Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH-KTNN ……………………………… NGUYỄN THỊ HOA ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TẠO MÔ SẸO VÀ TÁI SINH CÂY Ở MỘT SỐ GIỐNG LÚA NHẬT BẢN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Chuyên ngành: Di truyền học Ngƣời hƣớng dẫn: TS LÊ XUÂN ĐẮC HÀ NỘI - 2012 Nguyễn Thị Hoa K34E Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, xin chân thành cảm ơn TS Lê Xuân Đắc, Viện Công nghệ sinh học - Viện khoa học Công nghệ Việt Nam tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn trình thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể cán Trại Thực nghiệm sinh học Viện Công nghệ sinh học giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho hoàn thành khóa luận Tôi xin cảm ơn TS Nguyễn Nhƣ Toản có đóng góp quý báu trình thực đề tài Tôi xin cảm ơn thầy cô giáo trƣờng Đại học sƣ phạm Hà Nội truyền đạt khiến thức kinh nghiệm nghiên cứu khoa học cho suốt thời gian thực tập Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè - ngƣời động viên, khích lệ giúp đỡ suốt trình học tập thực đề tài Hà Nội, tháng năm 2012 Sinh viên Nguyễn Thị Hoa Nguyễn Thị Hoa K34E Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan khóa luận kết nghiên cứu riêng tôi, tƣ liệu đƣợc trích dẫn khóa luận trung thực Kết nghiên cứu không trùng lặp với công trình nghiên cứu đƣợc công bố trƣớc Nếu sai xin chịu hoàn toàn trách nhiệm Ngƣời thực Nguyễn Thị Hoa Nguyễn Thị Hoa K34E Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục đích nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Địa điểm thời gian nghiên cứu Ý nghĩa đề tài Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan lúa 1.1.1 Nguồn gốc 1.1.2 Phân loại lúa 1.2 Các phƣơng pháp chọn tạo giống lúa 1.2.1 Chọn tạo phƣơng pháp đột biến 1.2.2 Tạo giống trồng phƣơng pháp chuyển gen 1.2.3 Tạo giống phƣơng pháp lai 11 1.2.4 Nhập nội giống thích nghi 12 1.3 Nuôi cấy mô tế bào thực vật ứng dụng 13 1.3.1 Cơ sở khoa học nuôi cấy mô tế bào thực vật 14 1.3.2 Nuôi cấy mô sẹo (callus) 16 1.3.3 Hệ thống tái sinh nuôi cấy mô tế bào thực vật 17 1.3.4 Ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật 19 1.4 Tình hình sản xuất lúa gạo giới Việt Nam 22 1.4.1 Tình hình sản xuất lúa gạo giới 22 Nguyễn Thị Hoa K34E Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 1.4.2 Tình hình sản xuất lúa gạo Việt Nam 24 Chƣơng 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Nguyên liệu 25 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 25 2.2.1 Tạo nguyên liệu vô trùng 26 2.2.2 Nuôi cấy tạo mô sẹo 26 2.2.3 Nhân mô sẹo 26 2.2.4 Tái sinh 27 2.2.5 Tạo hoàn chỉnh 27 2.2.6 Đƣa trồng 27 2.3 Thu thập xử lý số liệu 28 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Tạo nguyên liệu vô trùng 30 3.2 Tạo mô sẹo 31 3.2.1 Ảnh hƣởng 2,4D đến khả tạo mô sẹo 31 3.2.2 Ảnh hƣởng nồng độ BAP tới khả tạo mô sẹo 32 3.3 Nhân mô sẹo 34 3.4 Tái sinh 35 3.4.1 Ảnh hƣởng tổ hợp BAP kinetin tới khả tái sinh 35 3.4.2 Ảnh hƣởng tổ hợp BAP NAA tới khả tái sinh 37 3.5 Tạo hoàn chỉnh 38 3.6 Ảnh hƣởng giá thể tới khả sống 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 Nguyễn Thị Hoa K34E Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Kết luận 42 Kiến nghị 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 Nguyễn Thị Hoa K34E Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Tỷ lệ hạt nhiễm khử trùng 30 Bảng 3.2 Tỷ lệ mô sẹo môi trƣờng 2,4D (2 mg/l) 31 Bảng 3.3 Tỷ lệ tạo mô sẹo môi trƣờng CT2 32 Bảng 3.4 Đánh giá chất lƣợng mô sẹo môi trƣờng nhân mô sẹo 34 Bảng 3.5 Tỷ lệ tái sinh môi trƣờng TS1 36 Bảng 3.6 Tỷ lệ tái sinh môi trƣờng TS2 37 Bảng 3.7 Khả tạo hoàn chỉnh 39 Bảng 3.8 Tỷ lệ sống loại giá thể 41 Nguyễn Thị Hoa K34E Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Trang Hình 3.1 Tạo giống mô sẹo NIP1 NH3 môi trƣờng 0,2mg/l BAP Hình 3.2 33 Tỷ lệ tạo mô sẹo giống công thức môi trƣờng 33 Hình 3.3 Nhân mô sẹo giống NH2 môi trƣờng có 0,5mg/l BAP 35 Hình 3.4 Tái sinh giống NIP1 (BAP 2mg/l kinetin 0,3mg/l) 38 Hình 3.5 Tạo hoàn chỉnh giống NH3 40 Hình 3.6 Cây lúa trồng giá thể nƣớc sau 10 ngày 41 Nguyễn Thị Hoa K34E Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2,4 D 2,4 - Dichlorophenoxy Axetic Axit BAP - Benzyl Amino Purin ĐC Đối chứng IAA Indol - 3- Axetic Axit IBA - Indol Butyric Axit Kinetin furfuryl-amino-purin KTST Kích thích sinh trƣởng MS Môi trƣờng Murashige Skoog NAA α- Napthalen Axetic Axit TB Trung bình cs Cộng MT Môi trƣờng VTM vitamin Nguyễn Thị Hoa K34E Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Lúa lƣơng thực nƣớc châu Á Nó vào văn hóa nhiều dân tộc, có vị sở thích ăn loại cơm khác Trong dân Đông Đông Nam Á thích loại gạo hạt dài nhƣ Basmati, Jasmine nƣớc Đông Bắc Á lại thích loại gạo tròn Gạo tròn thích hợp trồng vùng ôn đới Những nƣớc ăn gạo hạt tròn thƣờng thuộc nƣớc phát triển sản xuất không đủ, họ sẵn sàng trả tiền cao để mua loại gạo Điều thời gian tới thay đổi, Viện nghiên cứu lúa Quốc tế IRRI gần chọn tạo đƣợc giống lúa có dạng hạt gạo tròn nhiệt đới Japonica Philippines, giống NSIC Rc170 IRRI 142 để gieo trồng diện rộng Các giống lúa mang đầy kỳ vọng giúp nông dân Philippines đạt lợi nhuận cao hơn, giúp ngƣời tiêu dùng thƣởng thức đƣợc gạo Nhật với giá rẻ, đồng thời mở triển vọng nông dân Việt Nam Dù đƣợc mệnh danh cƣờng quốc xuất gạo lớn thứ hai giới, nhƣng giá gạo xuất Việt Nam thƣờng thấp gạo loại thị trƣờng giới Một nguyên nhân chất lƣợng Hiện tại, nhu cầu lúa gạo giới tăng cao, nên nông dân bán gạo với giá cao Tuy nhiên, giá trị xuất gạo Việt Nam lại hẳn so với giá gạo Thái Lan Đầu tƣ cho giống lúa chất lƣợng cao đạt tiêu chuẩn xuất đƣợc nhà nƣớc đầu tƣ mạnh năm qua, chất lƣợng gạo Việt Nam cải thiện nhiều so với trƣớc Vào thời điểm năm 1990, gạo xuất Việt Nam đa phần loại gạo chất lƣợng thấp (35 đến 45% tấm) Hiện nay, tỷ lệ gạo đến 10% mức 50% Tuy nhiên tỷ lệ gạo chất lƣợng cao, gạo thơm cho thị trƣờng xuất cao cấp Nguyễn Thị Hoa 10 K34E Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 3.2 Tạo mô sẹo Trong môi trƣờng nuôi cấy in vitro, bên cạnh chất đa lƣợng, vi lƣợng, vitamin bổ sung nhiều loại kích thích sinh trƣởng (KTST) thuộc nhóm auxin, cytokinin… cần thiết để kích thích sinh trƣởng, phát triển phân hóa quan Tuy nhiên yêu cầu với chất thay đổi tùy theo loài cây, loại mô, mục đích nghiên cứu Đặc biệt, việc sử dụng tổ hợp chất KTST môi trƣờng nuôi cấy tỏ hiệu so với sử dụng chất riêng biệt Mặt khác hệ thống nuôi cấy, tỷ lệ auxin/cytokinin có ý nghĩa quan trọng phát sinh hình thái mô nuôi cấy Việc tìm công thức môi trƣờng với nồng độ tỷ lệ chất kích thích sinh trƣởng phù hợp cho loại cây, giai đoạn nuôi cấy sở cho nghiên cứu định thành bại trình nuôi cấy in vitro 3.2.1 Ảnh hưởng 2,4D đến khả tạo mô sẹo Hạt gạo sau vô trùng đƣợc cấy môi trƣờng tạo mô sẹo CT1 (MS+ 2mg/l 2,4D), sau tuần nuôi xác định tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo Bảng 3.2: Tỷ lệ tạo mô sẹo môi trƣờng 2,4D (2 mg/l) Giống NIP1 NH2 NH3 Số hạt cấy 132 140 117 Số hạt tạo mô sẹo 124 128 106 Tỷ lệ tạo mô sẹo (%) 93,9 91,4 90,6 Nguyễn Thị Hoa 40 K34E Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Kết thu đƣợc bảng 3.2, ta thấy với nồng độ mg/l 2,4D khả tạo mô sẹo ba giống lúa NIP1 , NH2, NH3 tƣơng đối cao, tỷ lệ tạo mô sẹo cao giống NIP1 Theo quan sát mô sẹo đƣợc tạo môi trƣờng thƣờng nhỏ, cứng Theo nghiên cứu trƣớc loại mô sẹo thƣờng không thích hợp cho trình tái sinh 3.2.2 Ảnh hưởng nồng độ BAP tới khả tạo mô sẹo Để tối ƣu hóa môi trƣờng tạo mô sẹo phục vụ nghiên cứu tiếp theo, sử dụng môi trƣờng CT2 (2 mg/l 2,4D + BAP (0,2 mg/l) môi trƣờng CT3 0,5 mg/l), sau tuần nuôi cấy thu đƣợc kết nhƣ bảng 3.3 Bảng 3.3: Tỷ lệ tạo mô sẹo môi trƣờng CT2 Giống NIP1 NH2 NH3 Nồng độ BAP (mg/l) 0,2 0,5 0,2 0,5 0,2 0,5 Số hạt cấy 120 115 110 124 118 130 Số hạt tạo mô sẹo 109 104 102 116 106 119 Tỷ lệ tạo mô sẹo (%) 90,8 90,4 92,7 93,5 89,8 91,5 Theo kết bảng 3.3 khả tạo mô sẹo nồng độ 0,2 mg/l BAP tƣơng đối cao, chất lƣợng mô sẹo tốt, mô sẹo có màu vàng nhạt phù hợp với trình nuôi cấy (hình 3.1) Với nồng độ BAP 0,5mg/l tỷ lệ tạo mô sẹo cao (hình 3.2), nhƣng khối mô sẹo thƣờng xốp, phát triển nhanh, mô nhanh chuyển màu vàng nâu mọng nƣớc, không phù hợp với trình thí nghiệm Nguyễn Thị Hoa 41 K34E Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.1: Tạo mô sẹo giống lúa NIP1 NH3 môi trƣờng 02mg/l BAP 94 93 92 91 CT1 CT2 CT3 90 89 88 87 NIP1 NH2 NH3 Hình 3.2: Tỷ lệ tạo mô sẹo giống công thức môi trƣờng Qua kết thu đƣợc từ thí nghiệm ba môi trƣờng khác CT1, CT2 CT3, chúng nhận thấy công thức CT2 phù hợp để làm môi trƣờng tạo mô sẹo giống lúa Nhật Bản Nguyễn Thị Hoa 42 K34E Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 3.3 Nhân mô sẹo Để có mô sẹo đồng với số lƣợng đủ lớn để tiến hành nghiên cứu cần thiết phải nhân mô sẹo Theo nghiên cứu trƣớc nhân mô sẹo với nồng độ 2,4D cao gây độc cho mô sẹo làm mô sẹo nhanh chết ảnh hƣởng đến chất lƣợng mô sẹo khả tái sinh Vì vậy, loại mô sẹo giống trồng khác nhau, nhân mô sẹo cần phải xác định đƣợc nồng độ 2,4D thích hợp Ở đây, sử dụng nồng độ 2,4D từ 0,9 mg/l trở xuống sau 15 ngày nuôi thu đƣợc kết bảng 3.4 Bảng 3.4: Đánh giá chất lƣợng mô sẹo môi trƣờng nhân mô sẹo Nồng độ 2,4D (mg/l) Chất lƣợng mô sẹo 0,9 Nhân nhanh, mô xốp, bị chết nhiều 0,7 Nhân nhanh, số mô bị chết 0,5 Nhân nhanh, mô phát triển tốt, đồng 0,3 Nhân chậm, mô nhỏ, bị cứng 0,1 Nhân chậm, mô nhỏ ĐC (0,0) Không nhân Kết cho thấy nồng độ 0,9 mg/l xuống 0,5 mg/l 2,4D mô sẹo đƣợc nhân lên nhanh nhƣng nồng độ 0,9 mg/l cao nên mô sẹo bị ngộ độc nhiều mô bị chết Ở nồng độ 0,3 mg/l 0,1 mg/l mô sẹo đƣợc nhân lên chậm, khí môi trƣờng 2,4D mố ẹo không Nguyễn Thị Hoa 43 K34E Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp thể nhân lên đƣợc Nhƣng nồng độ 0,5 mg/l 2,4D mô sẹo đƣợc nhân nhanh, phát triển tốt đồng (hình 3.3) Nhƣ vậy, sử dụng môi trƣờng bổ sung 0,5 mg/l 2,4D để nhân mô sẹo với khối lƣợng lớn phục vụ nghiên cứu Hình 3.3: Nhân mô sẹo giống NH2 môi trƣờng có 0,5mg/l BAP 3.4 Tái sinh 3.4.1 Ảnh hưởng tổ hợp BAP kinetin tới khả tái sinh Mô sẹo sau nhân đƣợc cấy chuyển sang nuôi cấy môi trƣờng TS1 có bổ sung 2mg/l BAP kinetin nồng độ thay đổi (0,1 - 0,9mg/l) Sau nuôi cấy tháng thu đƣợc kết nhƣ bảng 3.5 Nguyễn Thị Hoa 44 K34E Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Bảng 3.5: Tỷ lệ tái sinh môi trƣờng TS1 Tên giống NIP1 NH2 NH3 Nồng độ Tỷ lệ tái Chồi Tỷ lệ tái Chồi Tỷ lệ tái Chồi kinetin sinh TB/mô sinh (%) TB/mô sinh (%) TB/mô (mg/l) (%) ĐC 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,1 36,7 3,3 33,3 3,1 40,0 3,4 0,3 46,7 4,2 41,7 4,4 51,7 4,7 0,5 41,7 4,0 40,0 4,1 45,0 4,1 0,7 35,0 3,6 31,7 3,7 41,7 3,8 0,9 33,3 2,9 25,0 3,3 35,0 3,5 Ở nồng độ kinetin khác nhau, kết thu đƣợc cho thấy với nồng độ 0,9mg/l tỷ lệ tái sinh thấp 25,0% (giống NH2) cao 51,7% nồng độ 0,3mg/l (giống NH3) Tỷ lệ tái sinh thƣờng phụ thuộc nồng độ chất KTST loại môi trƣờng khác kiểu gen giống Nhìn chung, nồng độ kinetin 0,3mg/l cho tỷ lệ tái sinh cao giống nghiên cứu Kết thu đƣợc bảng 3.5 cho thấy số chồi trung bình/mô nồng độ kinetin 0,3mg/l cao giống Nhƣ vậy, môi trƣờng tái sinh với nồng độ Kinetin khác nồng độ 0,3 mg/l tỷ lệ tái sinh số mô/cây cao Nguyễn Thị Hoa 45 K34E Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 3.4.2 Ảnh hưởng tổ hợp BAP NAA tới khả tái sinh Trên công thức môi trƣờng TS2 nồng độ BAP vần giữ nguyên 2mg/l bổ sung NAA nồng độ từ 0,1 mg/l đến 0,9 mg/l thu đƣợc kết nhƣ bảng 3.6 Bảng 3.6: Tỷ lệ tái sinh môi trƣờng TS2 Tên giống NIP1 NH2 NH3 Nồng độ Tỷ lệ tái Chồi Tỷ lệ tái Chồi Tỷ lệ tái Chồi NAA sinh (%) TB/mô sinh (%) TB/mô sinh (%) TB/mô ĐC 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,1 28,3 2,5 36,7 2,3 33,3 2,6 0,3 36,7 3,4 40,0 3,7 38,3 2,9 0,5 33,3 3,2 33,3 3,6 35,0 2,2 0,7 28,3 2,8 31,7 3,2 30,0 1,9 0,9 26,7 2,4 31,7 2,6 23,3 1,8 (mg/l) Theo kết bảng trên, tỷ lệ mô sẹo tái sinh thấp nồng độ NAA 0,9 mg/l 23,3% giống NH3, số chồi trung bình/mô 1,8 Tỷ lệ tái sinh cao 40,0% tƣơng ứng với số chồi trung bình nhiều 3,7 nồng độ 0,3 mg/l NAA giống NH2 Nhìn chung, tỷ lệ tái sinh cao ba giống nồng độ 0,3 mg/l NAA So với nghiên cứu trƣớc giống lúa khác, tỷ lệ tái sinh giống lúa nghiên cứu thấp (Lê Xuân Đắc, 2008) [3] Nguyễn Thị Hoa 46 K34E Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Tổng hợp kết thu đƣợc bảng 3.5 3.6, ta thấy môi trƣờng TS1 có nồng độ BAP 2mg/l kinetin 0,3mg/l cho tỷ lệ tái sinh số trung bình/mô cao (hình 3.5) Vì vậy, sử dụng môi trƣờng có nồng độ BAP 2mg/l kinetin 0,3mg/l để tái sinh phục vụ làm thí nghiệm Hình 3.4: Tái sinh giống NIP1 (BAP 2mg/l kinetin 0,3mg/l) 3.5 Tạo hoàn chỉnh Ra rễ khâu cuối giai đoạn nghiên cứu in vitro Ở thí nghiệm sử dụng môi trƣờng MS + 20g đƣờng + 8g agar + NAA nồng độ khác từ 0,1 mg/l đến 0,6 mg/l Kết thu đƣợc nhƣ bảng 3.7 Nguyễn Thị Hoa 47 K34E Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Bảng 3.7: Khả tạo hoàn chỉnh Giống Nồng độ NIP1 Số NH2 Tỷ lệ Số NH3 Tỷ lệ Số Ghi Tỷ lệ rễ/cây tạo rễ/cây tạo rễ/cây tạo NAA ĐC rễ (%) 3,2 95 rễ (%) 3,4 91 rễ (%) 3,1 94 Ít rễ, rễ ngắn, phát triển chậm 0,1 3,6 100 3,7 100 3,5 100 Ít rễ, rễ ngắn, phát triển chậm 0,2 4,6 100 4,4 100 4,3 100 Số rễ TB, phát triển bình thƣờng 0,4 4,5 100 4,9 100 5,1 100 Số rễ TB, rễ dài, có mô sẹo gốc 0,6 5,3 100 5,6 100 5,4 100 Số rễ nhiều, rễ dài, có nhiều mô sẹo gốc Theo kết bảng 3.7, môi trƣờng đối chứng MS NAA tạo rễ, nhƣng tỷ lệ rễ thấp so với môi trƣờng có bổ sung NAA Ở tất nồng độ thu đƣợc tỷ lệ rễ 100% nhƣng số rễ trung bình nhiều hay tùy thuộc vào nồng độ NAA Số rễ trung bình tăng theo tăng nồng độ NAA Tuy nhiên, nồng độ 0,4 0,6 mg/l có số rễ trung bình cao, rễ dài nhƣng xuất khối mô sẹo gốc cây, điều ảnh hƣởng lớn đến khả sống đƣợc đƣa điều kiện tự nhiên Ở nồng độ 0,2 mg/l có số rễ vừa phải, có màu xanh phát triển bình thƣờng (hình 3.6) Vì vậy, định chọn Nguyễn Thị Hoa 48 K34E Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp môi trƣờng MS + 20g đƣờng + 8g agar + 0,2 mg/l NAA làm môi trƣờng tái sinh giống lúa Nhật Bản phục vụ thí nghiệm Hình 3.5: Tạo hoàn chỉnh giống NH3 3.6 Ảnh hƣởng giá thể tới khả sống Cây in vitro đƣợc nuôi điều kiện ổn định nguồn dinh dƣỡng, ánh sánh, nhiệt độ… Khi chuyển môi trƣờng tự nhiên hoàn toàn khác nên dễ bị chết nƣớc, nhiệt độ cao… Vì ta phải tiến hành làm cho thích nghi dần với điều kiện tự nhiên Thời gian tối thiểu để thích nghi đƣợc với điều kiện bên khoảng - tuần Trong thời gian cần đƣợc chăm sóc bảo vệ cẩn thận Chúng tiến hành thử nghiệm loại giá thể khác nhau: - Đất - Đất + Cát (1:1) - Nƣớc Nguyễn Thị Hoa 49 K34E Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Sau tạo đƣợc hoàn chỉnh ta tiến hành trồng vào loại giá thể Các khay trồng đƣợc phủ kín nilon tuần đầu tiên, đặt nơi có ánh sáng khuyếch tán, thoáng mát, Tỷ lệ sống sau 15 ngày loại giá thể khác thu đƣợc bảng 3.8 Bảng 3.8: Tỷ lệ sống loại giá thể Loại giá thể Số trồng Số sống Tỷ lệ sống (%) Đất 80 43 53,8 Đất + Cát (1:1) 67 47 70,1 Nƣớc 75 68 90,7 Theo kết bảng 3.8 cho thấy loại giá thể ảnh hƣởng lớn đến khả sống sót lúa nuôi cấy in vitro Trên giá thể đất có tỷ lệ sống thấp 53,8% nƣớc có tỷ lệ sống cao 90,7% (hình 3.7) Dựa vào kết trên, định chọn nƣớc làm giá thể nuôi cấy lúa in vitro Hình 3.6: Cây lúa trồng giá thể nƣớc sau 10 ngày Nguyễn Thị Hoa 50 K34E Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Bƣớc đầu xây dựng đƣợc hệ thống nuôi cấy in vitro ba giống lúa NIP1, NH2 NH3 có nguồn gốc từ Nhật Bản Môi trƣờng thích hợp để tạo mô sẹo MS + 20g đƣờng + 8g agar + mg/l 2,4D + 0,2 mg/l BAP môi trƣờng nhân mô sẹo thích hợp MS + 20g đƣờng + 8g agar + 0,5 mg/l 2,4D Môi trƣờng tái sinh thích hợp cho ba giống lúa MS + 20g đƣờng + 8g agar + mg/l BAP + 0,3 mg/l kinetin Môi trƣờng rễ thích hợp MS + 20g đƣờng + 8g agar + 0,2 mg/l NAA giá thể để trồng lúa nuôi cấy in vitro nƣớc cho tỷ lệ sống cao 90,7% Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện quy trình nuôi cấy ống nghiệm để ứng dụng mục đích nghiên cứu khác giống lúa Nhật Bản Nguyễn Thị Hoa 51 K34E Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nghị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học cải tiến giống trồng, NXB Nông Nghiệp Hà Nội Bùi Huy Đáp (1999), Một số vấn đề lúa, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Lê Xuân Đắc (2008), “Nghiên cứu ứng dụng biện pháp công nghệ sinh học nhằm khắc phục nhược điểm sinh lý cao cảm quang giống lúa tám”, Luận án tiến sĩ sinh học, Hà Nội Bộ Nông Nghiệp & phát triển Nông Thôn (2005), Quy phạm khảo nghiệm giống lúa, NXB Nông Nghiệp Lê Văn Hoàng (2007), Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật, NXB Khoa học Kỹ thuật Nguyễn Đức Lƣợng, Lê Thị Thủy Tiên (2006), Công nghệ tế bào, NXB ĐH Quốc Gia TPHCM Lê Duy Thành, (2001), “Cơ sở di truyền chọn giống thực vật”, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật - Nghiên cứu ứng dụng, NXB Nông nghiệp Hà Nội Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phƣơng Thảo, (2005), Giáo trình Công nghệ sinh học nông nghiệp, NXB Nông Nghiệp Hà Nội Nguyễn Thị Hoa 52 K34E Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 10.Mai Thọ Trung, Lê Song Dự, Ngô Thị Đào (1990), Trồng trọt chuyên khoa, NXB Giáo dục, Hà Nội 11.Đỗ Năng Vịnh (2005), Công nghệ tế bào thực vật ứng dụng, NXB Nông nghiệp Hà Nội 12 Vũ Văn Vụ (1998), Sinh lý thực vật ứng dụng, NXB Giáo Dục Hà Nội 13 Đinh Thị Phòng, (2011), “Nghiên cứu khả chịu hạn chọn dòng chịu hạn lúa công nghệ tế bào thực vật”, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Hà nội TÀI LIỆU TIẾNG ANH 14 Khush G S (1997), “Origin, dispersal, cultivation and variation of rice”, Plant Mol Boil, 35, pp.25 – 34 15 Lin Y J., Zhang Q (2005), “Optimising the tissue culture condition for high efficiency transformation of indica rice” Plant Cell Rep.23(8):540547 16 Murashige T, Skoog F (1962), A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures, Physiol Plant, 15: 473-497 17 Rahman M., Malik T.A., Iqbal M.J., Zafar Y., Alam K., Perveen Z., Rehman S., (1998), “Salt impact on somaclonal variation in rice”, Rice Bio Quar, 35: 13-14 18 Jain S.M., (1998), “Somaclonal variation and induced mutations in crop improvement (Current plant science and biotechnology in agriculture)”, Springer Press Nguyễn Thị Hoa 53 K34E Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 19 Xiao J G., Zhaohui C., Yongjun L., Shiping W (2006), “A tissue culture system for different germplasms of indica rice” Plant Cell Reports 25(5):392-402 Website tham khảo: 20 http://www.mt.lhu.edu.vn/Data/News/388/file/Chƣơng%205.doc 21 http://nongnghiep.vn/nongnghiepvn/72/2/2/88582/Lua-gao-the-gioi-20112012.aspx Nguyễn Thị Hoa 54 K34E Sinh - KTNN [...]... đề tài: Đánh giá khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây ở một số giống lúa Nhật Bản , nhằm phục vụ các nghiên cứu tiếp theo đối với các giống lúa này 2 Mục đích nghiên cứu Xây dựng hệ thống tạo mô sẹo, tái sinh cây trong ống nghiệm đối với một số giống lúa Nhật Bản để phục vụ các nghiên cứu ứng dụng nhƣ đột biến mô sẹo hay chuyển gen để chọn tạo giống lúa chất lƣợng cao Nguyễn Thị Hoa 11 K34E Sinh - KTNN... dụng vào chọn tạo giống lúa là sử dụng công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã và đang đƣợc ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực nhân giống và phục tráng cây trồng, chọn tạo giống chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trƣờng, chuyển gen có giá trị kinh tế vào cây trồng, kết hợp nuôi cấy mô và đột biến thực nghiệm… Xuất phát từ cơ sở lý luận và thực tiễn ở. .. dung nghiên cứu - Xác định môi trƣờng có khả năng tạo mô sẹo tốt nhất đối với các giống nghiên cứu - Xác định môi trƣờng tối ƣu để tái sinh chồi của mô sẹo - Xác định môi trƣờng ra rễ của cây tái sinh tốt nhất - Xác định loại giá thể ra cây phù hợp nhất 4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu - Địa điểm nghiên cứu: Trại thực nghiệm sinh học, Viện Công Nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam - Thời... K34E Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Ngoài ra còn một số cách phân loại khác tùy theo tiêu chí đặt ra nhƣ: - Dựa vào hình thái hạt lúa: lúa hạt tròn; lúa hạt dài… - Dựa vào thành phần dinh dƣỡng: lúa nếp; lúa tẻ… - Dựa vào thời gian sinh trƣởng: lúa ngắn ngày; lúa dài ngày… - Dựa vào mùa vụ gieo trồng có: lúa chiêm xuân; lúa mùa; lúa hè thu… 1.2 Các phƣơng pháp chọn tạo giống lúa. .. phấn và hạt phấn - Nuôi cấy tế bào đơn và tế bào trần - Nuôi cấy mô sẹo Các bước nhân giống bằng nuôi cấy mô (microproparation): - Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng hoặc chồi đỉnh chồi bên - Tạo thể nhân giống in- vitro - Nhân giống in vitro - Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro - Chuyển cây in vitro ra vƣờn ƣơm 1.3.2 Nuôi cấy mô sẹo (callus) Mô sẹo là khối mô thực vật gồm những tế bào chƣa phân hoá, có khả năng. .. hữu tính ở những dòng ƣu tú Một số thành tựu nuôi cấy mô cây lúa: Tại Trung Quốc, công nghệ đơn bội đã đƣợc triển khai có hệ thống trên quy mô lớn và có định hƣớng chiến lƣợc rõ ràng trong tạo giống mới Hơn một nghìn cơ sở nuôi cấy bao phấn đã hoạt động trên toàn quốc từ những năm 1970, kết quả đã tạo đƣợc trên 100 giống lúa mới trong một thời gian ngắn Trong đó, giống lúa nƣớc và lúa mì mới tạo ra từ... cấy mô và chuyển gen thông qua giai đoạn mô sẹo và tái sinh tạo chồi mà nhiều giống cây trồng chuyển gen đã đƣợc tạo ra (cà chua, lúa, đậu tƣơng, khoai tây, bông, đu đủ…) (Lê Trần Bình và cs, 1997; Đỗ Năng Vịnh, 2005) [1] [11] Nguyễn Thị Hoa 22 K34E Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp 1.3.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật Cơ sở lý luận của phƣơng pháp nuôi cấy mô và. .. lai xa - Tạo cây đơn bội - Tạo đa phôi Hoa đực (Bao phấn và hạt phấn) - Tạo mô sẹo và cây đơn bội - Tạo đột biến ở mức đơn bội - Tạo dòng đồng hợp tử Nguyễn Thị Hoa 28 K34E Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Phôi hợp tử - Nuôi cấy cứu phôi khi lai xa - Nhân các dòng lai xa - Phá sự ngủ, nghỉ của hạt Mô sẹo - Tạo phôi vô tính - Nuôi cấy tế bào đơn và tách tế bào trần - Tạo cây có biến... nghiệm đối với một số giống lúa Nhật Bản * Ý nghĩa của thực tiễn sản xuất: Các kết quả nghiên cứu của đề tài này có thể phục vụ các nghiên cứu ứng dụng nhƣ đột biến mô sẹo hay chuyển gen trên các giống lúa này để chọn tạo giống lúa chất lƣợng cao Nguyễn Thị Hoa 12 K34E Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về cây lúa 1.1.1 Nguồn gốc Cây lúa trồng... chọn giống ở Viện lúa Đồng bằng Sông Cửu Long, Viện Công nghệ sinh học, vv Viện Công nghệ sinh học đã tạo đƣợc giống lúa mới DR2 có khả năng chịu hạn, chịu lạnh bằng phƣơng pháp chọn lọc các biến dị tế bào soma in vitro từ một giống lúa không có khả năng chống chịu Giống này đã đƣợc công nhận là giống quốc gia (http://mt.lhu.edu.vn/Data/News/388/file/Chƣơng%205.doc) [20] 1.4 Tình hình sản xuất lúa ... Bảng 3.3 Tỷ lệ tạo mô sẹo môi trƣờng CT2 32 Bảng 3.4 Đánh giá chất lƣợng mô sẹo môi trƣờng nhân mô sẹo 34 Bảng 3.5 Tỷ lệ tái sinh môi trƣờng TS1 36 Bảng 3.6 Tỷ lệ tái sinh môi trƣờng TS2 37 Bảng... nhiễm (%) = số hạt bị nhiễm/tổng số hạt cấy × 100 - Tỷ lệ hạt tạo mô sẹo (%) = Tổng số mô sẹo/ tổng số mẫu nuôi cấy × 100 - Tỷ lệ mô sẹo tái sinh (%) = Tổng số mô tái sinh cây/ tổng số mô sẹo nuôi... cấy mô đột biến thực nghiệm… Xuất phát từ sở lý luận thực tiễn trên, tiến hành nghiên cứu đề tài: Đánh giá khả tạo mô sẹo tái sinh số giống lúa Nhật Bản , nhằm phục vụ nghiên cứu giống lúa Mục