TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN ĐOÀN QUỐC TỈNH XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG THUỐC KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ CÁ CHẼM (Lates calcarifer) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2012 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN ĐOÀN QUỐC TỈNH XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG THUỐC KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ CÁ CHẼM (Lates calcarifer) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGs.Ts ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH 2012 LỜI CẢM TẠ Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Đặng Thị Hoàng Oanh - Trưởng môn Sinh học Bệnh học Thủy sản- Khoa Thủy Sản Trường Đại Học Cần Thơ tận tình hướng dẫn, đóng góp nhiều ý kiến quý báu, quan tâm bảo động viên giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho suốt trình thực đề tài Xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Khoa Thủy Sản- Trường Đại Học Cần Thơ, đặc biệt thầy cô thuộc môn Sinh học Bệnh học thủy sản truyền đạt kiến thức, kinh nghiêm quý báu suốt trình em học tập nghiên cứu trường Xin chân thành cảm ơn chị Trương Quỳnh Như anh Lê Thượng Khởi quan tâm sâu sắc, hướng dẫn, đóng góp ý kiến tận tình suốt thời gian thực đề tài Xin cảm ơn bạn Huỳnh Nguyễn Xuân Nghi, Lê Hoài Như Ngọc, Lê Kim Trong , Lê Thanh Cần tận tình giúp đỡ, gắn bó, chia suốt thời gian thực đề tài i TÓM TẮT Đề tài thực nhằm xác định đặc điểm sinh hóa khả kháng thuốc kháng sinh 16 chủng vi khuẩn phân lập từ cá chẽm bệnh, nuôi Đồng Bằng Sông Cửu Long Qua kết kiểm tra cho thấy chủng vi khuẩn nghiên cứu vi khuẩn Gram dương, hình cầu, không di động, cho phản ứng catalase oxidase âm tính, vi khuẩn khả sinh H2S, nitrate âm tính vi khuẩn không lên men oxi hóa đường glucose Tất chủng không phát triển môi trường có bổ sung NaCl 6,5 %, có 11 chủng tan huyết dạng β, chủng tan huyết dạng α chủng không tan huyết Kết định danh vi khuẩn kít API 20 Strep cho thấy vi khuẩn phân lập từ cá chẽm Streptococcus iniae Streptococcus agalactiae Lập kháng sinh đồ với 12 loại kháng sinh cho thấy vi khuẩn nhạy cao với kháng sinh: Ampicilin, Amoxcillin, Cefazolin, 87,5% (14/16) chủng vi khuẩn kháng với Gentamycin Neomycin Bên cạnh kết mô học cho thấy có xâm nhập vi khuẩn mô thận Kết nghiên cứu đề tài sở cho nghiên cứu chuẩn đoán phòng trị bệnh cá chẽm ii MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ i TÓM TẮT ii DANH SÁCH BẢNG .v DANH SÁCH HÌNH vi CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.1.1 Mục tiêu đề tài 1.1.2 Nội dung nghiên cứu CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểm sinh học cá chẽm 2.1.1 Đặc điểm phân loại cá chẽm 2.1.2 Đặc điểm hình thái 2.1.3 Đặc điểm phân bố dinh dưỡng 2.1.4 Tổng quan tình hình nuôi cá chẽm 2.2 Tình hình dịch bệnh cá chẽm 2.2.1 Bệnh virus 2.2.2 Bệnh ký sinh trùng 2.2.3 Bệnh vi khuẩn 2.3 Một số nghiên cứu phương pháp lập kháng sinh đồ 11 2.4 Một số nghiên cứu vi khuẩn kháng thuốc nuôi trồng thủy sản Việt Nam 11 CHƯƠNG III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 3.1 Vật liệu nghiên cứu 14 3.2 Phương pháp nghiên cứu 14 3.2.1 Phục hồi vi khuẩn 14 3.2.2 Kiểm tra số tiêu sinh hóa 15 3.2.3 Định danh vi khuẩn kit API 20 Strep 17 3.2.4 Lập kháng sinh đồ 17 iii 3.2.5 Phương pháp mô bệnh học 19 CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21 4.1 Kết kiểm tra số tiêu .21 4.2 Kết kiểm tra kít API 20 Strep 22 4.3 Kết kiểm tra NaCl 6,5 % tan huyết 23 4.4 Kết kháng sinh đồ .25 4.5 Kết mô học 27 CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 29 5.1 Kết luận .29 5.2 Đề xuất 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO .30 PHỤ LỤC .34 Phụ lục I 34 Phụ lục II 36 Phụ lục III 37 iv DANH SÁCH BẢNG Bảng 3.1 Đường kính vòng vô trùng theo tiêu chuẩn CLSI 2011 17 Bảng 3.2 Qui trình xử lý mẫu máy tự động 18 Bảng 3.3 Quy trình nhuộm mô 19 Bảng 4.1 Kết NaCl 6,5% Tan huyết 22 v DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1 Cá Chẽm (Lates calcarifer) Hình 4.1 Kết nhuộm gram 20 Hình 4.2 Kết test O/F 20 Hình 4.3 Kết test API 20 Strep sau 21 Hình 4.4 kết quae test API 20 Strep sau 24 21 Hình 4.4 Kết NaCl 23 Hình 4.5 Đĩa tan huyết dạng β 23 Hình 4.6 Đĩa tan huyết dạng α 23 Hình 4.7 Đĩa kháng sinh đồ 24 Hình 4.8 Vi khuẩn xâm nhập mô thận cá chẽm 27 vi CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Việt Nam có vùng biển rộng chiếm diện tích 1.000.000 km2, có đường bờ biển kéo dài 3.260 km nhiều đảo nhỏ, có hệ thống sông ngòi dày đặc Đây điều kiện thuận lợi để nghề nuôi trồng thủy sản nước mặn, lợ phát triển Trong bối cảnh kinh tế tình hình nuôi cá tra cá basa Việt Nam biến động bất thường, nghề nuôi trồng thủy sản nước mặn, lợ khẳng định vị góp phần tăng đáng kể nguồn ngoại tệ cho kinh tế nước nhà Đặc biệt năm gần nghề nuôi cá chẽm (Lates calcarifer) đầu tư nghiên cứu phát triển góp phần đa dạng hóa sản phẩm thị trường, cải thiện sống người dân Theo Mai Đình Yên (1979) Nguyễn Nhật Thi (1991), nước ta, cá chẽm phân bố rộng khắp từ Móng Cái đến Cà Mau Với diện tích 445.000 mặt nước ven biển 370.000 mặt nước vùng sinh thái ngập mặn, năm qua, nhu cầu thực phẩm thủy sản xã hội ngày tăng nhanh, nghề nuôi cá chẽm nước ta có bước phát triển mạnh mẽ (Trích dẫn Huỳnh Nhật Thi, 2010) Với ưu điểm khả kháng bệnh cao, sinh trưởng nhanh, chất lượng thịt ngon, rộng muối giúp cá chẽm (Lates calcarifer) dần lên tiến hành nuôi thương phẩm nhiều địa phương nước như: Hà Tĩnh, Quảng Nam, Bà Rịa- Vũng Tàu… Tuy vậy, sản lượng hàng năm chưa đáp ứng đủ nhu cầu tiêu thụ nội địa phục vụ chương trình xuất qua thị trường Úc, châu Âu Mỹ… Trước nhu cầu thực tế lợi nhuận từ cá chẽm (Lates calcarifer) mang lại, người dân tự động mở rộng diện tích nuôi, không theo quy hoạch cụ thể, đồng thời chưa có phối hợp đồng với quan chức năng, nuôi cá mật độ cao, thiếu kinh nghiệm kỹ thuật nuôi, kết hợp với quản lý yếu tố môi trường chưa tốt điều kiện thuận lợi để dịch bệnh bùng phát Trong bệnh vi khuẩn gây thiệt hại nghiêm trọng Hiện chưa có nhiều nghiên cứu bệnh vi khuẩn cá chẽm (Lates calcarifer), cá mắc bệnh người nuôi lung túng viêc xử lý bệnh Để góp phần bổ sung kết nghiên cứu bệnh cá chẽm phổ biến thiêm kiến thức cho người nuôi đề tài “Xác định đặc điểm sinh hóa khả kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn phân lập từ cá chẽm (Lates calcarifer)” thực 1.1.1 Mục tiêu đề tài Xác định đặc điểm sinh hóa khả kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn phân lập từ cá chẽm (Lates calcarifer) 1.1.2 Nội dung nghiên cứu  Xác định đặc điểm sinh hóa vi khuẩn phân lập từ cá chẽm (Lates calcarifer)  Định danh vi khuẩn phân lập từ cá chẽm (Lates calcarifer) kít API 20 Strep  Lập kháng sinh đồ xác định khả kháng thuốc vi khuẩn phân lập từ cá chẽm (Lates calcarifer)  Tìm hiểu đặc điểm mô bệnh học cá chẽm (Lates calcarifer) bị nhiễm bệnh Nhóm beta-lactamin bao gồm kháng sinh amoxicillin, ampicillin, cefazoline, cefalexine… loại kháng sinh có phổ kháng khuẩn hẹp, chủ yếu có tác dụng vi khuẩn gram dương số vi khuẩn gram âm Do màng tế bào vi khuẩn gram âm có tỉ lệ lipit cao nên kỵ nước, nhóm betalactamin phải khuếch tán qua ống dẫn protein nằm bề mặt màng Tuy nhiên, cần lưu ý tính chất thuốc thuộc nhóm beta-lactamin dễ bị hòa tan nước thủy phân nhiệt độ cao nên để đạt hiệu sử dụng nhóm thuốc cần phải khắc phục nhược điểm Nhóm phenicol bao gồm chloramphenicol, flophenicol kháng sinh kìm khuẩn có hiệu lực diệt khuẩn vài loài, có chế tác động ức chế tổng hợp protein Ở Việt Nam, thuốc kháng sinh chloramphenicol bị nghiêm cấm sử dụng nuôi trồng thủy sản thuốc có độc tính mạnh nguyên nhân gây tượng thoái hóa tủy xương Ngoài ra, chloramphenicol loại kháng sinh có nhiều tác dụng phụ không mong như: gây suy tủy, tỉ lệ quái thai cao, gây dị ứng,… Vì tuyệt đối không sử dụng loại kháng sinh (Lê Nguyễn Diệu An, 2011) Bên cạnh flophenicol loại kháng sinh hệ nhóm phenicol có tính chloramphenicol mà khắc phục nhược điểm gây nguy hiểm đến sức khỏe người 4.5 Kết mô học Thận quan nhạy cảm với tác nhân gây bệnh quan tạo máu quan tiết chủ yếu cá Thận sau cá có cấu tạo tiểu cầu thận, ống dẫn, ống thận, mạch máu Thận quan tiết đường xâm nhập chủ yếu vi khuẩn (Trích từ Lê Thị Kim Loan, 2011) Quan sát mô bệnh học cho thấy có diện vi khuẩn xâm nhập mô thận cá chẽm (Hình 4.9) 27 Hình 4.9 Vi khuẩn xâm nhập mô thận cá chẽm Eldar Ghittino (1999) nghiên cứu mô học cá hồi vân phát vi khuẩn S iniae có mô não gây tượng viêm não cấp tính Nguyễn Hữu Thịnh ctv (2001) nghiên cứu kiểm tra mô cá bơn phát vi khuẩn não thận Tukmechi (2009), quan sát mô bệnh học cá tai tượng da beo (Astronotus Ocellatus) thấy có xâm nhập vi khuẩn S iniae mô tỳ tạng Mô gan não có hiên tượng sung huyết Qua cho thấy cá bị nhiễm bệnh S iniae gây quan thường bị công thận, tỳ tạng não Sự xâm nhập vi khuẩn làm biến đổi liên kết cấu trúc tế bào gan, thận, bị phá hủy, biến đổi cấu trúc hoại tử, xuất huyết… tổn thương gan, thận làm cho gan không chức khử độc, lọc máu, chuyển hóa protein, lipid, glucid, tiết mật.Quản cầu thận bị cấu trúc Thận bị cấu trúc không thực hiệ chức tiết chất thải trình biến dưỡng gây độc cho thể Do chất độc không loại bỏ tích lũy thể kết hợp với yếu tố khác làm cá chết 28 CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận Kết nhuộm gram cho thấy tất vi khuẩn gram (+) dạng liên cầu vi khuẩn không di động, cho phản ứng catalase âm tính, oxidase âm tính, H2S âm tính vi khuẩn khả sinh H2S, nitrate O/F âm tính Tất chủng vi khuẩn không phát triển môi trường có bổ sung 6,5% NaCl Có 11 chủng gây tan huyết dạng β, chủng gây tan huyết dạng α chủng không gây tan huyết Kết định danh kit API 20 Strep xác định chủng vi khuẩn Não vi khuẩn Streptococcus agalactiae 15 chủng vi khuẩn lại Streptococcus iniae Kết kiểm tra kháng sinh đồ cho thấy 14/16 chủng vi khuẩn kiểm tra điều kháng với Gentamycin, Neomycin, tất chủng nhạy với tất loại kháng sinh lại, kháng sinh nhạy có đường kính vô trùng cao Ampicilin, Amoxcillin, Cefazolin Quan sát mô thận cá chẽm thấy xâm nhập vi khuẩn S iniae 5.2 Đề xuất Xác định vi khuẩn phương pháp PCR Bố trí thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn S iniae với cá chẽm để xác định độc lực vi khuẩn dấu hiệu cá bị nhiễm S iniae Xác định nồng độ ức chế thiểu (MIC) kháng sinh lên vi khuẩn S iniae 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO A Tukmechi, R Hobbenaghi, H Rahmati Holasoo, and A Morvaridi, 2009 Streptococcosis in a Pet Fish, Astronotus Ocellatus: A Case Study World Academy of Science, Engineering and Technology 49 2009 Bùi Thị Huyền, 2007 Nghiên cứu thành phần ký sinh trùng ký sinh cá chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1970) nuôi Khánh Hòa Luận Văn Đại Học Khoa Nuôi Trồng Thủy Sản, Trường Đại Học Nha Trang Bùi Thị Khuyên, 2006 Tìm hiểu thành phần ký sinh trùng kí sinh cá chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1970) Khánh Hòa Luận Văn Đại Học Khoa Nuôi Trồng Thủy Sản, Trường Đại Học Nha Trang Luận Văn Đại Học Trường Đại Học Vinh Nghệ An Bromage, E S, A Thomas, L Owens, 1999 Streptococcus iniae, a bacterial infection in Barramundi Lates calcarifer Dis Aqua Org, Vol 36: 177-181 Bromage, E S., L Owens, 2002 Infection of barramundi Lates calcarifer with Streptococcus iniae: effects of different routes of exposure Vol 52: 199–205, 2002 Đặng Thị Hoàng Oanh, 2011 Nguyên lý kỹ thuật chẩn đoán bệnh thủy sản Nhà xuất nông nghiệp 148 trang Đặng Thị Hoàng Oanh Nguyễn Thanh Phương, 2002 Phương pháp chuẩn đoán bệnh vi khuẩn virus tôm nuôi Khoa Thủy Sản Trường Đại Học Cần Thơ Đỗ Thị Hòa, 2005 Một số phương pháp dung nghiên cứu bệnh học thủy sản Đại Học Nha Trang Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội, 2004 Đại cương bệnh thủy sản Trang 111, 121, 124, 195 Nhà xuất Nông Nghiệp 10 Đỗ Thị Hòa, Trần Vĩ Hích, Nguyễn Thị Thùy Giang, Phan Văn Út, Nguyễn Thị Nguyệt Huệ, 2008 Các loại bệnh thường gặp biển nuôi Khánh Hòa Tạp chí Khoa học Công nghệ Thủy sản, số 02, Trường Đại học Nha Trang, trang 16 - 24 11 Eldar & Ghittino, 1999 Lactococcus garvieae and Streptococcus iniae infections in rainbow trout Oncorhynchus mykiss: similar, but different diseases Vol 36: 227-231.1999 30 12 Erfanmanesh, M., Soltani, E Pirali, S Mohammadian, and A Taherimirghaed, 2011 Genetic Characterization of Streptococcus iniae in Diseased Farmed Rainbow Trout (Onchorhynchus mykiss) in Iran The Scientific World Journal Volume 2012, ID 594073, pages doi:10.1100/2012/594073 13 Gerald B Pier’ and Stewart H Madin, 1976 Streptococcus iniae sp nov., A Beta-Hemolytic Streptococcus Isolated from an Amazon Freshwater Dolphin, Inia geoffrensis Vol 26, No 14 H T Nguyen, K Kanai and K Yoshikoshi, 2001 Immunohistochemical examination of experimental Streptococcus iniae infection in Japanese flounder Paralichthys olivaceus Fish Pathology Vol No.v 36(3) p 169178 15 Huỳnh Chí Thanh, 2007 Xác định đặc điểm sinh hóa bước đầu thử nghiệm điều trị bệnh vi khuẩn Edwarsiella ictaluri gây bệnh cá tra (Pangasius hypophthalmus) kháng sinh đồ Luận Văn Đại Học Khoa Thủy Sản Trường Đại Học Cần Thơ 16 Huỳnh Nhật Thi, 2010 Tìm hiểu bệnh lở loét cá chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1790) nuôi Khánh Hòa Luận Văn Đại Học Khoa Nuôi Trồng Thủy Sản, Trường Đại Học Nha Trang 17 Kei Yuasa , Takashi Kamaishi, Kishio Hatai, Meliya Bahnnan and Prasatporn Borisutpeth, 2008 Two Cases of Streptococcal Infections of Cultured Tilapia in Asia 18 Kumaran S., B Deivasigamani, K M Alagappan, M Sakthivel S Guru Prasad 2010 Isolation and characterization of Pseudomonas sp KUMS3 from Asian sea bass (Lates calcarifer) with fin rot World Journal of Microbiology and Biotechnology, Volume 26, Number 2, 359363 19 Lê Nguyễn Diệu An, 2011 Sự kháng thuốc vi khuẩn Flavobacterium columnare gây bệnh trắng đuôi cá tra(Pangasianodon hyphophthalmus) cá rô đồng (Anabas testudineus) Luận Văn Đại Học Khoa Thủy Sản Trường Đại Học Cần Thơ 20 Lê Thị Kim Loan, 2010 Xác định LD50 vi khuẩn Streptococcus agalactiae typ TI 016 cá điêu hồng Luận Văn Đại Học Khoa Thủy Sản Trường Đại Học Cần Thơ 31 21 Mai Đăng Nhân, 2003 Nghiên cứu thành phần giống loài kí sinh trùng ký sinh số loài cá biển nuôi Khánh Hòa Luận Văn Đại Học Khoa Nuôi Trồng Thủy Sản, Trường Đại Học Nha Trang 22 Naraid Suanyuk, Nirut Sukkasame, Nopparat Tanmark, Terutoyo Yoshida , Toshiaki Itami, Ronald L Thune, Chutima Tantikitti, and Kidchakan Supamattaya, 2010 Streptococcus iniae infection in cultured Asian sea bass (Lates calcarifer)and red tilapia (Oreochromis sp.) in southern Thailand Songklanakarin J Sci Technol.32 (4), 341-348, Jul Aug 2010 23 Nawawi, R A., J Baiano and A C Barnes, 2008 Genetic variability amongst Streptococcus iniae isolates from Australia Journal of Fish Diseases 2008, 31, 305–309 24 Ngô Thu Hiền, 2005 Tìm hiểu thành phần ký sinh trùng cá hồng bạc (Lutianus argentimaculatus, Froskal, 1775) cá chẽm (Lates calcarifer) giống Nha Trang, Khánh Hòa Luận Văn Đại Học Khoa Nuôi Trồng Thủy Sản, Trường Đại Học Nha Trang 25 Nguyễn Thị Thoa, 2011 Độc lực thành phần Protein chủng vi khuẩn Vibrio alginolyticus phân lập từ cá chẽm (Lates calcarifer) bị bệnh lở loét bè nuôi thương phẩm Khánh Hòa Luận Văn Thạc Sỹ Khoa Nuôi Trồng Thủy Sản, Trường Đại Học Nha Trang 26 Nguyễn Thị Thúy Hằng, 2008 Tiêu chuẩn hóa phương pháp lập kháng sinh đồ vi khuẩn Edwarsiella ictaluri Aeromonas hydrophila khoa thủy sản Luận Văn Đại Học Khoa Thủy Sản Trường Đại Học Cần Thơ 27 Nguyễn Xuân Nguyên, 2011 Tìm hiểu số đáp ứng miễn dịch đặc hiệu cá chẽm (Lates calcarifer, Bloch) sau tiêm chủng vi khuẩn Streptococcus iniae bất hoạt formalin Luận Văn Đại Học Khoa Nuôi Trồng Thủy Sản, Trường Đại Học Nha Trang 28 Park YK, Nho SW, Shin GW, Park SB, Jang HB, Cha IS, Ha MA, Kim YR, Dalvi RS, Kang BJ, Jung TS, 2008 Antibiotic susceptibility and resistance of streptococcus iniae and streptococcus parauberis isolated from olive flounder (Paralichthys olivaceus) 29 Pourgholam R, Laluei F, Saeedi A A, Zahedi A., Safari R, Taghavi M J, Nasrollhzadeh Saravi H, Pourgholam, H, 2011 Distribution and Molecular identification of some causative agents of streptococcosis 32 isolated from farmed rainbow trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum) in Iran Iranian Journal of Fisheries Sciences 10(1) 109-122 30 Phuong, N.T., D.T.H Oanh, T.T Dung and L.X.Sinh,2005 Bacterialresistance to antimicrobials use in shrimp and fish farms in the Mekong Delta, Viet Nam 31 Surendra Prasad , 2002 Efficacy of formalin-killed Aeromonas hydrophila and Streptococcus sp Vaccine in red Tilapia Graduate school KASETSART University 32 Tiết Ngọc Trân, 2007 So sánh khả gây bệnh dòng vi khuẩn E.ictaluri cá tr cá nheo Mỹ Luận Văn Đại Học Khoa Thủy Sản Trường Đại Học Cần Thơ 33 Trần Nam Hà, Trương Thị Hoa, 2010 Nghiên cứu số bệnh phổ biến ký sinh trùng gây cá chẽm Lates calcarifer nuôi Thừa Thiên Huế biện pháp phòng trị bệnh Trường Đại học Nông Lâm Huế 34 Tukmechi, R., Hobbenaghi, H Rahmati Holasoo, and A Morvaridi, 2009 Streptococcosis in a Pet Fish, Astronotus Ocellatus: A Case Study World Academy of Sciense, Engineering and Technology 35 Vũ Thị Ngọc, 2008 Nghiên cứu số bệnh phổ biến ký sinh trùng gây cá chẽm Lates calcarifer nuôi Khánh Hoà Luận Văn Đại Học Khoa Nuôi Trồng Thủy Sản, Trường Đại Học Nha Trang 36 Vương Thị Thoa, 2009 Tìm hiểu bệnh mòn cụt thối đuôi vi khuẩn gây cá chẽm (Lates calcarifer, Bloch 1790) nuôi lồng ao Khánh Hoà Luận văn tốt nghiệp đại học 33 PHỤ LỤC Phụ lục I Pha dung dịch nhuộm gram Dung dịch Crystal violet 2g Ethanol 95% 20ml Ammonium oxalate 0,8g Nước cất 80ml Hòa tan crystal violet ethanol, hòa tan ammonium oxalate nước cất Trộn dung dịch lại để yên sau 24 sau tiến hành lọc Dung dịch Iodine 1g Potassium iodine 2g Nước cất 300ml Hòa tan potassium iodine 20ml nước cất cho them iodine vào để yên qua đêm Sau cho thêm thể tích nước lại vào Dung dịch Pha dung dịch theo tỉ lệ: 95% Ethanol, 5% acetone Dung dịch Safranin 0,25g Ethanol (95%) 10ml Nướ cất 90ml Hòa tan safranin ethanol, sau cho nước cất vào B Pha nước muối sinh lý (0.85% NaCl) NaCl 8,5g Nước cất 1000ml Hòa tan 0,85g NaCl vào 100ml nước cất 34 C Pha ống McFarland 1% H2SO4 1% BaCl2 Ống McFarland 10 1% H2SO4 (ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 0,10 1% BaCl2 (ml) 9,9 9,8 9,7 9,6 9,5 9,4 9,3 9,2 9,1 9,0 12 15 18 21 24 27 31 Mật độ vi khuẩn khoảng (108 cfu/ml) D Pha môi trường BHIA, MHA, NB,TSB theo hướng dẫn nhà sản xuất (BHIA MHA) + 1,5 % NaCl, TSB + 6,5% NaCl 35 Phụ lục II Pha formaline trung tính (NBF) Formaline 100ml NaH2PO4 4g Na2HPO4 6,5g Nước cất 900ml Pha Hematocylin Nước cất đun nóng Hematoxylin Sodium Iodate Potasscium aluminium sulfate Acid citric 2000 ml 2g 0.4 g 180 g 2g Chloral hydrate 100g Eosin-Phloxine Stock eosin (1% eosin Y nước) Stock phloxine (1% phloxine B nước) Cồn 95% Acid glacial acetic Acid alcohol Alcohol 70% 990ml Hydrochloric acid 4ml 36 100 ml 10 ml 780 ml ml Phụ lục III Bảng A Kết test số tiêu sinh hóa Nhuộm Gram +, liên cầu +, liên cầu +, liên cầu +, liên cầu Oxidase − − − − Catalase Nitrat Não 2a Não Não 2a Não 2b Di động Không Không Không Không − − − − 10 11 Não Não Não Não Não Não 1 Thận Không Không Không Không Không Không Không +, liên cầu +, liên cầu +, liên cầu +, liên cầu +, liên cầu +, liên cầu +, liên cầu − − − − − − − 12 Thận Không +, liên cầu 13 Thận Không 14 Thận 15 16 Stt Tên − − − − H2S − − − − O/F − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − +, liên cầu − − − − − Không +, liên cầu − − − − − Thận Không +, liên cầu − − − − − Thận Không +, liên cầu − − − − − 37 Bảng B Kết kháng sinh đồ STT Chủng vi khuẩn 10 11 12 13 14 15 16 Não 2a Não Não 2a Não 2b Não Não Não Não Não Não 1 Thận Thận Thận 2 Thận Thận Thận Loại kháng sinh FFC AMP AML Đường kính vòng vô trùng 27 42 40 30 15 15 36 44 43 34 45 45 35 43 44 30 17 16 30 42 43 34 40 42 37 40 40 33 40 43 34 42 45 33 38 43 33 43 44 33 42 42 35 44 45 34 45 46 CZ CIP NOR SXT TE DO ENR GM N 40 25 41 42 40 25 43 41 43 42 44 44 40 40 43 45 25 26 28 27 26 27 25 24 25 25 26 23 24 25 24 26 17 26 20 18 20 26 19 20 18 19 22 22 20 18 19 22 25 21 25 24 25 22 24 23 22 22 23 23 22 23 22 26 30 33 34 32 27 33 31 29 29 32 32 33 35 34 34 33 27 34 33 34 33 34 35 30 33 33 32 33 27 30 33 34 23 30 26 27 27 30 25 28 27 23 25 23 26 28 26 28 11 25 9 25 10 11 10 10 10 10 10 11 10 10 26 10 11 25 10 10 9 11 10 10 10 38 Bảng C So sánh kết API 20 Strep STT Test VP HIP ESC PYRA αGAL βGUR βGAL PAL LAP 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 ADH RIB ARA MAN SOR LAC TRE INU RAF AMD GLYG Kết Âm tính (-) Không màu / hồng nhạt Không màu / hồng nhạt Không màu / vàng nhạt Không màu/cam nhạt Không màu Không màu/tím nhạt Không màu/tím nhạt Không màu/tím nhạt Không màu Vàng Đỏ Đỏ Đỏ Đỏ Đỏ Đỏ Đỏ Đỏ Đỏ Đỏ Cam 24 Không màu / vàng nhạt Xám nhạt 24 Cam/Đỏ Cam/Đỏ Cam/Đỏ Cam/Đỏ Cam/Đỏ Cam/Đỏ Cam/Đỏ Cam/Đỏ Cam/Đỏ 39 Dương tính (+) Hồng đậm / đỏ Xanh đen / tím 24 Xám đen Đen Cam Tím Xanh Tím Tím Cam 24 Đỏ Cam/Vàng Vàng Cam/Vàng Vàng Cam/Vàng Vàng Cam/Vàng Vàng Cam/Vàng Vàng Cam/Vàng Vàng Cam/Vàng Vàng Cam/Vàng Vàng Cam/Vàng Vàng Vàng nhạt Bảng D kết test API 20 Strep Stt tiêu Chủng vi khuẩn não 2a não thận thận não thận não 1 2a não 2b não thận não thận não thận 2 não 4 5 não6 VP − − − − + − − − − − − − − − − − HIP − + − + + − − − + − − + + + + − ESC + + + + − + + + + + + + + + + + PYRA + + + + − + + + + + + + + + + + αGAL 10 11 βGUR βGAL PAL LAP ADH RIB − − − 12 ARA − − + − + + + + − − + − + + + + − − + − + + + + − − + − + + + − − − + − + + + + − − + − + + + + − − + − + + + + − − + − + + + + − − − − + + + + − − + − + + + + − − + − + + + + − − + − + + + + − − + − + + + + − − + − + + + + − − + − + + + + − 13 MAN + + + + − + + + + + + + + + + + 14 SOR 15 16 LAC TRE − − + 17 INU − − − + − − − + − − − + − − − − − − − + − − − + − − − + − − − + − − − + − − − + − − − + − − − + − − − + − − − + − − − + − 18 RAF − 19 20 AMD GLYG + + − + + − + + − + + − − − − + + − + + − + + − + + − + + − + + − + + − + + − + + − + + − + + + + + + 40 41 [...]... hậu môn và các gốc vây Từ các mẫu bệnh nghiên cứu đã phân lập được 21 chủng vi khuẩn từ các cơ quan bên trong như thận, tim, tỳ tạng và gan Dựa vào đặc điểm hình thái và hóa sinh đã xác định sự có mặt của V alginolyticus (Nguyễn Thị Thoa, 2011) Nguyễn Thị Thoa (2011) khi phân lập vi khuẩn gây bệnh lở loét trên cá chẽm đã thu được 4 chủng vi khuẩn Vibrio alginolyticus Sau khi tiêm vi khuẩn vởi cá khỏe... vi khuẩn gây ra với những vụ dịch bệnh có qui mô lớn Thông thường, người ta sử dụng thuốc kháng sinh để kiểm soát các vi khuẩn gây bệnh Do vi c sử dụng không đúng cách và quá nhiều các loại thuốc kháng sinh nên đã gây ra hiện tượng vi khuẩn kháng thuốc và tích tụ dư lượng thuốc kháng sinh trong thịt thuỷ sản Một nguyên nhân khác gây ra hiện tượng vi khuẩn kháng thuốc là vi c sử dụng các loại kháng sinh. .. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểm sinh học của cá chẽm 2.1.1 Đặc điểm phân loại cá chẽm Cá chẽm còn gọi là cá Vược có hệ thống phân loại như sau: Ngành: Chordata Lớp: Osteichthyes Bộ: Perciformes Họ: Latidae Giống: Lates Loài: Lates calcarifer (Bloch, 1790) Hình 2.1 Cá Chẽm (Lates calcarifer) Tên tiếng Vi t: Cá chẽm, cá vược , tên tiếng Anh: Sea bass, Barramundi, Giant seaperch 2.1.2 Đặc điểm hình thái Cá. .. Hình 4.7 Đĩa tan huyết dạng α 24 4.4 Kết quả kháng sinh đồ Sau khi đã kiểm tra các chỉ tiêu sinh hóa và kết quả kiểm tra bằng kít API 20 Strep xác định vi khuẩn phân lập từ cá chẽm là vi khuẩn S agalactiae và S iniae Tiến hành kiểm tra kháng sinh đồ trên môi trường MHA + 1,5 % NaCl bằng phương pháp tráng dung dịch vi khuẩn và so sánh độ đục của dung dịch vi khuẩn với ống McFarland số 3 Kết quả đo đường... hiện bệnh do Vibriosis gây ra trên cá chẽm (Lates calcarifer) nuôi lồng ở Malaysia gây tỷ lệ chết cao, thường mắc bệnh ở giai đoạn cá nhỏ biểu hiện là bỏ ăn, cơ thể sậm màu, xuất huyết quanh hậu môn và các gốc vây, sau đó chết hàng loạt Từ các mẫu bệnh phẩm tác giả đã phân lập được 21 chủng vi khuẩn từ các cơ quan như: gan, thận, tim, tỳ tạng, dựa vào các đặc điểm sinh hóa và hình thái đã xác định được... Penicillin G và kháng với Sulphamethoxazole, Sulphonamides, Trimethoprim Park et al (2008) xác định khả năng nhạy và kháng thuốc kháng sinh ở vi khuẩn phân lập từ các loài cá nuôi ở đảo Jeju Hàn Quốc theo kết quả cho thấy vi khuẩn Streptococcus iniae nhạy với cefotaxime, erythromycin, ofloxacin, penicillin, tetracycline và vancomycin Tukmechi et al (2009) nghiên cứu vi khuẩn Streptococsis trên cá tai tượng... dụng bộ kit API 20 Strep và Slidex Strepto-kit đã xác định được vi khuẩn phân lập từ cá chẽm bệnh là Streptococcus iniae và Streptococcus agalactiae Đều này phù hợp với kết quả nghiên cứu của đề tài Ngoài ra, Yuasa et al (2008) khi sử dụng bộ kit API 20 strep để định danh vi khuẩn phân lập từ cá rô phi ở Indonesia kết quả thu được là vi khuẩn Streptococcus iniae Qua đó cho thấy vi khuẩn Streptococcus gây... nuôi cá lồng trên biển, bệnh Flexibacter đã xảy ra ở một số loài cá biển có giá trị kinh tế như cá mú, cá chẽm, vào mùa xuân và mùa thu ở miền Bắc, vào mùa mưa ở miền Nam Đỗ Thị Hòa và ctv (2007), cũng xác định một loài vi khuẩn dạng sợi có đặc điểm sinh hóa tương tự như Flexibaterium maritimus đã được xác định là tác nhân gây bệnh ở cá chẽm, cá mú bị bệnh thối đuôi, mòn vây cũng như một số loài cá biển... các ô dựa vào (Bảng C Phụ lục III) 3.2.4 Lập kháng sinh đồ 17 Lập kháng sinh đồ dựa trên phương pháp xác định mật số vi khuẩn dựa vào ống chuẩn McFarland số 3 (9x108 cfu/ml) Vi khuẩn sau khi được phục hồi và đã thuần thì tiến hành kiểm tra kháng sinh đồ Dùng que cấy tiệt trùng lấy khuẩn lạc trên đĩa vi khuẩn cho vào ống nghiệm chứa 5ml nước muối sinh lý (0,85% NaCl) đã tiệt trùng Trộn đều và so sánh... dịch vi khuẩn với cách trãi dung dịch vi khuẩn lên đĩa môi trường MHA Nguyễn Thị Thúy Hằng (2008) đã so sánh phương pháp lập kháng sinh đồ dùng tâm bông để quét, trải vi khuẩn bằng que trải thủy tinh, tráng vi khuẩn bằng pipet so sánh độ đục của vi khuẩn bằng 2 phương pháp đo bằng máy quang phổ và ống McFarland số 3 trên 2 môi trường là MHA và NA kết quả cho thấy cách trãi vi khuẩn ít dao động hơn cách ... định đặc điểm sinh hóa khả kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn phân lập từ cá chẽm (Lates calcarifer) 1.1.2 Nội dung nghiên cứu  Xác định đặc điểm sinh hóa vi khuẩn phân lập từ cá chẽm (Lates calcarifer). .. calcarifer)  Định danh vi khuẩn phân lập từ cá chẽm (Lates calcarifer) kít API 20 Strep  Lập kháng sinh đồ xác định khả kháng thuốc vi khuẩn phân lập từ cá chẽm (Lates calcarifer)  Tìm hiểu đặc điểm. .. ĐOÀN QUỐC TỈNH XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG THUỐC KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ CÁ CHẼM (Lates calcarifer) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG