Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Hoa cúc (chrysanthemum sp) loại hoa cắt cành phổ biến trồng rộng rãi nhiều nơi giới Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan, Hà Lan.v.v… Ở Việt Nam hoa cúc trồng lâu coi “tứ quý” (Tùng, Trúc, Cúc, Mai) tượng trưng cho bốn mùa Hoa cúc loại hoa đa dạng màu sắc, hình dáng kích thước Màu hoa có từ trắng, vàng, hồng, cam, tím, đỏ.v.v… Dáng hoa phân chia làm 13 loại từ hình cầu, hình nhện, hình Rosette Ngoài ưu điểm màu sắc kiểu dáng, hoa cúc có đặc điểm dễ trồng, hoa lâu tàn, sử dụng hai dạng cắt cành hoa chậu nên hoa cúc ưa chuộng Hoa cúc giá trị trang trí, làm đẹp cho sống mà có giá trị y dược Ở Trung Quốc loại cúc tiếng có tên gọi Hangbai với hoa nhỏ đồng xu, màu trắng ngà sử dụng dược phẩm theo ngành y học cổ truyền tắm với nước hoa cúc Hangbai chữa bệnh dị ứng da, uống trà hoa cúc thường xuyên làm giảm bệnh nhức đầu làm mắt sáng Ở Việt Nam hoa cúc trồng từ lâu đời coi trọng Hoa cúc xuất khắp nơi vườn hoa, công viên, phòng khách, bàn làm việc, thăm viếng Không hoa cúc đem lại lợi nhuận kinh tế đáng kể cho người nông dân Việt Nam có điều kiện khí hậu thổ nhưỡng thuận lợi trồng nhiều loại hoa cảnh Hiện diện tích trồng hoa cảnh nước ta 15.000 diện tích trồng hoa cúc chiếm 30% tổng diện tích trồng hoa cảnh nước Nhiều chủng loại hoa cúc trồng phổ biến khắp nước ta, vùng sản xuất Hà Nội, Hải Phòng, Sa Pa, thành phố Hồ Chí Nguyễn Thị Vân – K33C -1- Khoa Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội Minh Lâm Đồng, Đà Lạt nơi lý tưởng cho việc trồng nhân giống hầu hết loại cúc Vùng hoa công nghệ cao Đà Lạt, hoa hồng hoa cúc hai loại hoa chủ đạo, hoa cúc có 40 loại khác nhau, chia thành ba nhóm lớn cúc đại đoá, cúc giống nhỏ cúc tia có muỗng Tuy nhiên, việc sản xuất hoa cúc Việt Nam gặp nhiều hạn chế diện tích canh tác suất chất lượng hoa Các giống hoa cúc có giá trị thương mại Việt Nam chủ yếu giống nhập nội, đa dạng phong phú chủng loại màu sắc Bên cạnh giống hoa trồng tràn lan, theo kinh nghiệm nông dân mà tác động chọn lọc phục hồi giống dẫn đến suất chất lượng hoa chưa cao Đặc biệt, việc nhân giống chọn tạo giống nông dân tự làm chủ yếu nên dẫn đến giống hoa dần bị thoái hoá, chất lượng giống thấp dễ bị sâu bệnh Hơn nữa, việc đa dạng hóa màu sắc kiểu dáng hoa nhu cầu nhà chọn giống Ngày nay, chọn giống đột biến phương pháp chiếu xạ ứng dụng kỹ thuật hạt nhân nông nghiệp, sử dụng rộng rãi việc cải tạo nâng cao chất lượng giống trồng phát triển giống với đặc điểm sinh học cải tiến Bằng phương pháp chiếu xạ tia proton, ion beam.v.v… kết hợp với kỹ thuật nhân giống in vitro tạo giống trồng thời gian ngắn hiệu so với phương pháp chọn tạo giống truyền thống Chọn giống đột biến đóng vai trò quan trọng việc cải tiến giống hoa cảnh nói chungvà hoa cúc nói riêng Nhận dạng xác định đặc tính giống trồng quan trọng nhà vườn để bảo hộ quyền cho nhà chọn giống thực vật Trước đây, giống xác định dựa đặc tính nông sinh học Gần kỹ thuật sinh học phân tử phát triển Nguyễn Thị Vân – K33C -2- Khoa Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội giúp cho việc đánh giá đa dạng di truyền giống trồng dễ dàng thuận lợi, xác Vì lý thực tế tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Nghiên cứu đa hình di truyền dòng hoa cúc tạo phương pháp chiếu xạ gây đột biến giống Saphia trắng” Mục đích nghiên cứu đề tài Đánh giá đa hình di truyền mức hình thái mức phân tử dòng cúc tạo phương pháp chiếu xạ gây đột biến giống saphia trắng Nội dung nghiên cứu đề tài - Đánh giá đa dạng di truyền mức hình thái dòng cúc sau chiếu xạ: mô tả, đánh giá, phân tích đa dạng di truyền đặc điểm hình thái thân, lá, hoa, thời gian sinh trưởng hoa.v.v… - Chọn lọc thể đột biến ưu tú, nhân dòng đột biến, đánh giá ổn định di truyền dòng hoa cúc vi nhân giống tạo sau chiếu xạ - Đánh giá đa dạng di truyền dòng cúc đột biến ưu tú mức phân tử ADN kĩ thuật PCR - RAPD - Nghiên cứu khác biệt giống gốc dòng đột biến mức hình thái mức phân tử xác định số marker nhận dạng xác dòng/giống cúc có triển vọng làm sở cho việc khai thác, sử dụng đăng kí quyền Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài - Hiểu biết đa dạng di truyền mức hình thái mức phân tử dòng hoa cúc đột biến tạo phương pháp chiếu xạ gây đột biến sở để tuyển chọn dòng/giống ưu tú phục vụ cho công tác chọn lai tạo giống Nguyễn Thị Vân – K33C -3- Khoa Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội - Các marker nhận biết xác số dòng/giống có triển vọng sử dụng để xác định giống phục vụ công tác nhân giống, kiểm soát giống giai đoạn sớm Kết đề tài có ý nghĩa việc xây dựng quy trình chọn tạo giống phương pháp chiếu xạ gây đột biến Nguyễn Thị Vân – K33C -4- Khoa Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung hoa cúc 1.1.1 Nguồn gốc, vị trí, phân loại đặc điểm hoa cúc Nguồn gốc: hoa cúc có xuất xứ từ Trung Quốc, khoảng 500 năm trước CN Khổng Tử đề cập đến việc trồng hoa cúc Ở Nhật Bản đến kỷ VIII thấy xuất hoa cúc Đến kỷ XVII hoa cúc du nhập vào châu Âu hoa cúc trồng rộng rãi khắp giới Ở Việt Nam hoa cúc trồng từ lâu, giống hoa cúc trồng Việt Nam thường có xuất xứ từ Trung Quốc, Nhật Bản châu Âu Cây hoa cúc có tên khoa học là: Chrysanthemum nhà thực vật học người Thụy Điển Carl Linnes đặt tên vào năm 1973 Chrysanthemum bắt nguồn từ tiếng Hi Lạp: Chrysos có nghĩa vàng (gold) Anthemom có nghĩa hoa Theo hệ thống phân loại thực vật hoa cúc hai mầm (Dicotyledoneae), phân lớp hoa cúc (Asterydae), cúc (Asterales), họ cúc (Asteraceae), phân họ hoa cúc (Asteroidae) chi hoa cúc (Chrysanthemum) (Võ Văn Chi, Dương Đức Tiến, 1988 [3] Theo Nguyễn Quang Thạch Đặng Văn Đông (2002) [5] dựa vào cách sau để phân loại hoa cúc Việt Nam: Dựa vào hình dạng hoa để phân biệt cúc đơn hay cúc kép Cúc đơn: thường dạng hoa nhỏ đường kính hoa từ - cm, có từ - hàng cánh vòng vòng cánh hoa nhỏ thường gọi cồi hoa Cúc kép: hoa có đường kính từ - 15 cm, có nhiều cánh xếp vòng sít nhau, có loại cánh dài cong, có loại cánh ngắn Dựa vào hình thức nhân giống: dựa vào hình thức nhân giống vô tính giâm cành, tỉa chồi nhân giống phương pháp hữu tính gieo hạt Nguyễn Thị Vân – K33C -5- Khoa Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội Dựa vào thời vụ trồng: dựa vào đặc tính chịu nhiệt hoa cúc để phân loại thường phân làm hai loại cúc đông cúc hè Cúc đông có nguồn gốc ôn đới, có tính chịu lạnh trồng chủ yếu vào mùa đông Cúc hè giống chịu nhiệt độ cao trồng vào mùa hè Cây hoa cúc thuộc dạng thân thảo, nhỏ, có nhiều đốt, giòn, có khảnăng phân cành mạnh, dạng đứng dạng bò Kích thước thân cao hay thấp, đốt dài hay ngắn tuỳ thuộc vào giống Cây cao từ 30 – 80 cm chí cao đến m Rễ hoa cúc thuộc loại rễ chùm, rễ ăn sâu mà phát triển theo chiều ngang Lá hoa cúc có dạng xẻ thuỳ, có cưa, đơn mọc so le nhau, mặt bao phủ lớp lông tơ, mặt nhẵn có gân hình mạng lưới Phiến to hay nhỏ, dày, mỏng, xanh đậm hay nhạt, tuỳ thuộc vào giống khác Hoa cúc thuộc loại hoa lưỡng tính đơn tính có nhiều màu sắc khác nhau, đường kính hoa khoảng từ 1,5 - 25 cm Hình dạng cánh hoa ngắn hay dài, cong hay thẳng, hoa đơn hay kép giống Hoa cúc có đến nhị đực dính vào bao quanh vòi nhụy mảnh hình chẻ đôi 1.2 Giá trị sử dụng hoa cúc Hoa cúc loài hoa cắt cành phổ biến thương mại hoá nhiều thứ hai thị trường hoa giới sau hoa hồng (Sudhir Kumar & cs., 2006) [11] Hoa cúc loại hoa đa dạng màu sắc, hình dáng kích thước Màu hoa có từ trắng, vàng, hồng, cam, tím, đỏ.v.v… Cỡ hoa có loại nhỏ khoảng từ cm loại lớn có kích thước lên tới 25 cm, đặc biệt giống hoa cúc Pennine Ace có dạng cánh dài hình muỗng có màu hồng pha trắng đẹp Hiện hoa cúc phổ biến Mỹ xem “Nữ Hoàng” loài hoa mùa thu, người ta thường tặng hoa cúc cho thăm viếng Nguyễn Thị Vân – K33C -6- Khoa Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội Ở Trung Quốc hoa cúc có vai trò quan trọng, điển hình hình ảnh hoa cúc có nhiều tranh tứ quý bình, chậu gốm sứ có từ thời xưa Giống cúc Chu - Hsien đặt tên cho thành phố Ở Việt Nam hoa cúc trồng từ lâu đời coi trọng Không hoa cúc đem lại lợi nhuận kinh tế đáng kể cho người nông dân Kim ngạch xuất hoa cúc quý năm 2008 Việt Nam đạt 1.400 nghìn USD [13] 1.3 Tình hình sản xuất phát triển hoa cúc giới Việt Nam 1.3.1 Tình hình sản xuất phát triển hoa cúc giới Hoa cúc loài hoa hàng năm phổ biến giới, đặc điểm hoa cúc điều khiển hoa nên người ta tạo nguồn sản phẩm liên tục ổn định quanh năm Chính mà Bắc Mĩ, Tây Âu Nhật Bản hoa cúc đứng vị trí thương mại thứ hai sau hoa hồng Quốc gia xuất hoa cúc dẫn đầu Hà Lan, phục vụ cho thị trường tiêu thụ rộng lớn gồm 80 nước giới với diện tích trồng hoacúc chiếm tới 30% tổng diện tích trồng hoa tươi Ở châu Á, Nhật Bản nước dẫn đầu xuất hoa cúc, năm Nhật Bản sản xuất khoảng 200 triệu cành phục vụ cho tiêu dùng nội địa xuất Ở Trung Quốc, theo hiệp hội sản xuất hoa sản lượng hoa cúc năm 2007 đạt 35 triệu Diện tích trồng hoa cúc phát triển Quảng Đông, Thượng Hải Bắc Kinh bao gồm giống hoa vào mùa hè, mùa thu, đông sớm xuân muộn, màu ưa chuộng màu vàng, màu trắng, đỏ 1.3.2 Tình hình sản xuất phát triển hoa cúc Việt Nam Việt Nam có điều kiện khí hậu thổ nhưỡng thuận lợi trồng nhiều loại hoa cảnh Hiện diện tích trồng hoa cảnh nước ta 15.000 diện tích trồng hoa cúc chiếm 30% tổng diện tích Nguyễn Thị Vân – K33C -7- Khoa Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội trồng hoa cảnh nước Nhiều chủng loại hoa cúc trồng phổ biến khắp nước ta, vùng sản xuất Hà Nội, Hải Phòng, Sa Pa, thành phố Hồ Chí Minh Lâm Đồng, Đà Lạt nơi lý tưởng cho việc trồng nhân giống hầu hết loại cúc Vùng hoa công nghệ cao Đà Lạt, hoa hồng hoa cúc hai loại hoa chủ đạo, hoa cúc có 40 loại khác nhau, chia thành ba nhóm lớn cúc đại đoá, cúc giống nhỏ cúc tia có muỗng Thành phố Hồ Chí Minh thị trường tiêu thụ hoa lớn Việt Nam, nhiên vùng chuyên canh hoa thành phố quận Gò Vấp, Thủ Đức, Củ Chi.v.v… cung cấp phần nhỏ Hiện thành phố phải nhập số lượng lớn hoa cắt có hoa cúc từ Hà nội, Hà Lan, Đài Loan Singapo Theo đánh giá chuyên gia ngành hoa Nhật Bản Tây Âu Việt Nam có cấu hoa phù hợp với thị hiếu thị trường hoa cao cấp giới Tuy nhiên để đáp ứng yêu cầu chất lượng mẫu mã an toàn thực vật cao thị trường nhà sản xuất hoa Việt Nam phải có kế hoạch đầu tư phát triển cách thích hợp đặc biệt công tác chọn tạo giống nhân giống biện pháp canh tác, công nghệ đóng gói bảo quản để nâng cao suất chất lượng hoa 1.4 Khái quát nghiên cứu sử dụng đột biến chọn tạo giống trồng 1.4.1 Ý nghĩa đột biến công tác chọn giống trồng Chọn tạo giống trồng ngành khoa học cải tiến di truyền thực vật lợi ích loài người (Poehlman & Sleper, 1995) [10] Để tạo nguồn biến dị với tính trạng mong muốn nhà chọn tạo giống phải áp dụng nhiều biện pháp khác chọn lọc, lai giống, tạo đột biến, gây đa bội thể gần áp dụng công nghệ sinh học chọn giống Nguyễn Thị Vân – K33C -8- Khoa Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội Chọn lọc phương pháp chọn giống Tuy nhiên, phương pháp chọn lọc đưa lại kết quần thể ban đầu đa dạng kiểu gen Kết phương pháp chọn lọc thừa hưởng kho tàng biến dị có sẵn tự nhiên tạo biến dị Bằng biện pháp lai tạo gây đa bội thể thực nghiệm người ta làm phong phú thêm nguồn biến dị tự nhiên Một hiệu ứng đặc biệt nhận lai giống ưu lai biểu hệ F1 Tuy nhiên trồng đặc điểm cấu trúc hoa hệ thống sinh sản chúng gây cản trở cho việc áp dụng tạo giống ưu lai (bất hợp lai, F1 khả sống, F1 bất dục, suy nhược lai) Bằng phương pháp ta sử dụng số gen hệ thống gen thể thực vật trình chọn lọc lai tạo phải trải qua khoảng thời gian dài Đột biến sở tiến hoá hình thành nên giống trồng vật nuôi Đột biến đường quan trọng dẫn đến việc làm tăng biến dị thể sinh vật, biến đổi bất thường vật chất di truyền dẫn đến biến đổi nhiều tính trạng di truyền cho hệ sau Đột biến gồm hai loại đột biến tự phát đột biến nhân tạo - Đột biến tự phát dạng đột biến xảy cách ngẫu nhiên tự nhiên biến đổi thời tiết, khí hậu thay đổi yếu tố địa lý Trong tự nhiên biến đổi đột ngột biến động thời tiết khí hậu, địa lý làm cho sinh vật thích nghi với điều kiện sống qua trình tiến hoá hàng trăm, trí hàng nghìn năm giống trồng, vật nuôi hình thành đặc tính khác biệt so với giống cũ Đột biến tự phát xảy tự nhiện có tần số thấp thường 10-9 nghĩa khoảng 10 triệu cá thể xuất cá thể bị đột biến đột biến có ý nghĩa cho người - Đột biến nhân tạo: đột biến xảy tác nhân (vật lý hoá Nguyễn Thị Vân – K33C -9- Khoa Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội học) gây đột biến thực người mục đích chọn giống Nhờ việc sử dụng tác nhân gây đột biến người ta tạo giống khoảng thời gian ngắn phạm vi thí nghiệm hẹp Gây đột biến phương pháp để bổ sung nguồn gen chọn giống trồng 1.4.2 Cơ sở di truyền đột biến - Đột biến xảy lúc tế bào Các tác động lên kiểu hình biến đổi nhỏ mà phát phương pháp phân tích phân tử đến biến đổi lớn dẫn đến thay đổi trình tế bào dẫn đến làm chết tế bào thể Đột biến phân chia theo nhiều cách khác Ở sinh vật đa bào, phân biệt quan trọng dựa dạng tế bào xảy đột biến Những đột biến xuất tế bào hình thành giao tử gọi đột biến gen nhân (germ - line mutations) Những đột biến xảy tế bào sinh dưỡng gọi đột biến tế bào sinh dưỡng (somatic mutations) hay gọi đột biến soma Đột biến soma tạo sinh vật vừa có mô tế bào đột biến vừa có mô bình thường Hiện tượng gọi đột biến khảm Đột biến tế bào sinh dưỡng không di truyền cho hệ sau Đối với nhân giống vô tính tuỳ vào vị trí phần trăm mô sinh dưỡng người ta phân lập hai ba loại đột biến khác Ở loài thực vật bậc cao đột biến soma nhân giống vô tính giữ lại đột biến [7] Dựa vào thay đổi cấu trúc di truyền đột biến phân thành hai loại đột biến nhiễm sắc thể đột biến gen Đột biến nhiễm sắc thể (NST) biến đổi cấu trúc số lượng nhiễm sắc thể Đột biến xảy cặp NST toàn cặp NST Loại đột biến phát sinh tác nhân ngoại cảnh (do chất phóng xạ, hoá chất, biến Nguyễn Thị Vân – K33C - 10 - Khoa Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội * Phân tích với mồi S211 Hình 3.2: Sản phẩm PCR - RAPD mẫu hoa cúc với mồi S211 gel agarose 1,0%, (M: marker 1kb) – A0 (đ/c) ; – A3 ; – A7 ; – A8 ; – A15 Kết điện di sản phẩm PCR - RAPD mẫu hoa cúc với mồi S211 thu tổng số 20 băng với loại băng kích thước khác băng đơn hình Kích thước băng từ khoảng 550bp đến 1450bp Các băng tách biệt, rõ ràng đậm nét (hình 3.2) Nguyễn Thị Vân – K33C - 35 - Khoa Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội * Phân tích với mồi OPM6 Hình 3.3: Sản phẩm PCR - RAPD mẫu hoa cúc với mồi OPM6 gel agarose 1,0%, (M: marker 1kb) – A0 (đ/c) ; – A3 ; – A7 ; – A8 ; – A15 Kết điện di sản phẩm PCR - RAPD mẫu hoa cúc với mồi OPM6 thu tổng số 45 băng với 13 loại băng kích thước khác nhau, 10 băng đa hình băng đơn hình Mẫu xuất băng cá biệt vị trí có kích thước khoảng 500bp Mẫu khuyết hai băng vị trí có kích thước khoảng 2400bp 2000bp, mẫu khuyết tám băng vị trí có kích thước 2400bp, 2000bp, 1300bp, 1100bp, 700bp, 600bp, 400bp, 350bp Mẫu khuyết hai băng vị trí có kích thước 500bp, 250bp Mẫu Nguyễn Thị Vân – K33C - 36 - Khoa Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội khuyết hai băng vị trí có kích thước khoảng 800bp 500bp Mẫu khuyết ba băng vị trí 800bp, 700bp 500bp Kích thước băng dao động từ khoảng 250bp đến 2400bp Các băng tách biệt, rõ ràng đậm nét (hình 3.3) * Phân tích với mồi OPM18 Hình 3.4: Sản phẩm PCR - RAPD mẫu hoa cúc với mồi OPM18 gel agarose 1,0%, (M: marker 1kb) – A0 (đ/c) ; – A3 ; – A7 ; – A8 ; – A15 Kết điện di sản phẩm PCR - RAPD mẫu hoa cúc với mồi OPM18 thu tổng số 52 băng với 12 loại băng kích thước khác nhau, băng đa hình băng đơn hình, băng cá biệt (mẫu xuất Nguyễn Thị Vân – K33C - 37 - Khoa Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội băng cá biệt vị trí có kích thước khoảng 850bp) Mẫu khuyết bốn băng vị trí có kích thước khoảng 850bp, 650bp, 450bp, 350bp Mẫu hai khuyết bốn băng vị trí 750bp, 650bp, 450bp, 350bp Mẫu khuyết năm băng vị trí có kích thước 850bp, 750bp, 650bp, 450bp, 350bp Mẫu 4, khuyết bốn băng vị trí có kích thước khoảng 850bp, 650bp, 450bp, 350bp Kích thước băng dao động từ khoảng 200bp đến 2400bp (hình 3.4) * Phân tích với mồi OPN5 Hình 3.5: Sản phẩm PCR - RAPD mẫu hoa cúc Saphia trắng với mồi OPN5 gel agarose 1,0%, (M: marker 1kb) – A0 (đ/c) ; – A3 ; – A7 ; – A8 ; – A15 Kết điện di sản phẩm PCR - RAPD mẫu hoa cúc với mồi OPN5 thu tổng số 52 băng, có 11 băng đơn hình, băng đa Nguyễn Thị Vân – K33C - 38 - Khoa Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội hình Mẫu 1, khuyết băng vị trí 350bp Kích thước băng từ 350bp đến 2400bp Các băng tách biệt, rõ ràng đậm nét (hình 3.5) * Phân tích với mồi OPN7 Hình 3.6: Sản phẩm PCR - RAPD mẫu hoa cúc với mồi OPN7 gel agarose 1,0%, (M: marker 1kb) – A0 (đ/c) ; – A3 ; – A7 ; – A8 ; – A15 Kết điện di sản phẩm PCR - RAPD mẫu hoa cúc với mồi OPN7 thu tổng số 33 băng, có băng đơn hình, băng đa hình Mẫu 2, khuyết băng vị trí 300bp Kích thước băng từ 300bp đến 1300bp Các băng tách biệt, rõ ràng đậm nét (hình 3.6) Nguyễn Thị Vân – K33C - 39 - Khoa Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội * Phân tích với mồi OPN18 Hình 3.7: Sản phẩm PCR - RAPD mẫu hoa cúc với mồi OPN18 gel agarose 1,0%, (M: marker 1kb) – A0 (đ/c) ; – A3 ; – A7 ; – A8 ; – A15 Kết điện di sản phẩm PCR - RAPD mẫu hoa cúc với mồi OPN18 thu tổng số 41 băng, có băng đơn hình, băng đa hình Mẫu 1, 2, khuyết băng vị trí 2000bp Kích thước băng từ 300bp đến 2000bp (hình 3.7) Nguyễn Thị Vân – K33C - 40 - Khoa Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội Bảng 3.2: Thống kê số băng ADN thu mẫu hoa cúc nghiên cứu với 20 mồi PCR – RAPD Số băng ADN thu mồi Mồi Mẫu OPN10 3 3 15 OPN11 4 4 20 OPN5 10 11 11 10 10 52 OPN6 6 7 34 OPN7 7 33 S201 11 9 11 11 51 S211 4 4 20 S239 8 8 40 OPM18 11 10 11 11 52 OPA2 5 5 25 OPM9 6 30 OPA18 1 1 OPM6 11 11 10 45 OPM12 4 15 S285 4 6 26 OPC2 9 9 45 S256 7 7 35 OPN4 4 5 23 OPN16 5 5 25 OPN18 8 8 41 128 120 124 129 131 Tổng Nguyễn Thị Vân – K33C - 41 - Tổng 632 Khoa Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội Qua bảng 3.2 cho thấy: - Với 100 phản ứng PCR - RAPD nhân lên tổng số 632 băng ADN thuộc 144 loại băng có kích cỡ khác Trong 107 băng đơn hình, chiếm 74,3% 37 băng đa hình, chiếm 25,7% - Kích thước băng có chiều dài nhỏ khoảng 200bp băng có kích thước lớn khoảng 2400bp - Mồi OPM18 mồi OPN5 nhân lên số băng nhiều (52 băng) Mồi OPM6 nhân lên số băng (5 băng), số lượng băng nhân lên mồi trung bình 126,4 băng/mồi 3.4 Hệ số tương đồng di truyền mẫu đột biến từ giống cúc Saphia trắng Số liệu thu từ 20 mồi RAPD thống kê phân tích phần mềm NTSYS pc2.02, từ thiết lập bảng hệ số tương đồng di truyền (bảng 3.3) sơ đồ hình mối quan hệ di truyền mẫu cúc (hình 3.8) Qua kết bảng 3.3 cho thấy Hệ số tương đồng mức độ ADN mẫu hoa cúc dao động khoảng 0,76 đến 0,97 Hai mẫu số (A8) số (A15) có mức sai khác nhỏ (hệ số tương đồng di truyền cao nhất) 0,97 Ở mặt hình thái cho thấy: - Mẫu số (A8) có đặc điểm sau: cánh hoa chuyển màu vàng tươi cách rõ rệt cụm hoa nhỏ, nở đạt kích thước 4,7 cm, hoa không tròn cân đối đối chứng, lùn: 70,2 cm, thân nhỏ - Mẫu số (A15) có đặc điểm sau: hoa lạ, nở vào bên (nở nhiều lớp cánh hoa so với hoa đối chứng thường có - lớp), giữ nguyên màu sắc hoa đối chứng Nguyễn Thị Vân – K33C - 42 - Khoa Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội - Điều giải thích sau: với 20 mồi nghiên cứu sai khác mức cấu trúc ADN đặc điểm hình thái màu sắc khác bản, cần nghiên cứu với số mồi lớn để tìm sai khác Hai mẫu số (A3) số (A15) có mức sai khác di truyền lớn (hệ số tương đồng di truyền thấp nhất) 0,76 Xét đặc điểm hình thái cho thấy: - Mẫu số (A3) cánh hoa chuyển màu tím, cấu trúc hoa không khác biệt so với giống gốc, phần cánh nhỏ nhụy chuyển màu tím phần giữ màu xanh, thân chuyển màu tím, hoa nở sớm đối chứng, 83 ngày sau trồng - Mẫu số (A15) lại có đặc điểm sau: hoa lạ, nở vào bên (nở nhiều lớp cánh hoa so với hoa đối chứng thường có - lớp), giữ nguyên màu sắc hoa đối chứng Bảng 3.3: Hệ số tương đồng di truyền mẫu hoa cúc Mẫu 1 0,78 0,84 0,88 0,96 0,77 0,85 0,96 0,76 0,83 0,97 1 – A0 (đ/c) ; – A3 ; – A7 ; – A8 ; – A15 Nguyễn Thị Vân – K33C - 43 - Khoa Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội Hình 3.8: Sơ đồ mối quan hệ di truyền mẫu hoa cúc – A0 (đ/c) ; – A3 ; – A7 ; – A8 ; – A15 Từ bảng hệ số tương đồng di truyền sơ đồ hình ta có nhận xét sau: - Mẫu số (A0) có hệ số tương đồng di truyền với mẫu lại dao động khoảng từ 0,78 đến 0,96 Trong hệ số tương đồng di truyền thấp với mẫu số (A2) 0,78, hệ số tương đồng cao với mẫu số (A8) số (A15) - Mẫu số (A3) có hệ số tương đồng di truyền với mẫu lại dao động khoảng từ 0,76 đến 0,88 Trong hệ số tương đồng di truyền thấp với mẫu số (A15) 0,76, hệ số tương đồng cao với mẫu số (A7) 0,88 - Mẫu số (A7) có hệ số tương đồng di truyền với mẫu lại dao động khoảng từ 0,83 đến 0,88 Trong hệ số tương đồng di Nguyễn Thị Vân – K33C - 44 - Khoa Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội truyền thấp với mẫu số (A15) 0,83, hệ số tương đồng cao với mẫu số (A3) 0,88 - Mẫu số (A8) có hệ số tương đồng di truyền với mẫu lại dao động khoảng từ 0,77 đến 0,97 Trong hệ số tương đồng di truyền thấp với mẫu số (A3) 0,77, hệ số tương đồng cao với mẫu số (A15) 0,97 - Mẫu số (A15) có hệ số tương đồng di truyền với mẫu lại dao động khoảng từ 0,76 đến 0,97 Trong hệ số tương đồng di truyền thấp với mẫu số (A8) 0,76, hệ số tương đồng cao với mẫu số (A15) 0,97 Nguyễn Thị Vân – K33C - 45 - Khoa Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Với loại tia phóng xạ (tia Gamma, tia X, chùm tia proton) ghi nhận tổng số: 20 thể đột biến, thể đột biến thu nhận từ phương thức chiếu xạ Gamma 7; từ phương thức chiếu xạ tia X 12 từ phương thức chiếu xạ chùm tia Proton Trong thể đột biến có đặc điểm hữu ích xét mặt hình thái, dùng làm nguyên liệu cho việc tạo giống sau Ở mức phân tử sử dụng 20 mồi ngẫu nhiên cho phản ứng PCR - RAPD nhân lên tổng số 632 băng ADN thuộc 144 loại băng có kích cỡ khác Trong 107 băng đơn hình, chiếm 74,3% 37 băng đa hình, chiếm 25,7% từ thiết lập bảng hệ số tương đồng di truyền sơ đồ phát sinh chủng loại mối quan hệ di truyền dòng cúc ưu tú giống gốc Trên sở phân tích đa dạng di truyền mức độ phân tử ADN kỹ thuật PCR – RAPD kết hợp với phân tích hình thái cho thấy khác đặc điểm hình thái khác biệt di truyền mẫu hoa cúc tạo phương pháp chiếu xạ gây đột biến Đây sở xác định marker nhận dạng xác dòng/giống làm sở cho việc khai thác, sử dụng đăng kí quyền Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu sâu mức độ phân tử, dùng thêm loại thị RFLP, AFLP, SSR để xác định thị nhận dạng xác gen đột biến chế đột biến hoa cúc từ áp dụng việc chọn giống trồng Nguyễn Thị Vân – K33C - 46 - Khoa Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Lê Kim Biên (2007), Họ cúc – Asteraceae, Nxb Khoa học Kỹ thuật, tr - 30 Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (2004), Di truyền phân tử, Nxb Nông nghiệp thành phố Hồ Chí Minh, tr 288 - 305 Võ Văn Chi, Dương Đức Tiến (1988), Phân loại thực vật, Nxb Đại học trung học chuyên nghiệp, tr 424 - 436 Hoàng Thị Sản (2006), Phân loại học thực vật, Nxb Giáo dục, tr 178-223 Nguyễn Quang Thạch, Đặng Văn Đông (2002), Cây hoa cúc kĩ thuật trồng, Nxb Khoa học Kỹ thuật, tr – 24 Lê Duy Thành ( 2000), Cơ sở di truyền chọn giống thực vật, Nxb Khoa học Kỹ thuật, tr 67 – 93 Tài liệu tiếng Anh Daniel LH, Elizabeth WJ (2001), Genetics analysis of gen and genome, Jones and Bartlett Publishers, pp 266 - 290 Grodzicker T, Williams J, Sharp P, Sambrook J (1975), Physical of temperature sensitive mutants of adenovirus, Cold Spring Harbor Symp Quant Biol, 39, pp 439 - 446 Gupta PK, Varshney RK, Sharma PC, Ramesh B (1999), Molecular markers and their applications in wheat breeding, Plant Breed, pp 369 - 390 10 Poehlman JM, Sleper A (1995), Breeding field crops, A Blackwell Publishing Co, pp 106 – 115 11 Stadler L.J (1928), Genetic effect of X ray in Maize, Proc Nat Acad Sci 14, pp 69 - 75 Nguyễn Thị Vân – K33C - 47 - Khoa Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội Website 12 http://www.nongnghiep.vn 13 http://www.rauquavietnam.vn 14 http://www.Khuyennong.gov.vn Nguyễn Thị Vân – K33C - 48 - Khoa Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Vân – K33C Trường ĐHSP Hà Nội - 49 - Khoa Sinh - KTNN [...]... mu sc ca lỏ, hoa, thõn, dựng thc o chiu di, chiu rng ca lỏ, chiu cao cõy, kớch thc hoa, theo dừi thi im ra hoa v bn hoa ca tng mu ging Nguyn Th Võn K33C - 19 - Khoa Sinh - KTNN Khúa lun tt nghip Trng HSP H Ni 2 2.2.2 Phương pháp sử dụng chỉ thị phân tử PCR-RAPD Sơ đồ tóm tắt: Mu lỏ cỳc Tỏch chit ADN Mẫu ADN tinh sạch PCR-RAPD in di tra sn phm RAPD Phõn tớch s liu RAPD Kt lun tớnh a dng di truyn mc... cao nht 117 cm) - Hoa trũn u v cú mu trng, cỏc cỏnh hoa xp xen k khong t 3 n 4 lp, phn trung tõm hoa l nhng cỏnh nh xp sớt nhau v cú mu vng xanh - Thi gian ra hoa sau khi trng cõy con ra rung: 90,6 ngy, cõy ra hoa mun nht 93 ngy, cõy ra hoa sm nht: 88 ngy - S lng hoa trung bỡnh 8,33 hoa/ cõy, s lng cm hoa nhiu nht trờn mt cõy l 11 cm, s lng cm hoa ớt nht trờn mt cõy l 7 cm - Kớch thc cm hoa trung bỡnh... nh - Hoa l, n u c vo bờn trong ( n nhiu lp cỏnh hoa so vi hoa i chng thng cú 3 - 4 lp), vn gi nguyờn mu sc nh hoa i chng - Xut hin cm hoa cú cu trỳc l v p, cỏnh hoa cú cu trỳc u vo vựng trung tõm hoa, cú 1 phn cỏnh hoa nh khụng u nhau, cỏc lỏ i cú xu hng xen vo cỏc cỏnh hoa Nhỡn chung hoa cú cu trỳc ging nh hoa thc dc -Hoa chuyn mu vng m - Trờn mi cỏnh hoa ph gia cú sc vng chy d theo cỏnh - 30 - Khoa... thỡ chuyn khay cha bn gel vo mỏy in di v cho m chy TAE 1X vo bung in di sao cho m ngp bn gel khong 0,5 - 1 cm - Tra mu: mu nhum vi Xanhmetylen (loading dye), tra vo ging; Maker 1kb c tra vo ging u hoc gia bn gel cú th xỏc nh kớch thc cỏc bng Nguyn Th Võn K33C - 22 - Khoa Sinh - KTNN Khúa lun tt nghip Trng HSP H Ni 2 - Chy in di: sau khi tra mu in di xong, mỏy in di c kt ni vi b ngun t 100V - 3A Thi... Cỏnh hoa chuyn mu xanh nht, cu trỳc hoa khụng thay i - S lng bụng ớt 6 bụng/cõy A18 X - 30 Gy A19 - Hoa chuyn mu vng; - Cỏnh hoa n khụng u , X - 50 Gy mt s cỏnh cú kớch thc nh trong khi cỏc cỏnh hoa khỏc ln hn A20 Proton 50 Gy Nguyn Th Võn K33C Hỡnh nh Trờn cựng mt cõy ghi nhn nhiu hoa mang c im: - Trờn cỏnh hoa phn gia cú sc vng chy dc theo cỏnh - cm hoa l rừ cỏc cỏnh hoa sau khi n - Cỏc cỏnh hoa. .. - Khoa Sinh - KTNN Khúa lun tt nghip Trng HSP H Ni 2 Qua bng 3.1 cho thy vi liu chiu khỏc nhau thỡ mu sc ca hoa thay i nh sau: Vi liu chiu tia Gamma - 10 Gy: cỏnh hoa chuyn mu vng xanh hoa mộo mú Vi liu chiu tia Gamma - 30 Gy: hoa ng mu vng chanh (phn gia hoa mu vng nhiu) Vi liu chiu tia Gamma - 30 Gy: cỏnh hoa chuyn mu tớm Vi liu chiu tia Gamma - 30 Gy: hoa bin d: kớch thc hoa ln: 11,7 cm cỏnh hoa. .. Gy - Cỏnh hoa chuyn mu tớm, cu trỳc hoa khụng khỏc bit so vi ging gc, phn cỏnh nh nh nhy chuyn mu tớm nhng phn gia vn gi mu hi xanh - Thõn cõy chuyn mu hi tớm - Hoa n sm hn i chng, 83 ngy sau khi trng Gamma 30 Gy Gamma 30 Gy Nguyn Th Võn K33C Hỡnh nh - Hoa chuyn mu tớm - Thõn cõy chuyn mu tớm - Cỏnh hoa n nhiu lp xp khụng u - Hoa bin d: kớch thc hoa ln: 11,7 cm - Cỏnh hoa n nhiu lp, phn gi hoa hỡnh... tng cõy hoa cỳc 1.5.1 Phng phỏp ỏnh giỏ a dng di truyn da vo ch th hỡnh thỏi Phng phỏp ỏnh giỏ a dng mc hỡnh thỏi l phng phỏp truyn thng c nh phõn loi hc u tiờn l Larmark s dng Phng phỏp ny bao gm vic miờu t nhng c im, cu to hỡnh thỏi bờn ngoi, c th l: - c im ca hoa: mu sc, s lng hoa trờn bụng, s lng bụng trờn thõn, cỏch sp xp ca cỏnh hoa, kớch thc, mựi hng ca hoa, thi gian ra hoa, thi gian hoa tn... Cỏc c im chi tit Hỡnh nh - Cnh, thõn cú kớch thc (ng kớnh) bộ Cõy lựn ch cao 70.2 cm - S lng hoa ớt: 5 n/cõy - Mu lỏ nht hn so vi i chng - Cm hoa cú cỏc lỏ i ln v hoa khú n - Cỏnh hoa chuyn mu hi xanh (i din ca nhiu cõy): phn gia xanh lan ra 2 lp cỏnh ó n phớa trong - Phn cỏnh hoa bờn trong ng mu vng b - 29 - Khoa Sinh - KTNN Khúa lun tt nghip STT 15 16 17 Ký hiu th t bin A15 A16 A17 Loi tia, liu chiu... cm - Hoa khụng trũn u v cõn i nh i chng - Cõy lựn: 70,2 cm - 27 - Khoa Sinh - KTNN Khúa lun tt nghip Ký STT hiu th t bin 9 10 11 A9 A10 A11 Trng HSP H Ni 2 Loi tia, liu chiu Cỏc c im chi tit X - 20 Gy - Hoa d dng: cú ớt cỏnh, khụng cú phn cỏnh nh bờn trong, hoa mộo mú - Xut hin 1 vi hoa d dng trờn cõy, cỏc hoa cũn li bỡnh thng X - 20 Gy - Cú hin tng cỏnh hoa chuyn mu hi xanh, phn gia xanh m v lan ra ... HSP H Ni 2.2.2 Phương pháp sử dụng thị phân tử PCR-RAPD Sơ đồ tóm tắt: Mu lỏ cỳc Tỏch chit ADN Mẫu ADN tinh PCR-RAPD in di tra sn phm RAPD Phõn tớch s liu RAPD Kt lun tớnh a dng di truyn mc ... loi hoa v cõy cnh Hin din tớch trng hoa cõy cnh ca nc ta trờn 15.000 v din tớch trng hoa cỳc chim 30% tng din tớch Nguyn Th Võn K33C -7- Khoa Sinh - KTNN Khúa lun tt nghip Trng HSP H Ni trng hoa. .. dng ca cõy hoa cỳc Hoa cỳc l mt nhng loi hoa ct cnh ph bin nht v c thng mi hoỏ nhiu th hai trờn th trng hoa th gii ch sau hoa hng (Sudhir Kumar & cs., 2006) [11] Hoa cỳc l mt loi hoa a dng v