Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội LỜI CẢM ƠN Em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS Phương Phú Công, người trực tiếp, tận tình hướng dẫn, bảo, giúp đỡ em suốt trình thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn thầy cô tổ Vi sinh vật học toàn thể thầy cô khoa Sinh – KTNN trường Đại học Sư Phạm Hà Nội tạo điều kiện giúp đỡ em suốt trình học tập nghiên cứu Cuối em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè động viên giúp đỡ em suốt thời gian qua Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 05 năm 2013 Sinh viên Nguyễn Thị Dung SVTH: Nguyễn Thị Dung K35B – SP Sinh Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết thu khoá luận trung thực, chưa công bố công trình khoa học Nếu sai xin hoàn toàn chịu trách nhiệm Hà Nội, tháng 05 năm 2013 Sinh viên Nguyễn Thị Dung SVTH: Nguyễn Thị Dung K35B – SP Sinh Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần lignocellulose rác thải phế phụ phẩm nông nghiệp phổ biến Bảng 3.1 Khả sinh cellulase chủng nấm mốc M4V nguồn chất khác 26 Bảng 3.2 Ảnh hưởng phối trộn phế phụ phẩm nông nghiệp đến khả sinh cellulase chủng nấm mốc M4V 29 Bảng 3.3 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh cellulase 30 Bảng 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh cellulase 31 Bảng 3.5 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh cellulase 33 Bảng 3.6 Hàm lượng đường tổng số mẫu chất trước sau lên men 35 Bảng 3.7 Hàm lượng protein mẫu chất trước sau lên men 37 Bảng 3.8 Kết phân tích hoạt tính cellulase từ mẫu sau lên men (UI/g) 38 SVTH: Nguyễn Thị Dung K35B – SP Sinh Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Công thức hoá học cellulose Hình 1.2 Quá trình phân giải cellulose enzyme cellulase Hình 3.1 Hoạt tính chủng M4V nguồn chất vỏ trấu, vỏ lạc lõi ngô 27 Hình 3.2 Hoạt tính chủng M4V tỉ lệ phối trộn 4:4:2 4:3:3 29 Hình 3.3 Hoạt tính chủng M4V thời gian 36 48 31 Hình 3.4 Hoạt tính chủng M4V 320C 440C 32 Hình 3.5 Hoạt tính chủng M4V nguồn nitơ pepton NaNO 33 SVTH: Nguyễn Thị Dung K35B – SP Sinh Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT Cs : Cộng CMC : Cacboxyl methyl cellulose CMC – ase SVTH: Nguyễn Thị Dung : Cacboxylmethylcellulase K35B – SP Sinh Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài 2 Mục tiêu đề tài Nội dung đề tài Ý nghĩa đề tài CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cellulose phân bố cellulose thực vật 1.1.1 Cellulose 1.1.2 Sự phân bố cellulose thực vật 1.2 Cơ chế phân giải cellulose enzyme cellulase 1.2.1 Hệ thống cellulase 1.2.2 Cơ chế phân giải cellulose enzyme cellulase 1.3 Ứng dụng cellulase 1.3.1 Cellulase với công nghiệp thực phẩm 1.3.2 Trong công nghiệp sản xuất giấy bột giấy 10 1.3.3 Trong công nghiệp chế biến thực phẩm 10 1.3.4 Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu 11 1.3.5 Trong công nghệ xử lí rác thải sản xuất phân bón vi sinh 12 1.3.6 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi 12 1.4 Các nhóm vi sinh vật tham gia phân giải cellulose 13 1.4.1 Vi khuẩn 13 1.4.2 Xạ khuẩn loài Actimomyces (Streptomyces) 14 1.4.3 Nấm sợi 14 1.5 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp cellulase vi sinh vật 14 1.5.1 Giống vi sinh vật 14 SVTH: Nguyễn Thị Dung K35B – SP Sinh Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 1.5.2 Nguồn dinh dưỡng 15 1.5.2.1 Ảnh hưởng nguồn cacbon 15 1.5.2.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ 15 1.5.3 Điều kiện nuôi cấy 16 1.5.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ 16 1.5.3.2 Ảnh hưởng độ ẩm 16 1.5.3.3 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy 17 CHƢƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Nguyên liệu vi sinh vật 18 2.1.1.Chủng vi sinh vật 18 2.1.2 Nguyên liệu 18 2.1.3 Hóa chất – thiết bị 18 2.1.4 Môi trường 18 2.2 Phương pháp nghiên cứu 20 2.2.1 Phương pháp vi sinh 20 2.2.1.1 Thu thập mẫu 20 2.2.1.2 Chuẩn bị môi trường phân lập bảo quản 20 2.2.1.3 Hoạt hoá vi sinh vật 20 2.2.2 Phương pháp hoá sinh 21 2.2.2.1 Nuôi cấy chủng nấm mốc để thử hoạt tính 21 2.2.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính carboxymethylcellulase 22 2.2.2.3 Phương pháp xác định protein tổng số 24 2.2.2.4 Phương pháp xác định lượng đường tổng số 25 2.2.3 Phương pháp xử lí số liệu 26 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 27 3.1 Khảo sát khả sinh cellulase chủng M4V phế phụ phẩm nông nghiệp 27 SVTH: Nguyễn Thị Dung K35B – SP Sinh Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 3.2 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến khả sinh cellulase phế phụ phẩm nông nghiệp chủng M4V 29 3.2.1 Ảnh hưởng phối trộn phế phụ phẩm nông nghiệp đến khả sinh cellulase chủng nấm mốc M4V 29 3.2.2 Ảnh hưởng điều kiện môi trường đến khả sinh cellulase phế phụ phẩm nông nghiệp chủng M4V 31 3.2.2.1 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh cellulase 31 3.2.2.2 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến khả sinh cellulase 32 3.2.2.3 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh cellulase 33 3.3 Nâng cao chất lượng phế phụ phẩm nông nghiệp thông qua sử dụng chủng nấm mốc M4V để ứng dụng chăn nuôi 35 3.3.1 Kiểm tra hàm lượng đường tổng số môi trường trước sau lên men chủng nấm mốc M4V 35 3.3.2 Kiểm tra hàm lượng protein môi trường trước sau lên men chủng nấm mốc M4V 37 3.3.3 Phân tích hoạt tính cellulase mẫu nghiên cứu 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 SVTH: Nguyễn Thị Dung K35B – SP Sinh Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Trong thời gian gần chăn nuôi gặp phải khó khăn với hàng loạt vấn đề lên như: nhiều dịch bệnh cúm gia cầm tái phát giá thức ăn chăn nuôi cao,… Chính vậy, ngành chăn nuôi nước ta đứng trước thách thức làm để có nông nghiệp bền vững ổn định thời kì kinh tế hội nhập, phát triển nhanh, đổi nhiều cạnh tranh Mặt khác, nông nghiệp phát triển Việt Nam vấn đề đặt đầu cho phế phụ phẩm nông nghiệp sau thu hoạch rơm rạ, vỏ trấu, vỏ lạc…Nguồn phế phụ phẩm nông nghiệp thải trình sản xuất chế biến nông sản nước ta ước tính khoảng 50 triệu năm Lượng phế thải lớn hợp chất hữu giàu cacbon chất khoáng đa vi lượng Đây nguồn nguyên liệu có giá trị cao cho sản xuất dạng chế phẩm sinh học phân hữu sinh học phục vụ sản xuất nông nghiệp đặc biệt lĩnh vực chăn nuôi Do vậy, cần phải có phương pháp, nghiên cứu khả thi hiệu để tận dụng nguồn phế phẩm nông nghiệp dồi [26] Enzyme cellulase phức hệ enzyme có tác dụng thủy phân cellulose, chúng tổng hợp chủ yếu nhờ vi sinh vật nấm mốc có hoạt tính phân giải cellulose cao Aspegillus, Mucor, Tricoderma…Cellulase phức hệ enzyme quan trọng ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực Cellulase sử dụng với mục đích : Dùng cellulase trực tiếp phân giải phế thải công nghiệp thực phẩm, phế thải nông nghiệp bổ sung vào thức ăn gia súc vào công nghệ môi trường ; Thủy phân cellulase tạo chất lên men để thu sản SVTH: Nguyễn Thị Dung K35B – SP Sinh Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội phẩm cuối khác Cellulase đã, ngày sử dụng nhiều để bổ sung vào thức ăn cho vật nuôi [12] Từ lâu trước, người biết đến tồn chủng nấm mốc biết ứng dụng chúng vào nhiều lĩnh vực công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp dược phẩm, công nghệ môi trường, nông nghiệp…Trên giới nước có nhiều nghiên cứu cellulase ứng dụng chăn nuôi : Chu Thanh Bình Cs (2012) ứng dụng chủng nấm men chế biến bãi thải hoa giàu cellulose làm thức ăn gia súc ; Nguyễn Lân Dũng (1991) lên men xốp sắn cách sử dụng Aspergillus hennebergi niger sản phẩm dùng làm thức ăn cho bò; Phương Phú Công (2008) Tuyển chọn ứng dụng số chủng vi sinh vật có khả lên men xylan phế phụ phẩm nông nghiệp để thu xylanase phục vụ cho chăn nuôi… thu kết cho nhiều triển vọng Xuất phát từ yều cầu cấp thiết chọn đề tài “ Nghiên cứu tiềm ứng dụng chủng nấm mốc M4V có khả phân giải cellulose phế phụ phẩm nông nghiệp để thu cellulase phục vụ chăn nuôi” Mục tiêu đề tài Nghiên cứu tiềm ứng dụng chủng nấm mốc M4V việc phân giải cellulose phế phụ phẩm nông nghiệp để thu cellulase phục vụ chăn nuôi Nội dung đề tài 3.1 Tuyển chọn nghiên cứu chủng nấm mốc M4V có khả sinh cellulase phế phụ phẩm nông nghiệp 3.2 Bước đầu đánh giá sản phẩm lên men từ chủng nấm mốc M4V để bổ sung vào thức ăn làm tăng suất vật nuôi SVTH: Nguyễn Thị Dung 10 K35B – SP Sinh Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội M4V nâng cao chất lượng phế phụ phẩm nông nghiệp đồng thời tận dụng phế phụ phẩm để sản xuất enzyme nâng cao giá trị phế phụ phẩm nông nghiệp 3.2 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy ảnh hƣởng đến khả sinh cellulase phế phụ phẩm nông nghiệp chủng M4V 3.2.1 Ảnh hưởng phối trộn phế phụ phẩm nông nghiệp đến khả sinh cellulase chủng nấm mốc M4V Do loại phế phụ phẩm nông nghiệp có hàm lượng khoáng khác loại có ưu điểm riêng lõi ngô có độ xốp cao, vỏ lạc vỏ trấu có mùi thơm Với ưu điểm khác đó, để nâng cao chất lượng nguồn chất chúng tối tiến hành phối trộn phế phụ phẩm theo nhiều tỉ lệ khác Dựa vào nghiên cứu trước chúng tối tiến hành nuôi cấy chủng nấm mốc M4V môi trường rắn thích hợp với nguồn cacbon phối trộn vỏ trấu, vỏ lạc, lõi ngô theo tỉ lệ khác 4:3:3, 4:4:2, 6:2:2, 6:3:1 Sử dụng nguồn dinh dưỡng khoáng môi trường Czapek- Dox thích hợp thời gian ngày, sau lấy dịch nuôi cấy, đem li tâm loại bỏ sinh khối Xác định hoạt tính cellulase dịch nuôi phương pháp khuếch tán môi trường thạch (William, 1983) Kết thể bảng 3.2 SVTH: Nguyễn Thị Dung 37 K35B – SP Sinh Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội Bảng 3.2 Ảnh hƣởng phối trộn phế phụ phẩm nông nghiệp đến khả sinh cellulase chủng nấm mốc M4V Nguồn cacbon Hoạt tính cellulase chủng M4V (D-d) cm Tỉ lệ: vỏ trấu : vỏ lạc : lõi ngô 2.8 4:3:3 Tỉ lệ: vỏ trấu : vỏ lạc : lõi ngô 3.0 4:4:2 Tỉ lệ: vỏ trấu : vỏ lạc : lõi ngô 1.4 6:2:2 Tỉ lệ: vỏ trấu : vỏ lạc : lõi ngô 1.8 6:3:1 Tỉ lệ 4:4:2 Tỉ lệ 4:3:3 Hình 3.2 Hoạt tính chủng M4V tỉ lệ phối trộn 4:4:2 4:3:3 Kết nghiên cứu cho thấy nguồn chất phối trộn theo tỉ lệ 4:4:2 (vỏ trấu: vỏ lạc: lõi ngô) cho hoạt tính mạnh với đường kính phân SVTH: Nguyễn Thị Dung 38 K35B – SP Sinh Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội giải (D-d) – 3,0 cm Do chọn tỉ lệ để tiến hành nghiên cứu Như vậy, chủng M4V sinh cellulase với hoạt tính cao chất phế phụ phẩm nông nghiệp, nguồn nguyên liệu chứa cellulase rẻ tiền, dễ kiếm hầu hết vùng nông thôn Việt Nam 3.2.2 Ảnh hưởng điều kiện môi trường đến khả sinh cellulase phế phụ phẩm nông nghiệp chủng M4V Từ nghiên cứu ảnh hưởng phối trộn phế phụ phẩm nông nghiệp tìm tỉ lệ phối trộn thích hợp cho sinh cellulase chủng M4V vỏ trấu : vỏ lạc : lõi ngô Để thu lượng cellulase nhiều ổn định hơn, tiến hành nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến khả lên men chủng M4V chất vỏ trấu : vỏ lạc : lõi ngô theo tỉ lệ 4: 4: 3.2.2.1 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh cellulase Thời gian lên men bề mặt nấm mốc khoảng 36-60 Tuỳ thuộc vào đặc tính sinh lí giống mốc, thời gian tạo enzyme thời điểm khác Để xác định thời gian tạo lượng enzyme cellulase nhiều từ chủng M4V xác định hoạt tính cellulase thời điểm lên men Kết xác định sau: Bảng 3.3 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh cellulase Chủng VSV M4V Hoạt tính cellulase (D-d) cm 12 24 36 48 0.9 1.7 2.3 1.4 SVTH: Nguyễn Thị Dung 39 K35B – SP Sinh Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 36 48 Hình 3.3 Hoạt tính chủng M4V thời gian 36 48 Qua bảng số liệu bảng cho thấy thời gian ảnh hưởng đến khả sinh cellulase chủng M4V Thời gian tạo enzyme nhiều 36 Nếu kéo dài thời gian lên 48 hoạt tính enzyme giảm ứng với thời điểm xuất bào tử Kết nghiên cứu phù hợp với công bố tác Võ Thị Hạnh Cs, Lương Đức Phẩm lên men bề mặt chủng mốc Asp Awamori để sản xuất enzyme nhiều vào thời điểm khoảng 36 – 40 [7], [13] 3.2.2.2 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến khả sinh cellulase Chúng tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ ban đầu đến khả sinh cellulase chủng M4V điều kiện nhiệt độ khác Sau 36 lên men, xác định hoạt tính enzyme cellulase Kết trình bày bảng 3.4 sau: Bảng 3.4 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến khả sinh cellulase Chủng Hoạt tính cellulase (D-d) cm VSV 260C 320C 380C 440C 500C M4V 2.6 2.8 2.3 SVTH: Nguyễn Thị Dung 40 K35B – SP Sinh Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội Nhiệt độ 320C Nhiệt độ 440C Hình 3.4 Hoạt tính chủng M4V 320C 440C Kết nghiên cứu cho thấy nhiệt độ từ 30-350C khả sinh cellulase ổn định Tuy nhiên điều kiện nhiệt độ 320C khả sinh cellulase cao với đường kính phân giải đạt 2,8 cm Khi nhiệt độ cao thấp ảnh hưởng đến khả lên men rắn chủng nấm mốc M4V Kết nghiên cứu phù hợp với công bố khác Lê Hồng Mai (1989), Lê Thị Hồng Nga (2005) cho nấm mốc có khả sinh trưởng phát triển tốt dải nhiệt từ 30 – 350C dải nhiệt chúng cho sinh khối enzyme lớn [11], [12] 3.2.2.3 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh cellulase Để phân giải polysaccarit khó bền vững cellulose, vi sinh vật cần phải tạo lượng lớn enzyme cellulase, chúng cần lượng lớn nitơ, chí có nhiều chủng nấm mốc cần tới 60% nitơ tổng số cho việc sản xuất enzyme ngoại bào Do đó, để thu lượng cellulase lớn SVTH: Nguyễn Thị Dung 41 K35B – SP Sinh Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội từ chủng M4V tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh cellulase chủng nấm mốc Với chất phối trộn theo tỉ lên vỏ trấu : vỏ lạc : lõi ngô, nguồn khoáng chất có thay đổi nguồn nitơ Sau 36 lên men chủng M4V 320C tiến hành thử hoạt tính cellulase Kết thu được thể bảng sau Bảng 3.5 Ảnh hƣởng nguồn nitơ đến khả sinh cellulase Chủng VSV Hoạt tính cellulase (D-d) cm Pepton NaNO3 (NH4)2SO4 NH4Cl 2.2 2.0 1.7 1.8 M4V Pepton NaNO3 Hình 3.5 Hoạt tính chủng M4V nguồn nitơ pepton NaNO3 Kết cho thấy khả sinh cellulase chủng M4V sử dụng đa dạng nguồn nitơ Nguồn nitơ vô có gốc nitrat NaNO có hoạt tính cellulase cao so với NH4Cl; (NH4)2SO4 Kết nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu Lương Đức Phẩm cho nitrat nguồn nitơ thích hợp để tổng hợp enzyme ngoại bào nhiều loài nấm SVTH: Nguyễn Thị Dung 42 K35B – SP Sinh Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội chi Aspergillus; Fusarium; Trichoderma [13] Trên nguồn nitơ hữu pepton cho hoạt tính cellulase cao Tuy nhiên, trình sản xuất chế phẩm enzyme phục vụ cho chăn nuôi việc sử dụng nitơ hữu với chi phí cao dẫn tới hiệu kinh tế, giá thành sản xuất chế phẩm cao Như vậy, có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp cellulase chủng nấm mốc M4V Sau tiến hành nghiên cứu tìm điều kiện nuôi cấy tốt cho trình sinh tống hợp cellulase chủng nấm mốc M4V sau: Nguồn chất thích hợp vỏ trấu phối trộn nguồn cellulose tự nhiên theo tỉ lệ vỏ trấu : vỏ lạc : lõi ngô tốt cho sinh trưởng tổng hợp enzyme cellulase chủng nấm mốc M4V; Nhiệt độ thích hợp 320C; Thời gian lên men rắn 36 nguồn nitơ hữu thích hợp cho trình lên men pepton 3.3 Nâng cao chất lƣợng phế phụ phẩm nông nghiệp thông qua sử dụng chủng nấm mốc M4V để ứng dụng chăn nuôi 3.3.1 Kiểm tra hàm lượng đường tổng số môi trường trước sau lên men chủng nấm mốc M4V Với đất nước nông nghiệp Việt Nam sản phẩm vỏ trấu, vỏ lạc lõi ngô vật phẩm có khối lượng lớn lại giá trị cao đời sống người ngành chăn nuôi Đây lãng phí vô không tìm biện pháp xử lí đó, biến nguồn nguyên liệu giá trị sử dụng thành nguồn nguyên liệu có giá trị cao, hay nói cách khác phải nâng cao chất lượng phế phụ phẩm nông nghiệp cách nâng cao giá trị dinh dưỡng chúng SVTH: Nguyễn Thị Dung 43 K35B – SP Sinh Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội Để nâng cao chất lượng phế phụ phẩm, tiến hành nghiên cứu theo đường sử dụng chủng nấm mốc M4V Bằng phương pháp lên men rắn điều kiện lên men tối ưu chủng M4V: thời gian lên men 36 giờ, nhiệt độ 320C, độ ẩm 70%, nguồn nitơ NaNO3 nguồn cacbon khác vỏ trấu, vỏ lạc, lõi ngô phối trộn phế phụ phẩm theo tỉ lệ vỏ trấu : vỏ lạc : lõi ngô; vỏ trấu : vỏ lạc : lõi ngô Sau tiến hành lên men điều kiện thích hợp, tiến hành phân tích hàm lượng đường tổng số môi trường lên men Kết đem so sánh với giá trị tương ứng môi trường trước lên men chủng nấm mốc M4V Toàn trình thí nghiệm phân tích tiến hành phòng thí nghiệm viện Công nghệ Thực phẩm Hà Nội Dưới xin trình bày kết phân tích thu bảng 3.6 Bảng 3.6 Hàm lƣợng đƣờng tổng số mẫu chất trƣớc sau lên men Mẫu trước Hàm lượng Mẫu sau Hàm lượng lên men đường tổng số lên men đường tổng số (mg/g) (mg/g) Vỏ lạc 1,20 Vỏ lạc 2,4 Lõi ngô 3,23 Lõi ngô 5,23 Vỏ trấu 2,16 Vỏ trấu 2,2 4: 3: 2,17 4: 3: 2,0 4:4:2 1,29 4:4:2 3,2 Như vậy, qua kết phân tích thể bảng 3.6 ta nhận thấy hàm lượng đường tổng số nguồn chất đơn khác SVTH: Nguyễn Thị Dung 44 K35B – SP Sinh Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội nguồn cacbon có phối trộn phế phụ phẩm theo tỉ lên khác sau lên men có tăng lên rõ rệt so với trước lên men Nói cách khác, hàm lượng chất khoáng chất tăng lên thông qua sử dụng phương pháp lên men rắn chủng nấm mốc M4V 3.3.2 Kiểm tra hàm lượng protein môi trường trước sau lên men chủng nấm mốc M4V Mẫu lên men tiến hành phân tích hàm lượng protein tổng số dựa phương pháp Bradford (1976) Quá trình tiến hành phòng thí nghiệm viện Công nghệ Thực phẩm Hà Nội thu kết sau: Bảng 3.7 Hàm lƣợng protein mẫu chất trƣớc sau lên men Mẫu trước Lượng protein Mẫu sau Lượng protein lên men tổng số lên men tổng số (mg/g) (mg/g) Vỏ lạc 45,12 Vỏ lạc 72,53 Lõi ngô 24,23 Lõi ngô 38,21 Vỏ trấu 13,12 Vỏ trấu 27,34 4: 3: 32,11 4: 3: 62,23 4:4:2 27,16 4:4:2 44,50 Qua kết phân tích thể bảng 3.7 nhận thấy rằng: Sau tiến hành lên men rắn chủng nấm mốc M4V nguồn cacbon khác vỏ trấu, vỏ lạc, lõi ngô phối trộn phế phụ phẩm theo tỉ lệ vỏ trấu : vỏ lạc : lõi ngô; vỏ trấu : vỏ lạc : lõi ngô làm tăng hàm lượng protein nguồn phế phẩm lên rõ rệt so với trước lên men SVTH: Nguyễn Thị Dung 45 K35B – SP Sinh Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 3.3.3 Phân tích hoạt tính cellulase mẫu nghiên cứu Sau phân tích hàm lượng đường tổng số hàm lượng protein, tiến hành phân tích hoạt tính cellulase mẫu nghiên cứu cách sử dụng phương pháp Miller Kết phân tích thể bảng 3.8 sau: Bảng 3.8 Kết phân tích hoạt tính cellulase từ mẫu sau lên men (UI/g) Mẫu sau lên men Hoạt tính cellulase IU/g Vỏ lạc 6,18 Lõi ngô 8,89 Vỏ trấu 9,98 4: 3: 12,23 4:4:2 8, 21 Qua kết phân tích thể bảng 3.8 dễ dàng nhận thấy rằng, nâng cao hàm lượng đường tổng số hàm lượng protein môi trường lên men có enzyme với hoạt tính cao Hay nói cách khác, chủng M4V có khả sinh tổng hợp enzyme với hoạt tính cao Điều cho phép nghĩ tới khả sử dụng phế phụ phẩm nông nghiệp cách lên men rắn chủng M4V để thu cellulase bổ sung vào thức ăn chăn nuôi cho gà, vịt,… Như vậy, qua kết phân tích chứng tỏ rằng, hoàn toàn nâng cao chất lượng phế phụ phẩm nông nghiệp thông qua việc sử dụng chủng nấm mốc M4V phương pháp lên men rắn Ngoài ra, kết mở khả ứng dụng to lớn chủng nấm mốc M4V lĩnh vực mà đặc biệt nhấn mạnh đến lĩnh vực chăn nuôi mà cụ thể sản xuất thức ăn chăn nuôi SVTH: Nguyễn Thị Dung 46 K35B – SP Sinh Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN 1.1 Đã xác định nguồn phế phụ phẩm nông nghiệp có khả sinh tổng hợp cellulase tốt vỏ trấu Đồng thời bước đầu tiến hành phối trộn phế phụ phẩm theo tỉ lệ khác nhằm làm tăng khả sinh enzyme tìm tỉ lên phối trộn tốt vỏ trấu : vỏ lạc : lõi ngô Đây nguồn chất tự nhiên thích hợp cho trình sinh tổng hợp cellulase chủng nấm mốc M4V 1.2 Từ tỉ lệ phối trộn thích hợp vỏ trấu : vỏ lạc : lõi ngô xác định điều kiện tối ưu khả lên men rắn chủng nấm mốc M4V là:  Nhiệt độ thích hợp 320C  Thời gian lên men rắn tốt 36  Nguồn nitơ thích hợp cho trình lên men pepton 1.3 Bước đầu nâng cao giá trị dinh dưỡng phế phụ phẩm nông nghiệp hàm lượng đường tổng số, hàm lượng protein thông qua sử dụng chủng nấm mốc M4V phương pháp lên men rắn Không nâng cao giá trị dinh dưỡng mà chế phẩm lên men có hàm lượng enzyme cellulase nồng độ thấp Điều mở khả ứng dụng chủng nấm mốc việc nâng cao chất lượng giá trị nguồn phế phụ phẩm nông nghiệp Việt Nam để ứng dụng sản xuất thức ăn chăn nuôi KIẾN NGHỊ 2.1 Xác định khả sinh độc tố chủng M4V môi trường lên men để định hướng đến khả ứng dụng 2.2 Có nghiên cứu sâu để tạo chế phẩm cellulase từ chủng nấm mốc M4V để ứng dụng chăn nuôi SVTH: Nguyễn Thị Dung 47 K35B – SP Sinh Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Chu Thị Thanh Bình, Nguyễn Lân Dũng, Lương Thùy Dương (1999), Phân lập, tuyển chọn nghiên cứu chủng nấm men có khả phân giải cellulose nhằm ứng dụng xử lí bã thải hoa làm thức ăn chăn nuôi, Trung tâm Công nghệ sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội [2] Phương Phú Công (2007), Tuyển chọn nghiên cứu ứng dụng số chủng vi sinh vật có khả lên men xylan phế phụ phẩm nông nghiệp để thu cellulase phục vụ chăn nuôi, Luận văn tiến sĩ sinh học, Đại học sư phạm Hà Nội [3] Nguyễn Lân Dũng (1976), Góp phần nghiên cứu cải tiến cấu thức ăn chăn nuôi lợn, Báo cao hội nghị khoa học, Trường Đại Học Tổng Hợp [4] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Thế Hòa, Nguyễn Anh Bảo (1991), Điều kiện sinh khối nấm sợi Aspergillus hennebergii TH 386 môi trường xốp sắn ngô, Tạp chí nông nghiệp công nghiệp thực phẩm [5] Nguyễn Thành Đạt (2007), Cơ sở sinh học vi sinh vật, NXB Đại học Sư phạm [6] Nguyễn Thành Đạt, Vương Trọng Hào (1990), Thực hành vi sinh vật, NXB giáo dục [7] Võ Thị Hạnh, Lê Thị Bích Phượng (2005), Nghiên cứu chọn lọc chủng nấm mốc có khả phân giải cellulose cao tìm môi trường, điều kiện thích hợp để sản xuất enzyme cellulase, Đề tài cấp sở Viện Sinh học nhiệt đới [8] Đặng Minh Hằng (1999), Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp cellulase số chủng vi sinh vật để xử lí rác, Báo cáo khoa học, Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, tr 333-339 SVTH: Nguyễn Thị Dung 48 K35B – SP Sinh Khóa luận tốt nghiệp [9] Trường ĐHSP Hà Nội Đỗ Thị Ngọc Huyền (2007), Sản xuất thử nghiệm thịt cà phê lên men làm nguyên liệu thức ăn chăn nuôi quy mô công nghiệp, Viện CĐNN CNSTH [10] Trịnh Đình Khá, Quyền Đình Thi, Nguyễn Sĩ Lê Thanh (2007), Tuyển chọn nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố môi trường lên khả sinh tổng hợp cellulase chủng penicillium sp DTQ-HK1, Tạp chí Công nghệ Sinh học (3), 355 – 362 [11] Lê Hồng Mai (1989), Nghiên cứu sinh tổng hợp số đặc tính cellulase a.niger VS-1 môi trường rắn, Luận văn thạc sĩ sinh học, ĐHSP TPHCM [12] Lê Thị Hồng Nga (2005), Nghiên cứu tổng hợp cảm ứng pectinase cellulase số chủng nấm mốc, Luận văn thạc sĩ sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên TP Hồ Chí Minh, tr 50 – 65 [13] Lương Đức Phẩm (2004), Công nghệ sinh học vi sinh vật, NXB Nông Nghiệp [14] Đỗ Hữu Phương (2004), Đặc san khoa học kỹ thuật thức ăn chăn nuôi, số 3/2004 [15] Nguyễn Xuân Thành, Lê Văn Hưng, Phạm Văn Toàn (2003), Công nghệ vi sinh vật sản xuất nông nghiệp xử lý môi trường, NXB Nông Nghiệp [16] Nguyễn Lân Dũng (1994), Nghiên cứu khả phân giải cellulose số chủng vi sinh vật phân lập Việt Nam, Báo cáo Hội nghị khoa học ủy ban Khoa học kĩ thuật nông nghiệp [17] Nguyễn Tùng Lâm (2012), Nghiên cứu số yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả sinh cellulase chủng nấm mốc M4V phương pháp lên men rắn, Khóa luận tốt nghiệp Đại học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội SVTH: Nguyễn Thị Dung 49 K35B – SP Sinh Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội Tài liệu nƣớc [18] Maren A Klich (2002), Identification of Common Aspergillus Species, Published by the Centralbureau voor Schimmelcultues, Utrecht, The Nethrlands, p 107 [19] Miller G L (1959), Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar, Anal Chem 13(3), p 426-428 [20] Raper K B, Fennell D L (1965), the Gennus Aspergillus, Baltimore U S A William and Wilkinsl, Preston street Baltimore, Md 21202 U S A, p 570 [21] Robert A Samson, Jonh I Pitt (2000), Integration of modern taxonomic methods for Penicillium and Aspergillus classification, p 83-113 [22] Bradford M M (1976), A Rapid and sensitive for the quantitation of microgram quantitites of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal Biochem, 72 p.248-254 [23] Michel D, Gilles A K, Hamilton K J, Rebers A P, Smith F (1956), Clorimetric method for detemination of sugars and related substances, Anal Chem, 28 (3), p 350-356 Tài liệu từ website [24] www Agroviet.gov.vn [25] www Sinhhocvietnam.com [26] www Sokhcn.angiang.gov.vn [27] www Tainguyenso.vnu.edu.vn [28] www Zetaboards.com [29] http://sci.waikato.ac.nz/farm/content/plantstructure.html [30] http://s4.zetaboards.com/BioFood_Tech/topic/9374593/1/ [31] community.h2vn.com/index.php topic=501.50;wap2 [32] luanvan.co/ /de-tai-ung-dung-enzyme-amylase-trong-cong-nghiepthuc [33] SVTH: Nguyễn Thị Dung docs.4share.vn/Resources/Flashs/1/45326.swf 50 K35B – SP Sinh Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Dung Trường ĐHSP Hà Nội K35B – SP Sinh [...]... luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 4 Ý nghĩa của đề tài 4.1 Ý nghĩa lý luận Nghiên cứu nhằm đi sâu tìm hiểu tiềm năng ứng dụng của chủng nấm mốc M4V có khả năng phân giải cellulose trên phế phụ phẩm nông nghiệp 4.2 Ý nghĩa thực tiễn Bước đầu nghiên cứu nâng cao chất lượng phế phụ phẩm trong ngành nông nghiệp Việt Nam để phục vụ chăn nuôi SVTH: Nguyễn Thị Dung 11 K35B – SP Sinh Khóa luận tốt nghiệp. .. luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 Vỏ trấu Vỏ lạc Lõi ngô Hình 3.1 Hoạt tính của chủng M4V trên nguồn cơ chất vỏ trấu, vỏ lạc và lõi ngô Kết quả nghiên cứu ở hình và bảng 3.1 cho thấy, chủng nấm mốc M4V có khả năng sinh cellulase cao trên các phế phụ phẩm nông nghiệp Trong đó, vỏ trấu là cơ chất thích hợp để sinh cellulase từ chủng nấm mốc M4V Kết quả này cũng giống như các kết quả nghiên cứu trước... phụ phẩm nông nghiệp Nguồn cacbon có ảnh hưởng đến khả năng tạo sinh khối và sinh enzyme của nấm Nó có vai trò như một chất kích thích nấm sinh tổng hợp cellulase Do đó, tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cellulose tự nhiên đến khả năng sinh cellulase của chủng nấm M4V Chủng M4V được nuôi cấy trong môi trường rắn thích hợp với nguồn cacbon lần lượt là vỏ trấu, vỏ lạc, vỏ ngô, sử dụng nguồn... chế phân giải cellulose của enzyme cellulase Hình 1.2 Quá trình phân giải cellulose của enzyme cellulase SVTH: Nguyễn Thị Dung 16 K35B – SP Sinh Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2  Endocellulase: xúc tác quá trình cắt liên kết α-1,4- glucoside trong cellulose, lignin và α- D glucan một cách ngẫu nhiên Sản phẩm của quá trình phân giải là các cellulose phân tử nhỏ, cellobiose và glucose  Exocellulase:... nông nghiệp Nhưng người và động vật không có khả năng phân giải cellulose Nó chỉ có giá trị làm tăng tiêu hoá, nhưng với lượng lớn nó trở nên vô ích hay cản trở tiêu hoá Chế phẩm cellulase thường dùng để: Tăng chất lượng thực phẩm và thức ăn gia súc, tăng hiệu suất trích ly các chất từ nguyên liệu thực vật [31] Ứng dụng trước tiên của cellulase đối với chế biến thực phẩm là dùng nó để tăng độ hấp thu, ... thấy cellulose có thể có vai trò điều hoà hoạt động của hệ SVTH: Nguyễn Thị Dung 13 K35B – SP Sinh Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 thống tiêu hoá Vi khuẩn trong dạ cỏ của gia súc, các động vật nhai lại và động vật nguyên sinh trong ruột của mối sản xuất enzyme phân giải cellulose Nấm cũng có thể phân huỷ cellulose, vì vậy chúng có thể sử dụng cellulose làm thức ăn [24] 1.1.2 Sự phân bố cellulose. .. mọc lên thì cấy chủng đó sang môi trường thạch nghiêng rồi đánh dấu cho vào tủ ấm để nuôi, theo dõi 3 – 4 ngày Đối với những chủng không lên thì loại bỏ, chủng nào lên thì giữ lại, bảo quản trong tủ lạnh ở 0 – 40C để giữ giống dùng cho việc nghiên cứu tiếp theo 2.2.2 Phương pháp hoá sinh 2.2.2.1 Nuôi cấy chủng nấm mốc để thử hoạt tính Các chủng nấm tuyển chọn được nuôi cấy trải dày trên môi trường... sử dụng phương pháp trung bình cộng để tìm giá trị trung bình của các kết quả của các lần thí nghiệm nhắc lại Kết quả trung bình cộng thu được có độ chính xác cao hơn Do đây là các thí nghiệm đơn nên không cần phương sai SVTH: Nguyễn Thị Dung 34 K35B – SP Sinh Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát khả năng sinh cellulase của chủng M4V trên các phế phụ phẩm. .. hợp cellulase Cao ngô và cao nấm men có tác dụng nâng cao hoạt lực cellulase của vi sinh vật Tác dụng kích thích của hợp chất này do sự có mặt của các axit amin, các nhân tố khoáng và những nhân tố sinh trưởng khác [13] Ngoài nitơ và cacbon thì những nguyên tố khoáng như Fe, Mn, Bo, Mo, Cu,… cũng có ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của vi sinh vật Các nguyên tố khoáng Zn, Mn, Fe có tác dụng. .. enzyme ở nhiều chủng [13] 1.5.3 Điều kiện nuôi cấy 1.5.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ có ảnh hưởng tới sinh tổng hợp enzyme của các loài nấm khác nhau Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng của đa số nấm mốc trên môi trường rắn là 25÷400C Nhiệt độ dưới 250C hoặc trên 400C nấm mốc phát triển chậm, thời gian nuôi kéo dài giảm khả năng sinh tổng hợp enzyme [11], [12] 1.5.3.2 Ảnh hưởng của độ ẩm Trong ... tiềm ứng dụng chủng nấm mốc M4V có khả phân giải cellulose phế phụ phẩm nông nghiệp để thu cellulase phục vụ chăn nuôi Mục tiêu đề tài Nghiên cứu tiềm ứng dụng chủng nấm mốc M4V việc phân giải cellulose. .. giải cellulose phế phụ phẩm nông nghiệp để thu cellulase phục vụ chăn nuôi Nội dung đề tài 3.1 Tuyển chọn nghiên cứu chủng nấm mốc M4V có khả sinh cellulase phế phụ phẩm nông nghiệp 3.2 Bước... luận Nghiên cứu nhằm sâu tìm hiểu tiềm ứng dụng chủng nấm mốc M4V có khả phân giải cellulose phế phụ phẩm nông nghiệp 4.2 Ý nghĩa thực tiễn Bước đầu nghiên cứu nâng cao chất lượng phế phụ phẩm