Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CBH Cellobiohydrolase CMC Cacboxylmethylcellulose HEC Hydroxylethylcellulose Bùi Thị Thủy Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp CMCase Cacboxylmethylcellulase Cs Cộng C1 Exoglucanase CX Endoglucanase Bùi Thị Thủy Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Hiện nước công nghiệp phát triển, việc nghiên cứu sản xuất ứng dụng enzyme ngày phát triển Theo thống kê gần đây, hầu hết enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật đa số chế phẩm enzyme ứng dụng nhiều lĩnh vực công nghiệp thực phẩm, y tế, nghiên cứu khoa học bảo vệ môi trường Enzyme cellulase phức hệ enzyme có tác dụng thủy phân cellulose cách thủy phân liên kết 1,4 – β – glucoside cellulose Cellulose tổng hợp chủ yếu nhờ vi sinh vật, nấm mốc có hoạt tính phân giải mạnh vi khuẩn mốc Asperillus, Mucor…Cellulase phức hệ Enzyme quan trọng ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực Hầu hết sử dụng cellulase vào hai mục đích chính: dùng cellulase trực tiếp phân giải phế thải công nghiệp thực phẩm, phế thải nông nghiệp bổ sung thức ăn gia súc vào công nghệ môi trường; hai thủy phân cellulose tạo chất lên men để thu sản phẩm cuối khác Đặc biệt chăn nuôi, biện pháp nâng cao suất vật nuôi nâng cao hiệu suất sử dụng chất dinh dưỡng thức ăn mức cao Để giải nhiệm vụ này, người ta dùng chế phẩm enzyme bổ sung vào phần ăn vật nuôi làm tăng khả phân giải hấp thụ thức ăn vật nuôi dẫn đến tăng trưởng nhanh mà đảm bảo chất lượng thịt Mặt khác tác động enzyme bổ sung, lượng thức ăn phân giải hấp thụ triệt để nên giảm lượng phân thải giảm bớt ô nhiễm môi trường [12] Từ lâu, người biết đến chủng nấm mốc ứng dụng chúng nhiều lĩnh vực công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp dược phẩm, công nghiệp môi trường, nông nghiệp Tuy nhiên chưa có Bùi Thị Thủy Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp nhiều nghiên cứu tập trung vào chủng nấm mốc phân giải cellulose, nguyên nhân tự nhiên có nhiều nhóm vi sinh vật tỏ ưu so với nấm mốc khả sinh cellulase Nhưng xét khả chống chịu pH, khả sử dụng nguồn carbon, nguồn nitơ,…thì nấm mốc tỏ ưu so với nhóm vi sinh vật khác [4] Hàng năm, hoạt động ngành nông nghiệp thải môi trường hàng trăm ngàn phế thải, nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường, Nếu lượng phế phẩm xử lý làm thức gia súc phân bón nguồn lợi lớn Ở Việt Nam có nhiều nghiên cứu cellulose ứng dụng thức ăn chăn nuôi như: Chu Thị Thanh Bình Cs (2002) ứng dụng chủng nấm men chế biến thải hoa giàu cellulose làm thức ăn gia súc [1], theo tác giả Nguyễn Lân Dũng (1991) lên men xốp sắn cách sử dụng Asperillus hennebergii, Asperillus niger sản phẩm dùng làm thức ăn cho gà, lợn, bò,…và kết cho nhiều triển vọng [3] Nghiên cứu tập trung vào nghiên cứu số yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả sinh cellulase chủng nấm mốc, ứng dụng việc xử lý phế phẩm nông nghiệp làm thức ăn gia súc Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu số điều kiện môi trường ảnh hưởng đến khả sinh cellulase số chủng nấm mốc Phòng thí nghiệm Vi sinh, trường ĐHSP Hà Nội phân lập từ phế phụ phẩm nông nghiệp Nội dung nghiên cứu  Tuyển chọn chủng nấm mốc có hoạt tính phân giải cellulose mạnh  Nghiên cứu ảnh hưởng số điều kiện môi trường đến khả sinh cellulase số chủng nấm mốc Bùi Thị Thủy Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 4.Ý nghĩa khoa học đề tài  Ý nghĩa lí luận: nghiên cứu nhằm sâu tìm hiểu hình thái, đặc điểm sinh lí, sinh hóa chủng nấm mốc có khả phân giải cellulose  Ý nghĩa thực tiễn: chủng lựa chọn có triển vọng ứng dụng việc xử lí phế phẩm nông nghiệp làm thúc ăn gia súc Điểm đề tài  Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm mốc có khả sinh cellulase mạnh từ phế phụ phẩm nông nghiệp  Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh cellulase chủng M4V, M151 M251 từ lên men rắn thu cellulase ứng dụng cho chăn nuôi Bùi Thị Thủy Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cellulose Cellulose polimer cấu thành từ đơn phân glucose liên kết β-1,4 glycoside, vật liệu chủ yếu vách tế bào thực vật nguồn carbohydrate phong phú tự nhiên Mức độ polimer hóa thường từ 100 đến 20.000 Các chuỗi cellulose gần liên kết với tạo thành cellulose qua liên kết hydrogen liên kết Vander Waal tạo thành cấu trúc tinh thể, phân tử dạng sợi, bền vững [20] Hình 1.1 Các mắt xích β-D-Glucose cellulose Khoảng 30 phân tử cellulose riêng lẻ xếp thành đơn vị lớn gọi sợi bản, sau bó thành sợi lớn gọi vi sợi cấu trúc thành sợi cellulose Sợi cellulose bền vững liên kết nội phân tử liên kết hydrogen nội phân tử Sự xắp xếp chuỗi riêng lẻ bên sợi tìm hiểu từ phân tích tán xạ tia X Cấu trúc cellulose tinh thể bao gồm cấu trúc cố định vị trí riêng biệt có quan hệ chặt chẽ với vị trí khác.Chúng có khả ngăn ngừa xâm nhập không enzyme mà chí phân tử nhỏ nước.Bên cạnh cellulose cấu trúc tinh thể, sai sót cấu trúc tinh thể dẫn đến hình thành nhóm sợi cellulose có cấu trúc vô định hình Sợi cellulose có cấu trúc bất quy tắc khác như: chỗ xoắn vi sợi, lỗ trống bề mặt, lỗ, hốc nhỏ số mạch nhỏ Tổng diện tích tiếp xúc sợi cellulose lớn bề mặt tinh thể Bùi Thị Thủy Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp cấu trúc kích thước Sự không đồng cấu trúc làm cho sợi bị hydrate nước nhúng vào môi trường lỏng cho phép xâm nhập phân tử lớn bao gồm enzyme thủy phân cellulose [20] Phân tử cellulose bền vững, với thời gian bán rã 5-8 triệu năm cho phân cắt liên kết β-1,4 glycoside 250C Trong khi, trình phân hủy sinh học thường nhanh cung cấp dòng carbon cho khí [21] Hình 1.2 Cấu trúc không gian cellulose Cellulose tổng hợp hàng năm với khối lượng lớn.Sinh khối thực vật Trái Đất 1800 tỷ tấn, cellulose chiếm tới 720 tỷ Khối lượng cellulose khổng lồ việc chứa quần thể thực vật chủ yếu có động vật vi sinh vật với số lượng nhỏ Dưới bảng thông kê cho thấy hàm lượng cellulose số nguyên liệu [25] Bảng 1.1 Hàm lượng cellulose số nguyên liệu Nguyên liệu Cellulose Nguyên liệu Cellulose 42,8 Thân ngô 36 Vỏ đậu tương 51 Cỏ 28 Mía 34 Vỏ hạt 60 Cây trưởng thành 42 Bông 91 56,6 Rơm 44 Kiều mạch Bã sắn Bùi Thị Thủy Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Trong phế liệu, cellulose thường có mặt dạng sau: Phế liệu nông nghiệp: rơm rạ, vỏ lạc, vỏ trấu, lõi ngô, ngô, cỏ … Phế liệu công nghiệp thực phẩm: vỏ xơ quả, bã mía, bã cà phê, … Phế liệu công nghiệp chế biến gỗ: rễ cây, mùn cưa, gỗ vụn… Các chất thải sinh hoạt: rác, giấy báo, bao bì… 1.2 Các chủng sinh vật phân giải cellulose Sinh tổng hợp cellulose trình phức tạp chịu điều khiển máy di truyền, hoạt hóa chất cảm ứng, kiểm soát chất trao đổi sản phẩm cuối 1.2.1 Nấm mốc Nhiều vi sinh vật có khả phân hủy cellulose có vài visinh vật có khả phân hủy hiệu cellulose tinh thể [19] Các sinh vật phânhủy cellulose hiếu khí vi khuẩn nấm, sử dụng cellulose thông qua sản xuấtsố lượng lớn cellulase ngoại bào dịch nuôi cấy, có diện bề mặt tế bào Hầu hết loài nấm có khả sử dụng cellulose nguồn chất cho phát triển.Nhiều loài nấm nguyên thủy, lớp nấm Chytridomycetes kị khí, có khả thủy giải cellulose vùng ruột động vật nhai lại.Khả thủy giải cellulose tìm thấy nhiềuloài nấm kị khí khác [20] Với xấp xỉ 700 loài nấm Zygomycetes, vài loài thuộc giốngMucor cho thấy có hoạt tính thủy giải cellulose.Trái lại, ngành nấm Ascomycetes, Basidiomycetes Deuteromycetes, ngành có 15,000 loài, thủy giải mạnh cellulose Nhiều giống nấm thu hút nhiều nghiên cứu cho hoạt tính thủy giải cellulose gỗ như:Chaetomium Helotium (Ascomycetes); Coriolus, Phanerochaetes, Poria, Schizophyllum Serpula (Basidiomycete); Aspergillus, Cladosporium, Fusarium, Geotrichum, Bùi Thị Thủy Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Myrothecium, Paecilomyces, Penicillium Trichoderma (Deuteromycetes) [20] Nấm mốc thuộc giống Trichoderma Aspergillus hai loài sản xuất số lượng lớn cellulase có nhiều sản phẩm thương mại dùng công nghiệp.Trichoderma sản xuất lượng lớn endo-ß-glucanase exo-ßglucanase với mức độ thấp ß-glucosidase, giống Aspergillus sản xuất số lượng lớn endo-ß-glucanase ß-glucosidase với số lượng thấp exo-ß- glucanase [19] Phức hợp cellulase Trichoderma reesei chuyển đổi hoàn toàn cellulose tự nhiên dẫn xuất cellulose thành glucose Sự phát triển loại nấm sản xuất loại enzyme cellulase phụ thuộc nhiều vào thành phần môi trường, nước, pH, nhiệt độ ánh sáng, không khí môi trường xung quanh [22] Chủng Aspergillus fumigatus cho thấy khả sử dụng cellulose tinh thểnhư nguồn carbon nhất.Chúng tạo nhiều loại cellulase ngoại bào, trongđó có vạch có hoạt tính endoglucanase điện di gel polyacrylamide Hoạt tính CMCase tối ưu 65°C pH 2, cho thấy loài vi sinh vật sản xuất endoglucanase ưa nhiệt acid [16] 1.2.2 Vi khuẩn Trong số loài vi khuẩn, khả thủy giải cellulose tìm thấy hai bộ: Actinomycetales hiếu khí Clostridiales kị khí Dựa vào đặc điểm sinh lí, vi khuẩn thủy giải cellulose thấy bao gồm nhóm sinh lí sau [20]:  Vi khuẩn kị khí, gram dương (Clostridium, Ruminococcus, Caldicellulosiruptor)  Vi khuẩn gram dương hiếu khí (Cellulomonas Thermobifida)  Vi khuẩn nhầy hiếu (Cytophaga, Sporocytophaga) Bùi Thị Thủy Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 1.3 Cơ chế thủy phân cellulose Theo nghiên cứu tác giả hệ cellulose gồm enzyme chủ yếu:  Exoglucananse: enzyme thủy phân liên kết β - 1,4 - glucoside từ đầu không khử chuỗi cellulose tạo thành cellobiose, không thủy phân cellulose dạng kết tinh dạng hòa tan mà thay đổi tính chất vật lý chúng Vai trò enzyme giúp cho endoglucanase tác động lên cellulose kết tinh  Endoglucanase: enzyme thủy phân liên kết β - 1,4 - glucoside cách ngẫu nhiên bên chuỗi cellulose để giải phóng cellodextrin, cellobiose glucose; tác động mạnh đến cellulose vô định hình tác động yếu đến cellulose kết tinh  β- glucosidase: enzyme thủy phân cellobiose cello – oligosaccarit mạch ngắn tạo thành glucose; β-glucosidase không công cellulose cellodextrin khác [13] Hình 1.3 Quá trình phân giải cellulose Đầu tiên endoglucanase công vào vùng vô định hình bề mặt cellulose, cắt đứt liên kết β – 1,4 – glucozid để tạo đầu mạch tự Tiếp đó, tác dụng exoglucanase từ phía cực kín (phía tính Bùi Thị Thủy 10 Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp tăng mùi thơm,lõi ngô làm tăng độ xốp Điều kiện tạo điều kiện thuận lợi cho việc lựa chọn nguồn carbon rẻ tiền để lên men thu enzyme bổ sung vào thức ăn cho vật nuôi Kết nghiên cứu phù hợp với kết trước, chủng nấm sợi sinh tổng hợp cellulase mạnh môi trường có nguồn carbon tự nhiên (Đặng Minh Hằng, 1999; Hoàng Quốc Khánh etal, 2003; Vũ Ngọc Mai (k32 – sp2), 2010) Như chủng, khả sinh cellulase vỏ trấu cao nhất, sau đến vỏ lạc cuối lõi ngô 3.2.2 Ảnh hưởng phối trộn phế phụ phẩm đến khả sinh cellulase Do loại phế phụ phẩm nông nghiệp có hàm lượng khoáng khác loại có ưu điểm khác vỏ trấu vỏ lạc có tác dụng làm tăng mùi thơm, lõi ngô làm tăng độ xốp Với ưu điểm đó, để làm tăng hoạt tính phân giải nên tiến hành phối trộn nguồn chất cho hiệu cao Dựa vào nghiên cứu trước đây, tiến hành nghiên cứu chủng nấm Penicillium M4V, Aspergillus M151, Aspergillus niger M251 môi trường rắn thích hợp với nguồn chất phối trộn vỏ trấu, vỏ lạc, lõi ngô theo tỉ lệ 6:3:1, 6:2:2, 4:4:2 4:3:3 với nguồn dinh dưỡng môi trường Czapek – Dox, đô ẩm 70% Xác định hoạt tính sinh cellulase phương pháp khuếch tán môi trường thạch (William, 1983) Bùi Thị Thủy 28 Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Bảng 3.3.Ảnh hưởng phối trộn phế phụ phẩm đến khả sinh cellulase Hoạt tính D –d (cm) M4V M151 M251 2,8 2,3 2,3 2,5 2,4 1,4 1,2 1,3 1,8 1,7 1,7 Nguồn carbon Tỉ lệ VT : VL : LN 4:3:3 Tỉ lệ VT : VL : LN 4:4:2 Tỉ lệ VT : VL : LN 6:2:2 Tỉ lệ VT : LN : VL 6:3:1 Hình 3.2 Ảnh hưởng phối trộn phế phụ phẩm đến khả sinh cellulase Qua biểu đồ ta thấy, ba chủng nấm Penicillium M4V, Aspergillus M151, Aspergillus niger M251 có khả sinh cellulase phế phụ phẩm phối trộn theo tỷ lệ cho kết khác Trong tỷ lệ nghiên cứu tỷ lệ 4:4:2 cho hoạt tính cao chủng mốc sau tỷ lệ tương ứng 4:3:3, 6:3:1 6:2:2 Đối với tỷ lệ 4:3:3, M4V cao so với M151, M251 0,5cm Đối với tỷ lệ 4:4:2, M4V cao so với M151, M251 0,5cm 0,6cm.Ở tỷ lệ 6:3:1, M4V cao so với M151, M251 0,1cm Ở tỷ lệ 6:2:2, M4V cao so với M151, M251 0,2cm 0,1cm Trong nhóm tỷ lệ 4:4:2, 4:3:3 6:3:1, 6:2:2 ta cố định nguồn chất vỏ trấu vỏ lạc lõi ngô biến thiên, theo kết phần 3.2.1 nhận thấy vỏ trấu cho hoạt tính cellulase cao chủng sau đến vỏ lạc cuối lõi ngô Khi phối trộn với tỷ lệ 6:3:1, 6:2:2 hàm lượng trấu nhiều lõi ngô lại nên độ thoáng khí khó cho phát triển bào tử nên hoạt tính cellulase hơn.Như vậy, tỷ lệ 4:4:2 (vỏ trấu: vỏ lạc: lõi ngô) tốt chủng M4V có khả sinh cellulase mạnh tỷ lệ Bùi Thị Thủy 29 Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Tỷ lệ M4V 4:3:3 Tỷ lệ M4V 4:4:2 Tỷ lệ M4V 6:3:1 Tỷ lệ M4V 6:2:2 Hình 3.3 Khả sinh cellulase tỷ lệ phối trộn 3.2.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh cellulase Nuôi cấy ba chủng nấm Penicillium M4V, Aspergillus M151, Aspergillus niger M251 môi trường rắn theo tỷ lệ phối trộn 4:4:2 (vỏ trấu: vỏ lạc: lõi ngô) nhiệt độ khác 36h Xác định hoạt tính phương pháp khuếch tán môi trường thạch (William, 1983) Bảng 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh cellulase Chủng Bùi Thị Thủy 26 C Hoạt tính D – d (cm) 32 C 380C 440C 30 500C Trường ĐHSP Hà Nội M4V M151 M251 2,6 2,2 1,7 Khóa luận tốt nghiệp 2,8 2,4 2,3 1,8 0,7 0,4 0 Hình 3.4 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh cellulase Nhiệt độ yếu tố quan trọng cho phát triển sinh vật nói chung nấm mốc nói riêng nhiệt độ có liên quan đến hoạt độ enzyme, biến tính ADN thay đổi cấu trúc màng sinh chất.Dưới 100C 350C, bào tử chúng nảy mầm được.Các chủng nấm mốc thường chủng ưa nhiệt nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp cellulase 320C nhiệt độ khảo sát Qua biểu đồ ta thấy với bước nhảy 60C ba chủng có khả sinh cellulase tăng dần từ ngưỡng 260C đến 320C; giảm dần nhiệt độ từ 320C đến 440C Chủng M4V đạt cực đại 320C, cao so với M151 M251 0,4cm 0,8cm.Ở 380C, hoạt tính enzyme M4V cao so với M151 M251 0,3cm 0,5cm.Ở440C, hoạt tính enzyme M4V cao so với M151 M251 0,3cm 0,6cm.Nếu tiếp tục tăng nhiệt độ lên hoạt độ enzyme giảm dần hoạt tính 500C Do chất enzyme protein nên nhiệt độ cao (≥500C) làm biến tính protein dẫn đến làm hoạt tính enzyme Như vậy, chủng M4V có khả sinh cellulase mạnh đạt cực đại 320C Nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu chủng nấm sợi khác có khả sinh tổng hợp cellulase cao dải nhiệt độ từ 310C – 340C (Đặng Thị Hằng, 1999) Nhiệt độ thích hợp với đa số nấm mốc 300C – 320C [11] Bùi Thị Thủy 31 Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 3.2.4 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy Nuôi cấy ba chủng nấm Penicillium M4V, Aspergillus M151, Aspergillus niger M251 môi trường rắn theo tỷ lệ phối trộn 4:4:2 (vỏ trấu: vỏ lạc: lõi ngô) 320C từ 12 – 48h Sau ngày, lấy dịch đem li tâm loại bỏ sinh khối Xác định hoạt tính phương pháp khuếch tán môi trường thạch (William, 1983) Bùi Thị Thủy 32 Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Bảng 3.5 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh cellulase Hoạt tính D – d (cm) Chủng 12h 24h 36h 48h M4V 0,9 1,7 2,3 1,4 M151 0,6 1,6 1,7 M251 0,7 1,3 1,7 0,8 Hình 3.5 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng thời gian nuôi cấy Hình 3.6 Khả sinh cellulase chủng M151 M4V 36h Bùi Thị Thủy 33 Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.7 Khả sinh cellulase chủng M251 M4V 24h Khi cấy nấm mốc vào môi trường, chúng không tiết enzyme mà tiết kiệm lượng đến mức tối đa sử dụng chất dễ sử dụng đường đơn, chất khoáng có sẵn Sau chúng tiết enzyme tuỳ vào thành phần chất có môi trường Nấm mốc phát triển chia thành giai đoạn: thích nghi, phát triển, cân tử vong Ở giai đoạn thích nghi phát triển, nấm mốc tìm cách thích nghi tiết loại enzyme số lượng để tồn phát triển Theo thời gian lượng enzyme tăng dần đến mức độ ổn định, sau giảm môi trường dinh dưỡng cạn kiệt Qua biểu đồ ta thấy, hoạt tính enzyme ba chủng tăng dần từ 12h – 36h, đạt cực đại 36h sau 36h nuôi cấy khả sinh cellulase giảm dần sinh trưởng nấm mốc giảm dần.Khi thời gian nuôi cấy 12h, M4V cho hoạt tính enzyme mạnh 0,9cm cao so với M151 M251 0,3cm 0,2cm.Ở 24h, M4V cho hoạt tính cao so với M151 M251là 0,1cm 0,4cm.Ở 36h, M4V cho hoạt tính enzyme mạnh 2,3cm, cao so với M151 M251 0,6cm.Ở 48h, M4V cho hoạt tính cao so với M151 M251là 0,4cm 0,6cm Bùi Thị Thủy 34 Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Kết nghiên cứu cho thấy, chủng M4V có khả sinh tổng hợp cellulse mạnh 36h Kết phù hợp với nghiên cứu Nguyễn Đức Lượng cộng sự, 2004; Nguyễn Trọng Cấn cộng sự, 1998 cho nấm sợi phát triển từ 36 – 48h cho hoạt tính cellulase cao, xạ khuẩn phải 72h tổng hợp cellulase nhiều.Vậy chủng M4V có khả ứng dụng sản xuất cellulase cao có thời gian sinh tổng hợp cellulase nhanh 36h 3.2.5 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh cellulase Để phân giải polysaccarit khó phân giải cellulose tế bào vi sinh vật cần phải tổng hợp lượng lớn cellulase, trình tổng hợp cần tới lượng lớn nitơ, sử dụng tới 60% nitơ tổng số cho việc sản xuất enzyme Vì vậy, việc nghiên cứu ảnh hưởng nguồn nitơ lên khả sinh tổng hợp cellulase chủng nấm mốc để lên men có ý nghĩa quan trọng Ba chủng nấm Penicillium M4V, Aspergillus M151, Aspergillus niger M251 tuyển chọn nuôi cấy môi trường Czapek – Dox thích hợp với nguồn nitơ sử dụng Pepton, NaNO3, NH4Cl, (NH4)2SO4 thời gian 36h Sau đó, lấy dịch đem li tâm loại bỏ sinh khối Xác định hoạt tính cellulase dịch nuôi cấy theo phương pháp trình bày phần 2.2.2.3 Bảng 3.6 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh cellulase Chủng Hoạt tính (D – d) Pepton NH4Cl 2,2 1,8 M4V NaNO3 M151 1,5 1,6 1,3 M251 1,4 1,3 0,7 Bùi Thị Thủy 35 (NH4)2SO4 1,7 Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.8 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh cellulase Sau 36h lên men rắn với tỷ lệ chất 4:4:2 (vỏ trấu: vỏ lạc: lõi ngô) nhiệt độ 320C Qua bảng số liệu cho thấy chủng có khả sử dụng nhiều nguồn nitơ cho kết khác nhau.Trong nguồn nitơ nghiên cứu pepton tốt cho sinh tổng hợp cellulase với hoạt tính enzyme cao hẳn so với nguồn nitơ lại chủng, sau nguồn NaNO3 cuối NH4Cl, (NH4)2SO4 Xét chủng nấm mốc, M4V có khả sinh cellulase tốt nguồn nitơ: cao Pepton 2,2cm cao so với M151, M251theo tỷ lệ tương ứng 0,6cm 0,9cm; NaNO3, M4V cao so với M151, M251theo tỷ lệ tương ứng 0,5cm 0,6cm; NH4Cl, M4V cao so với M151, M251theo tỷ lệ tương ứng 0,5cm 0,8cm; (NH4)2SO4 , M4V cao so với M151, M251theo tỷ lệ tương ứng 0,7cm 1cm Như vậy, chủng Penicillium M4V có khả sinh cellulase mạnh chủng Nhưng sử dụng nguồn dinh dưỡng nitơ hữu pepton sản xuất lại gặp vấn đề khó khăn giá thành cao Vì vậy, thường sử dụng nguồn nitơ vô muối NaNO3 Điều phù hợp với nhiều nghiên cứu cho nitrat nguồn nitơ thích hợp cho tổng hợp cellulase nhiều nấm sợi Aspergillus, Trichoderma,…Các muối nitrat nguồn thức ăn thích hợp với nhiều xạ khuẩn, nấm mốc tảo [18] Bùi Thị Thủy 36 Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.9 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh cellulase M4V Bùi Thị Thủy 37 Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.10 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh cellulase M151 Hình 3.11 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh cellulase M251 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 1.1 Từ 20 chủng nấm mốc có khả sinh tổng hợp cellulase phòng thí nghiệm Vi sinh, khoa Sinh – KTNN trường ĐHSP Hà Nội phân lập từ mẫu rác thải, cành gỗ, cây, rơm rạ mục Vĩnh Phúc, tuyển chọn chủng M4V, M151 M251 có khả sinh tổng hợp cellulase cao, ổn định thuộc chi Penicillium (M4V), Aspergillus (M151), Aspergillus niger (M251) 1.2 Đã tìm nguồn phế phụ phẩm tốt cho chủng vỏ trấu, chủng Penicillium M4V cho hoạt tính cellulase cao loại: vỏ trấu (2,5 cm), vỏ lạc (2,2 cm), lõi ngô (2,1 cm) 1.3 Nâng cao chất lượng phế phụ phẩm phương pháp phối trộn với tỷ lệ 4:4:2 tốt chủng: M4V (2,8cm), M151 (2,3 cm), M251 (2,3 cm) Bùi Thị Thủy 38 Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 1.4 Đã tìm điều kiện lên men tốt tỷ lệ 4:4:2 chủng là: nguồn cellulose tự nhiên tốt vỏ trấu; nhiệt độ thích hợp 320C; thời gian thích hợp 36h; nguồn nitơ hữu tốt pepton, nguồn nitơ vô tốt NaNO3 Kiến nghị Qua trình nghiên cứu, đưa số đề xuất sau: 2.1 Chọn M4V nghiên cứu điều kiện khác để nâng cao chất lượng phế phụ ứng dụng chăn nuôi 2.2 Xác định khả sinh độc tố M4V TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Chu Thị Thanh Bình, Nguyễn Lân Dũng, Lương Thị Thùy Dương (2002) Phân lập, tuyển chọn nghiên cứu chủng nấm men có khả phân giải cellulose nhằm ứng dụng xử lý bã thải hoa làm thức ăn chăn nuôi, Trung tâm Công nghệ Sinh học, Đại học quốc gia Hà Nội Nguyễn Lân Dũng (1976) Góp phần nghiên cứu cải tiến cấu thức ăn chăn nuôi lợn, Báo cáo Hội nghị khoa học, Trường Đại học Tổng hợp Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Thế Hòa, Nguyễn Anh Bảo (1991) Điều kiện sinh khối nấm sợi Aspergillus hennebergii TH 386 môi trường xốp sắn ngô, Tạp chí nông nghiệp công nghệ thực phẩm Nguyễn Lân Dũng (1994) Nghiên cứu khả phân giải cellulose số chủng vi sinh vật phân lập Việt Nam, Báo cáo Hội nghị khoa học ủy ban Khoa học kĩ thuật nông nghiệp Bùi Thị Thủy 39 Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thành Đạt (2007) Cơ sở sinh học vi sinh vật Nxb ĐHSP; 201 – 203 Đặng Minh Hằng (1999) Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp cellulose số chủng vi sinh vật để xử lý rác, Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc Nxb Khoa học kỹ thuật: 333 – 339 Trịnh Đình Khá, Quyền Đình Thi, Nguyễn Sĩ Lê Thanh (2007), Tuyển chọn nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố môi trường lên khả sinh tổng hợp cellulase chủng penicillium sp DTQ-HK1, Tạp chí Công nghệ sinh học (3), 355-362 Phạm Ngọc Lan, Phạm Thị Hòa, Lý Kim Bảng (1999) Tuyển chọn số chủng xạ khuẩn có khả phân giải cellulose từ mùn rác, Báo cáo khoa học, hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc Nxb Khoa học kỹ thuật Hà Nội: 177 – 182 Mai Xuân Lương (2005) Giáo trình Enzyme, NXB Đại học Đà Lạt 10 Nguyễn Đức Lượng (2003) Sản xuất cà phê theo phương pháp enzyme, Báo cáo khoa học hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc Nxb khoa học kỹ thuật Hà Nội: 318 – 320 11 Lương Đức Phẩm (2004) Công nghệ vi sinh vật Nxb Nông Nghiệp, 269 – 272 12 Đỗ Hữu Phương Đặc san khoa học kỹ thuật thức ăn chăn nuôi, số 3/2004 13 Nguyễn Thị Thu Sang (2006) Tìm hiểu ứng dụng nhóm enzyme cellulase, Trường ĐH Công nghiệp thực phẩm TP HCM 14 Nguyễn Xuân Thành, Lê Văn Hưng, Phạm Văn Toản (2003) Công nghệ vi sinh vật sản xuất nông nghiệp xử lý môi trường Nxb Nông nghiệp Bùi Thị Thủy 40 Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 15 Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy,Nguyễn Xuân Sâm (2004) Công nghệ enzyme Nxb Khoa học kỹ thuật Hà Nội 16 Quyền Đình Thi, Nguyễn Thị Bẩy, Mai Thị Thanh, Nguyễn Thị Thảo, Lê Thị Thu Giang, Nguyễn Thị Tuyết Nhung, Nguyễn Ngọc Dũng (2003)“Phân lập chủng vi khuẩn sinh tổng hợp lipase từ nước thải khảo sát hoạt tính lipase 102 chủng Pseudomonas”, Tạp chí Di truyền học Ứng dụng, 4, tr 37- 42 17 Trần Đình Toại, Trần Thị Hồng (2007) Tương lai ứng dụng enzyme xử lý phế thải, Tạp chí khoa học ĐHQG Hà Nội, Khoa học tự nhiên công nghệ 23: 75 – 85 18 Trần Cẩm Vân Vi sinh vật học môi trường Nxb ĐHQG Hà Nội; tr 67 TIẾNG ANH 19 Borman, A.M., Linton, C.J., Miles, S.J and Johnson E.M (2008),“Molecular identification of pathogenic fungi”, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 61, Suppl 1, pp i7–i12 20 Beisson, F., Tiss, A., Rivière, C and Verger, R (2000), “Methods for lipase detection and assay: a critical review”, European Journal of LipidScience and Technology, pp 133–153 21 Hennequin, C., Abachin, E., Symoens, F., Lavarde, V., Reboux, G.,Nolard, N and Berche, P (1999), “Identification of Fusarium Species Involved in Human Infections by 28S rRNA Gene Sequencing”, Journal of Medical Microbiology, 37(11), pp 3586 – 3589 22 Fell, J.W., Boelkhout, T., Fonseca, A and Scorzetti, G (2000), “Biodiversity and systematics of basidiomycetous yeasts are determined by large-subunit rDNA D1/D2 domain sequence analysis”, International Bùi Thị Thủy 41 Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 50, pp 1351 1371 TÀI LIỆU INTERNET 23 http://vi.wikipedia.org/wiki/Cellulose 24 http://www.thuviensinhhoc.com 25 https://www.google.com.vn/#sclient=psyab&q=h%C3%A0m+l%C6%B0%E1%BB%A3ng+cellulose+trong+r%C6%A1m&oq=h%C 3%A0m+l%C6%B0%E1%BB%A3ng+cellulose+trong+r%C6%A1m&gs_l=serp.3 405695 420815.6.421218.30.20.0.0.0.0.0.0 0.0 0.0 1c.1.9.psyab.B3_eKassgho&pbx=1&bav=on.2 ,or.r_cp.r_qf.&fp=f7ef4f2c08c4ba18&biw=1366&bih=667 26 https://docs.google.com/viewer?a=v&q=cache:no2wh9gFWXMJ:www.anbinhpaper.com/use rfiles/file/San%2520xuat%2520giay%2520tu%2520rom%2520ra.pdf+&hl=vi&gl=vn&pid= bl&srcid=ADGEESjltFekkZMJr_omBWL19sly1RM2nsqiqiKpPyQ4APEznqLqv0AtbFvtEe MrA3gO2BvGuEnyFC1E0s67smCx4hfI8tOL3r7K2prTWYt7kBSLCJrGD6v9TLJH2IlYhw DQeZgvWz7&sig=AHIEtbQr26ofO-WfeCNSJAbOlrqY8zePgA 27 http://S4 Zetaboards.com/Biofood-tech/topic/9374593/1 Bùi Thị Thủy 42 [...]... định bằng hiệu số (D – d) cm 2.3.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố môi trường đến hoạt tính cellulase * Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của cellulase Cho dịch cellulase và dung dịch 1% CMC phản ứng với nhau ở các mức nhiệt độ khác nhau từ 250C đến 400C trong 36h Hoạt tính cellulase của các dịch được xác định theo phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch * Xác định ảnh hưởng của thời... tôi chọn ba chủng này để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo Bùi Thị Thủy 26 Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp 3.2 Ảnh hƣởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase của 3 chủng Penicillium M4V, Aspergillus M151, Aspergillus niger M251 3.2.1 Ảnh hưởng của nguồn cellulose đến khả năng sinh cellulase Tiến hành nuôi cấy 3 chủng M151, M251 và M4V trong môi trường rắn thích hợp... enzyme ở nhiều chủng [13] 1.6.3 Điều kiện nuôi cấy * Ảnh hƣởng của nhiệt độ Nhiệt độ là một trong số các yếu tố có ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình sinh tổng hợp enzyme của các loài nấm khác nhau.Nhiệt độ tối thích cho sự sinh trưởng của đa số các loài nấm mốc trên môi trường rắn là 250C – 400C Nhiệt độ trên 400C hoặc dưới 250C nấm mốc phát triển chậm, thời gian nuôi kéo dài, giảm khả năng tổng hợp... bằng phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch (William, 1983) Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh cellulase Chủng Bùi Thị Thủy 0 26 C Hoạt tính D – d (cm) 32 C 380C 440C 0 30 500C Trường ĐHSP Hà Nội 2 M4V M151 M251 2,6 2,2 1,7 Khóa luận tốt nghiệp 2,8 2,4 2 2,3 2 1,8 1 0,7 0,4 0 0 0 Hình 3.4 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh cellulase Nhiệt độ là yếu tố quan... giảm tốc độ sinh trưởng đến 10% khi Aw=0,9 [5] Khi nuôi cấy vi sinh vật bằng phương pháp lên men rắn thì độ ẩm môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh tổng hợp enzyme của các chủng nuôi cấy Nếu độ ẩm môi trường nuôi cấy quá thấp (< 50%) hoặc quá cao (> 80%), nấm mốc không phát triển được hoặc phát triển rất chậm, do đó hàm lượng enzyme sinh ra theo đó mà giảm dần CHƢƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP... dịch nuôi cấy theo phương pháp đã được trình bày ở phần 2.2.2.3 Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh cellulase Chủng Hoạt tính (D – d) Pepton NH4Cl 2,2 1,8 M4V NaNO3 2 M151 1,5 1,6 1,3 1 M251 1,4 1,3 1 0,7 Bùi Thị Thủy 35 (NH4)2SO4 1,7 Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.8 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh cellulase Sau 36h lên men rắn với tỷ lệ cơ... cho môi trường kiềm hóa, tạo điều kiện thuận lợi cho sự tạo thành cellulase Các hợp chất nitơ hữu cơ có tác dụng khác nhau đến sinh tổng hợp cellulase. Điều này phụ thuộc vào điều kiện sinh lí của từng chủng giống Cao ngô và cao nấm men có tác dụng nâng cao hoạt lực cellulase của vi sinh vật, nhưng với cao ngô khả năng sinh tổng hợp C1- cellulase và Cx- cellulase cao hơn so với nấm men Nước chiết nấm men. .. Thị Thủy 32 Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Bảng 3.5 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase Hoạt tính D – d (cm) Chủng 12h 24h 36h 48h M4V 0,9 1,7 2,3 1,4 M151 0,6 1,6 1,7 1 M251 0,7 1,3 1,7 0,8 Hình 3.5 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy Hình 3.6 Khả năng sinh cellulase của chủng M151 và M4V ở 36h Bùi Thị Thủy 33 Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp... bản chất của enzyme là protein nên khi ở nhiệt độ cao (≥500C) sẽ làm biến tính protein dẫn đến làm mất hoạt tính enzyme Như vậy, chủng M4V có khả năng sinh cellulase mạnh nhất và đạt cực đại ở 320C Nghiên cứu của tôi phù hợp với nghiên cứu về các chủng nấm sợi khác cũng có khả năng sinh tổng hợp cellulase cao ở dải nhiệt độ từ 310C – 340C (Đặng Thị Hằng, 1999) Nhiệt độ thích hợp với đa số nấm mốc là... luận tốt nghiệp Tỷ lệ M4V 4:3:3 Tỷ lệ M4V 4:4:2 Tỷ lệ M4V 6:3:1 Tỷ lệ M4V 6:2:2 Hình 3.3 Khả năng sinh cellulase của các tỷ lệ phối trộn 3.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh cellulase Nuôi cấy ba chủng nấm Penicillium M4V, Aspergillus M151, Aspergillus niger M251 trên môi trường rắn theo tỷ lệ phối trộn 4:4:2 (vỏ trấu: vỏ lạc: lõi ngô) ở các nhiệt độ khác nhau trong 36h Xác định hoạt tính bằng ... tài  Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm mốc có khả sinh cellulase mạnh từ phế phụ phẩm nông nghiệp  Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh cellulase chủng M4V, M151 M251 từ lên men rắn thu cellulase. .. [3] Nghiên cứu tập trung vào nghiên cứu số yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả sinh cellulase chủng nấm mốc, ứng dụng việc xử lý phế phẩm nông nghiệp làm thức ăn gia súc Mục đích nghiên cứu Nghiên. .. chọn chủng nấm mốc có hoạt tính phân giải cellulose mạnh  Nghiên cứu ảnh hưởng số điều kiện môi trường đến khả sinh cellulase số chủng nấm mốc Bùi Thị Thủy Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp