của vi khuẩn A.xylinum BHN2 Sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trƣờng tuyển chọn tiến hành thu màng và đánh giá chất lƣợng màng thu đƣợc, so sánh với kết quả màng thu đƣợc ở môi trƣờng cơ bản (MT3) 2.2.4 Phƣơng... đáng kể, chỉ còn 3% [29] Ngoài ra, màng BC còn là giá thể chống đỡ cho các tế bào vi khuẩn đồng thời cũng giúp chúng lấy chất dinh dƣỡng từ môi trƣờng một cách dễ dàng hơn so với khi ở trong môi trƣờng lỏng không có mạng lƣới cellulose [21] 1.4 Tình hình nghiên cứu và sản xuất màng BC hiện nay 1.4.1 Trên thế giới Vi khuẩn A.xylinum BHN2 và màng BC đã thu hút đƣợc sự chú ý của nhiều... A.xylinum BHN2 3 Nội dung của đề tài 3.1 Nghiên cứu ảnh hƣởng của hàm lƣợng một số chất dinh dƣỡng (hàm lƣợng đƣờng, hàm lƣợng (NH4)2SO4, hàm lƣợng KH2PO4) đến khả năng tạo màng BC của chủng A.xylinum BHN2 Từ đó tối ƣu môi trƣờng tạo màng BC của chủng đã chọn 3.2 Nghiên cứu một số phƣơng pháp xử lý và bảo quản màng BC 4 Ý nghĩa thực tiễn Công trình cho phép lựa chọn môi trƣờng dinh dƣỡng... cấy vi khuẩn trên môi trƣờng dịch thể ở nhiệt độ 28-30oC trong vòng 3-4 ngày, quan sát sự hình thành màng Kiểm tra khả năng bắt màu của màng bằng cách nhỏ lên đó dung dịch lugol và H2SO4 60% nó chuyển hoá thành màu xanh lam 2.2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu khả năng tạo màng BC của môi trƣờng tuyển chọn Sau khi tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng của các nguồn dinh dƣỡng đến khả năng tạo màng BC và... cellulose đối với vi khuẩn A.xylinum Màng BC nằm ở mặt thoáng của môi trƣờng nuôi cấy có tác dụng nhƣ một lớp bảo vệ cho các tế bào vi khuẩn A.xylinum trƣớc các nhân tố có hại của môi trƣờng Có những ghi nhận rằng cellulose bao quanh tế bào vi khuẩn bảo vệ chúng khỏi tia cực tím Khoảng 23% số tế bào A.xylinum đƣợc bao bọc bởi BC sống sót sau 1 giờ xử lí bằng tia cực tím Khi tách BC ra khỏi tế... dịch rƣợu, nƣớc ép hoa quả Khi nuôi cấy vi khuẩn này trên môi trƣờng dịch lỏng, chúng sẽ hình thành trên bề mặt một lớp màng Bacterial cellulose (màng BC) Đó là tập hợp các tế bào vi khuẩn liên kết với phân tử cellulose Màng BC cấu tạo bởi những chuỗi polimer--1,4 glucopyranose không phân nhánh đƣợc tổng hợp từ một số loài vi khuẩn khi nuôi cấy chúng trên môi trƣờng dịch lỏng Hầu hết các nghiên... MT6 là 25 môi trƣờng nƣớc dừa già nguyên chất có chứa đƣờng glucose và đƣờng fructose tạo điều kiện thích hợp cho quá trình tổng hợp màng BC Dựa vào mục đích nghiên cứu tôi quyết định chọn MT6 là môi trƣờng có đầy đủ các thành phần dinh dƣỡng, vitamin… tạo màng đạt chỉ tiêu cho những nghiên cứu tiếp theo 3.2 Nghiên cứu động thái sinh trƣởng phát triển của chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 Sinh... trình sản xuất màng BC với chất lƣợng tốt và ứng dụng vào trị bỏng bƣớc đầu đã đạt đƣợc thành công [14] Hiện nay mới chỉ có một số công trình nghiên cứu ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng đến khả năng tạo màng BC của chủng Acetobacter 13 CHƢƠNG 2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu và hóa chất 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu Chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 đƣợc phân lập từ màng của các ... đề tài: Tối ưu hóa môi trường dinh dưỡng cho vi c tạo màng BC từ chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 2 Mục tiêu đề tài Nghiên cứu chọn lựa môi trƣờng tối ƣu cho vi c tạo màng BC của chủng... cứu khả tạo màng chủng A.xylinum BHN2 môi trƣờng khác Vi c tìm môi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp cho chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 sinh trƣởng, phát triển cho màng thời gian ngắn màng thu... quá trình tối ƣu hóa môi trƣờng dinh dƣỡng cho chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 thu đƣợc màng BC đạt đƣợc yêu cầu: mỏng, dai, thời gian tạo màng ngắn ổn định Từ áp dụng chế tạo màng sinh học