Vật liệu – Phương pháp CHƢƠNG II VẬT LIỆU-PHƢƠNG PHÁP - 28 - Luận văn thạc sĩ sinh học Vật liệu – Phương pháp 2.1 VẬT LIỆU 2.1.1 Thiết bị – Dụng cụ - Bộ pipetman 10, 20, 100, 1000, 5000 μl, loại đầu tip tƣơng ứng - Các loại eppendof 0,2ml, 1,5ml - Erlen 100ml, 250ml, 1000ml, ống đong, bercher, đĩa petri - Đèn cồn, que cấy, bình tia chứa cồn, nƣớc cất - Bộ chuyển màng lai (Hoefer mini VE, Amersham Pharmacia Biotech) - Bộ điện di ngang DNA (HORIZON ®58, Life Technology™, Mỹ) hộp đèn soi UV (Hoefer, Mỹ) - Bộ điện di protein (Hoefer mini VE, Amersham Pharmacia Biotech) nguồn (Amersham Biosciences) - Cân kỹ thuật Ohaus (Mỹ) - Cân phân tích Precica (Thụy Sỹ) - Cột tinh chế Hitrap SP FF 5ml, Hitrap Heparin HP 5ml (GE Healthcare) - Hệ thống lên men tự động BioTron-LiFlus GX GX-05-12302 thiết bị phụ trợ nhƣ: máy nén khí, hệ thống nƣớc giải nhiệt… - Hệ thống tinh chế AKTA (GE Healthcare) - Máy chụp hình gel (Amersham Biosciences) - Máy đo nồng độ DNA Nanodrop - Máy điều nhiệt theo chu kỳ Eppendorf Mastercycler Personal - Máy đo quang phổ chuyên dụng GeneQuantpro (Amersham Biosciences) dùng cho DNA, RNA protein - Máy đo pH (ORION, Anh) - Máy khuấy từ gia nhiệt Bibby (Anh) - Máy lắc nƣớc Grant GLS400 (Cambridge, Anh) thiết bị làm lạnh kèm - Máy ly tâm lạnh Mikro 22R (Hettich, Nhật) - Máy lắc ổn nhiệt Orbital Incubator S150 (Stuard Scientific, Anh) - 29 - Luận văn thạc sĩ sinh học Vật liệu – Phương pháp - Máy phá tế bào Model M-110EH-30 Microfluidizer Processor hệ thống làm lạnh kèm - Máy Vortex (IKA, Mỹ) - Nồi hấp khử trùng Autoclave (SS325-TOMY) - Phần mềm Quantity One (Biorad) - Tủ ấm Memmert (Nhật) - Tủ cấy vô trùng Class II (Mỹ) - Tủ lạnh -20oC (Medical Class, Nhật) - Tủ lạnh -80oC (MDF 382-SANYO, Nhật) - Tủ mát 4oC - Tủ sấy Memmert (Nhật) 2.1.2 Hóa chất môi trƣờng 2.1.2.1 Hóa chất a) Hóa chất dùng cho phản ứng PCR - Dung dịch MgCl2 25mM (Fermentas, Đức) - dNTPs 8mM (Fermentas, Đức) - Taq polymerase 1u/µl (Fermentas, Đức) - Buffer Taq polymerase 10X (Fermentas, Đức) - Pfu DNA polymerase 1u/µl (Fermentas, Đức) - Buffer Pfu DNA polymerase 10X(Fermentas, Đức) b) Dung dịch tách plasmid phương pháp SDS- kiềm - Dung dịch I: Tris-HCl 25mM; EDTA 10mM; glucose 50mM, pH - Dung dịch II: NaOH 0,2N; SDS 1% (pha trƣớc dùng) - Dung dịch III: CH3COOK 3M, pH 4,8 - Chloroform - Dung dịch TE: Tris-HCl 10mM; EDTA 1M, pH 8,0 - Ethanol 70% ethanol tuyệt đối lạnh (giữ -20oC) - Isopropanol lạnh (giữ -20oC) - 30 - Luận văn thạc sĩ sinh học Vật liệu – Phương pháp - Phenol bão hòa TE (pH 8,0) - Sodium acetate 3M (pH 4,8) c) Hóa chất dùng cho phản ứng cắt nối - Enzyme BamHI, NdeI (Fermentas, Đức) - Buffer Tango 10X (Fermentas, Đức) - Buffer ligation 10X (Fermentas, Đức) - T4 DNA ligase (Fermentas, Đức) - Nƣớc cất MiliQ d) Hóa chất tinh chế sản phẩm PCR sản phẩm cắt - Chloroform - Ethanol 70% ethanol tuyệt đối lạnh (giữ -20oC) - Isopropanol lạnh (giữ -20oC) - Phenol bão hòa TE (pH 8,0) - Hóa chất dùng cho tinh chế DNA - Bộ kit tinh chế EZ-10 spin column (Biobasic) e) Hóa chất dùng cho biến nạp DNA plasmid vào E coli - Dung dịch CaCl2 100mM vô trùng - Dung dịch MgCl2 20mM, CaCl2 80mM vô trùng (giữ 4oC) - Dung dịch glycerol 80% vô trùng f) Hóa chất dùng cho điện di DNA gel agarose - Agarose (Biobasic) - Dung dịch chạy điện di TAE 50X: Tris acetate 40mM, EDTA 0,1M (pH 8,0) - Dung dịch nạp mẫu DNA: 0,05% xylene cyanol, 0,09% bromophenol blue; 60% glycerol 60mM EDTA - Ethidium bromide 10 mg/ml g) Hoá chất dùng cho điện di SDS - PAGE - Dung dịch điện di 5X (Tris - glycine buffer pH 8,3): Tris 15,1g, SDS 5g, glycine 94g pha lít nƣớc - 31 - Luận văn thạc sĩ sinh học Vật liệu – Phương pháp - Tris - HCl 1,5M pH 8,8 (giữ 4oC) - Tris - HCl 0,5M pH 6,8 (giữ 4oC) - SDS 10% - 40% acrylamide - 0,8% bis acrylamide (giữ 4oC) - Ammonium persulphate (APS) (giữ 4oC) - TEMED (N, N, N’, N’- tetramethylethylene diamine) (giữ 4oC) Thành phần gel phân tích (15%) gel gom đƣợc trình bày nhƣ bảng 2.1 Bảng 2.1 Công thức đổ gel phân tách gel gom điện di SDS-PAGE Gel phân tách Gel gom Nƣớc cất 2,52ml 1,3ml Tris-HCl 1,5M pH 8,8 1,75ml ml Tris-HCl 0,5M pH 6,8 ml 0,505ml Acrylamide 40% 2,64ml 0,2ml SDS 10% 70µl 20µl (APS) 10% 35µl 10 µl TEMED 2,8µl 2,0µl -Dung dịch đệm điện di protein: 3,02g Tris, 18,8g glycine, 1g SDS lít nƣớc cất, pH = 8,3 -Dung dịch nạp mẫu protein: 16ml Tris-HCl 0,5M pH 6,8, 1,54g DTT, 0,4g SDS, 0,9mg bromophenol blue, 4ml glycerol, 5-6ml β-mercaptoethanol - Dung dịch nhuộm coomassive: Coomassive blue 0,625g, glacial acetic acid 25ml, ethanol tuyệt đối 112,5ml pha 150ml dung dịch - Dung dịch giải nhuộm: Ethanol tuyệt đối 100ml; glacial acetic acid100ml pha 1l dung dịch - Dung dịch nhuộm bạc : + Dung dịch cố định mẫu 1: Ethanol 50ml, acetic acid 5ml, nƣớc cất 50ml + Dung dịch cố định mẫu 2: Methanol 50ml, nƣớc cất 50ml + Natrithiosulfate 0,02% - 32 - Luận văn thạc sĩ sinh học Vật liệu – Phương pháp + AgNO3 0,2% + Developer: Na2CO3 10g, Formaldehyde 0,54ml, nƣớc cất đủ 50ml + Stopper: Glycine 0,5g, nƣớc cất đủ 100ml h) Hoá chất lai Western-Blot - Dung dịch Towbin: 3g Tris-HCl, 14,4g glycine, 1g SDS 800ml nƣớc cất Bổ sung 200ml methanol trƣớc dùng - Dung dịch PBS (Phosphate Buffer Saline): Na2HPO4 80mM, NaH2PO4 20mM, NaCl 100mM, pH = 7,5 - Dung dịch PBST: 0,1% Tween 20 PBS - Dung dịch khoá màng: 0,5g sữa gầy 10ml dung dịch PBST - Dung dịch chứa kháng thể kháng FGF: 10ml dung dịch PBST; 1µl kháng thể kháng FGF-2 (10mg/ml) (Sigma) - Dung dịch chứa kháng thể anti-Ig chuột-HRP: 10ml dung dịch PBST; 1µl kháng thể anti-Ig chuột-HRP (10mg/ml) (Sigma) - Dung dịch phát (Amersham): detection 1: detection 2= 1:1 i) Hóa chất dùng cho tinh chế protein - Buffer A (dung dịch cân cột): Na2HPO4 0,1M, NaH2PO4 0,1M, EDTA 1mM, pH - Buffer B (dung dịch dung ly): Na2HPO4 0,1M, NaH2PO4 0,1M, EDTA 1mM, NaCl 2M, pH - Dung dịch Ethanol 20% - Nƣớc cất j) Một số hóa chất khác - Ampicillin 100mg/ml (Biobasic) (giữ -30oC) - IPTG (Isopropyl1-β-D-thiogalactoside) 1M (giữ -30oC) - Các chất điều chỉnh pH trình lên men: NH4OH 15%, H3PO4 30% - Chất phá bọt trình lên men: polyglycon - 33 - Luận văn thạc sĩ sinh học Vật liệu – Phương pháp 2.1.2.2 Môi trƣờng - Môi trƣờng LB: Trypton 10g, NaCl 5g, cao nấm men 5g pha lít môi trƣờng, hấp khử trùng 121oC 20 phút - Môi trƣờng LB agar: môi trƣờng LB lỏng bổ sung thêm 2% agar, hấp khử trùng 121oC 20 phút - Môi trƣờng LB-Amp100: môi trƣờng LB bổ sung thêm ampicillin để nồng độ cuối 100g/ml 40-45oC sau hấp khử trùng (giữ 4oC) - Môi trƣờng LB-Amp100 agar: môi trƣờng LB-Amp100 lỏng bổ sung thêm 2% agar (giữ 4oC) - Môi trƣờng lên men: + Trace: ZnSO4.7H2O 0,288g/l; MnSO4.7H2O 0,142g/l; H3BO3 0,062g/l; NaMoO4.2H2O 0,048g/l; CoCl2.6H2O 0,048g/l; KI 0,083g/l; CaSO4.5H2O 0,125g/l; H2SO4 0,25M 1ml/l + Môi trƣờng lên men (pH = 7): glycerol 0,3%, trypton 0,5%; cao nấm men 0,5%; KH2PO4 50mM; Na2HPO4 50mM; NH4Cl 0,5g/l; MgSO4 4mM; Na2SO4 5mM; glucose 0,5%; trace 1ml/l 2.1.3 Vật liệu sinh học Tất vật liệu sinh học đƣợc dùng đề tài đƣợc cung cấp Bộ môn Công nghệ Sinh học phân tử - môi trƣờng, trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG TPHCM 2.1.3.1 Chủng vi sinh vật Chủng E coli DH5 [F-, 80lacZM15, recA1, endA1, hsdR17(rk-, mk+), phoA, supE44, -, thi-1, gyrA96, relA1] dùng để dòng hóa Chủng E coli BL21(DE3) (F+ ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm(DE3)) chủng E coli đột biến khiếm khuyết protease ompT lon, dùng để biểu 2.1.3.2 Plasmid - 34 - Luận văn thạc sĩ sinh học Vật liệu – Phương pháp Plasmid Bộ môn Công nghệ Sinh học phân tử - môi trƣờng, trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG TPHCM cung cấp Plasmid pIDT-fgf2 chứa gene mã hóa protein FGF-2 với vị trí cysteine đƣợc biến đổi đƣợc gửi tổng hợp hoá học công ty IDTDNA, Hoa Kỳ Plasmid pET-His có kích thƣớc 4636bp, có chứa gen kháng kháng sinh ampicillin (ampr), trình tự khởi đầu chép pBR322 ori, promoter T7 Đây promoter mạnh giúp cho việc biểu protein vi khuẩn Ngoài ra, vùng MCS có vị trí cắt giới hạn hai enzyme BamHI NdeI giúp gắn chèn đoạn gen mong muốn vào vector Gen quan tâm đƣợc dung hợp với đuôi His 6x đầu Nterminal giúp cho việc tinh chế dễ dàng Hình 2.1 Plasmid pET-His 2.1.3.3 Thang chuẩn - 35 - Luận văn thạc sĩ sinh học Vật liệu – Phương pháp Hình 2.2 Các thang chuẩn A, thang Kb (Fermentas); B, thang 1Kb plus (Fermentas); C, thang phân tử lượng protein (Sigma) 2.2 PHƢƠNG PHÁP Quy trình tạo plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 dòng hóa tế bào E coli DH5α đƣợc thể nhƣ hình 2.3 Hình 2.3 Quy trình tạo plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 - 36 - Luận văn thạc sĩ sinh học Vật liệu – Phương pháp 2.2.1 Cấu trúc chủng E coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 2.2.1.1 Thu nhận gen fgf-2 phản ứng PCR Gene fgf-2 đƣợc thu nhận với lƣợng lớn nhờ phản ứng PCR plasmid pIDT-fgf2 với cặp mồi đặc hiệu gene nhằm phục vụ cho công đoạn tạo dòng vào plasmid pET-His với chƣơng trình đƣợc thiết kế nhƣ hình 2.4 Hình 2.4 Chương trình PCR thu nhận gen fgf2 Thành phần phản ứng PCR: MgSO4 5,0µl dNTP 5,0µl Buffer Pfu 10X 5,0µl Mồi FGF-2F 1,0µl Mồi FGF-2R 1,0µl DNA plasmid pIDT 1,0µl Pfu DNA polymerase 1,0µl đủ 50µl dH2O Gen fgf2 thu nhận sau phản ứng PCR đƣợc tinh chế kít EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit 2.2.1.2 Tách chiết, thu nhận plasmid pET-His a) Nguyên tắc phƣơng pháp tách chiết SDS-kiềm - 37 - Luận văn thạc sĩ sinh học Vật liệu – Phương pháp - Thêm 3ml CaCl2 100mM 1ml glycerol 80%, trộn nhẹ cất giữ tế bào tủ âm Tất bƣớc đƣợc thực vô trùng b) Biến nạp sản phẩm nối vào tế bào khả nạp 15µl hỗn hợp sản phẩm nối đƣợc trộn vào 100µl tế bào E coli DH5α khả nạp eppendorf Rồi thực sốc nhiệt theo qui trình sau: - Để lạnh 4oC 10 phút - Giữ 42oC 90 giây - Giữ lạnh 4oC 15 phút Sau trải hỗn hợp lên đĩa LB-Amp100, ủ 37oC khoảng 16-18 Tiến hành đồng thời mẫu đối chứng tế bào khả nạp E coli DH5α không đƣợc biến nạp sản phẩm nối 2.2.1.6 Sàng lọc thể biến nạp mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 a) Sàng lọc thể biến nạp môi trƣờng kháng sinh Sau ủ 37oC, kiểm tra kết biến nạp cách quan sát phát triển vi khuẩn đĩa biến nạp đĩa đối chứng Trên môi trƣờng LB-Amp100, tế bào E coli DH5α thu nhận đƣợc plasmid pET-fgf2 (plasmid tái tổ hợp) plasmid pET (plasmid tự nối) mọc đƣợc môi trƣờng Các tế bào đƣợc thu nhận để kiểm tra bƣớc b) Sàng lọc thể biến nạp phƣơng pháp PCR khuẩn lạc Nguyên tắc: Phƣơng pháp PCR khuẩn lạc tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp PCR DNA thông thƣờng Dƣới tác dụng nhiệt độ cao màng tế bào bị phá vỡ DNA plasmid đƣợc giải phóng trở thành khuôn cho phản ứng PCR Các bước thực hiện: Lấy sinh khối tăm vô trùng từ khuẩn lạc mọc đĩa LB-Amp100 agar Huyền phù đầu tăm vào eppendorf 0,2ml đƣợc đánh dấu sẵn Thành phần phản ứng: Buffer Taq 10X 2,5µl - 41 - Luận văn thạc sĩ sinh học Vật liệu – Phương pháp MgCl2 2,0µl dNTP (8mM) 2,5µl FGF2-F (10 pmol/µl) 1µl FGF2-R (10 pmol/µl) 1µl Taq DNA polymerase (1u/µl) dH2O 0,5µl 15,5µl Tổng thể tích 25µl Chƣơng trình chạy PCR đƣợc trình bày nhƣ hình 2.5 95oC phút 94oC 72oC 45 giây 72oC 45giây 10 phút 55oC 4oC 45 giây x(30) ∞ Hình 2.5 Chương trình PCR khuẩn lạc mồi đặc hiệu Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra gel agarose 1% Những khuẩn lạc cho vạch DNA có kích thƣớc nhƣ dự đoán đƣợc chọn lọc nuôi cấy tách chiết plasmid, chuẩn bị cho bƣớc kiểm tra c) Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 Thu nhận plasmid khuẩn lạc cho kết dƣơng tính với phản ứng PCR theo phƣơng pháp SDS-kiềm Plasmid sau tách đƣợc tiến hành phƣơng pháp sau: - Kiểm tra PCR plasmid với mồi đặc hiệu - Kiểm tra PCR plasmid với mồi thƣơng mại - Kiểm tra phƣơng pháp enzyme cắt hạn chế - 42 - Luận văn thạc sĩ sinh học Vật liệu – Phương pháp - Giải trình tự, so sánh độ tƣơng đồng trình tự lý thuyết đồng khung dịch mã * Kiểm tra PCR plasmid với mồi đặc hiệu FGF2-F/FGF2-R Plasmid sau tách đƣợc PCR kiểm tra với chƣơng trình chạy thành phần phản ứng tƣơng tự nhƣ kiểm tra PCR khuẩn lạc mục 2.2.1.6b * Kiểm tra PCR plasmid với mồi T7promoter/T7terminator Thành phần phản ứng: Buffer Taq 10X 2,5µl MgCl2 2,0µl dNTP (8mM) 2,5µl Mồi T7promoter (10 pmol/µl) 1µl Mồi T7terminator (10 pmol/µl) 1µl Plasmid 0,5µl Taq DNA polymerase (1u/µl) 0,5µl dH2O 15µl Tổng thể tích 25µl Chƣơng trình chạy PCR đƣợc trình bày nhƣ hình 2.6 Hình 2.6 Chương trình PCR plasmid mồi thương mại * Kiểm tra phương pháp enzyme cắt hạn chế - 43 - Luận văn thạc sĩ sinh học Vật liệu – Phương pháp Ngoài ra, plasmid đƣợc xử lý với enzyme EcoRI để kiểm tra kích thƣớc plasmid đồng thời đƣợc xử lý với enzyme NdeI BamHI để xác nhận diện gen fgf2 plasmid pET-fgf2 Thành phần phản ứng cắt đƣợc trình bày nhƣ mục 2.2.1.3 Sản phẩm cắt đƣợc điện di kiểm tra gel agarose 1% * Giải trình tự Plasmid tái tổ hợp thu nhận sau trình kiểm tra đƣợc tiến hành giải trình tự theo phƣơng pháp Sanger cải tiến máy Big DyeTM terminator công ty Macrogene, Hàn Quốc Sau đƣợc đem so sánh độ tƣơng đồng trình tự lý thuyết đồng khung dịch mã phần mềm Jelly fish Chủng đƣợc bảo quản 20% glycerol, -80oC 2.2.2 Cấu trúc chủng E Coli BL21(DE3) mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 2.2.2.1 Thu nhận plasmid pET-fgf2 Các plasmid tái tổ hợp pET-His-fgf2 đƣợc tách chiết phƣơng pháp SDSkiềm tƣơng tự nhƣ mục 2.2.1.2 2.2.2.2 Biến nạp plasmid pET-fgf2 vào E coli BL21(DE3) Chuẩn bị tế bào E coli BL21(DE3) khả nạp, biến nạp plasmid pET-fgf2 vào tế bào khả nạp E coli khả nạp trình biến nạp tƣơng tự nhƣ mục 2.2.1.5 Sau biến nạp trải lên đĩa LB-Amp100 Đĩa sau trải đƣợc ủ 37oC khoảng 16-18 Tiến hành đồng thời mẫu đối chứng tế bào khả nạp E coli BL21(DE3) không đƣợc biến nạp plasmid 2.2.2.3 Sàng lọc thể biến nạp phƣơng pháp PCR khuẩn lạc Khuẩn lạc E.coli BL21(DE3) đƣợc PCR kiểm tra với cặp mồi đặc hiệu FGF2F/FGF2-R tƣơng tự nhƣ kiểm tra PCR khuẩn lạc E.coli DH5α mục 2.2.1.6 2.2.3 Biểu protein FGF-2 tái tổ hợp dạng tan E coli BL21(DE3) 2.2.3.1 Cảm ứng biểu protein FGF-2 - Hoạt hóa tế bào E coli BL21(DE3) mang plasmid pET-His-fgf2 tái tổ hợp vào ống nghiệm chứa 5ml LB-Amp100 Lắc 250 vòng/phút 37°C qua đêm - 44 - Luận văn thạc sĩ sinh học Vật liệu – Phương pháp - Cấy chuyền 500μl dịch vi khuẩn nuôi cấy qua đêm vào ống nghiệm chứa 5ml môi trƣờng LB-Amp100 Lắc 250 vòng/phút 37°C qua đêm - Bổ sung IPTG đạt nồng độ cuối 0,3mM vào ống nghiệm Lắc 250 vòng/phút 37°C qua đêm - Tiến hành song song điều kiện mẫu nghiệm thức đối chứng BL21(DE3) mang plasmid pET-His-fgf2 không đƣợc cảm ứng với IPTG 2.2.3.2 Thu mẫu xử lý mẫu - Hút 1ml dịch vi khuẩn vào eppendorf thu eppendorf Ly tâm thu sinh khối 13000 vòng/phút phút - Rửa tủa nƣớc cất: Hòa tủa thu đƣợc 1ml nƣớc cất, vortex cho tủa hòa vào nƣớc cất, li tâm 13000 vòng/phút phút, loại bỏ dịch thu tủa - Hòa tủa 300µl nƣớc cất - Tiến hành sonicate dịch vừa thu nhận 4oC ba chu kì (mỗi chu kì phá 30 giây nghỉ 30 giây) với công suất 15watts Ly tâm eppendorf 13000 vòng/phút 4oC 10 phút, thu tủa riêng Eppendorf lại sonicate mà không ly tâm để làm mẫu tổng 2.2.4 Bƣớc đầu lên men hệ thống lên men quy mô lít để thu nhận protein FGF-2 tái tổ hợp dạng tan 2.2.4.1 Các bƣớc chuẩn bị a Chuẩn bị hoạt hóa giống: Chủng E coli BL21(DE3)/pET-FGF đƣợc cấy chuyền hoạt hóa lên đĩa petri chứa môi trƣờng thạch LB có bổ sung ampicillin để sàng lọc chủng Đĩa petri đƣợc ủ 37oC 10 - 14 giờ, sau giữ tủ mát 4oC Cấy khuẩn lạc đơn chủng từ đĩa petri vào ống nghiệm chứa 5ml môi trƣờng LB-Amp100 Lắc 250 vòng/phút, 37oC 12-14 Sử dụng 5ml giống cho vào erlen 250ml có chứa 100ml môi trƣờng lên men đƣợc bổ sung kháng sinh ampicillin nồng độ 100μg/ml Lắc 250 vòng/phút 37oC - 45 - Luận văn thạc sĩ sinh học Vật liệu – Phương pháp 12 - 14 Erlen chứa dịch nuôi cấy đƣợc dùng để nạp giống vào bình lên men theo tỷ lệ 1/10 (v/v) b Lắp ráp hệ thống lên men, nạp môi trƣờng giống: Các sensor pH, sensor DO đƣợc lắp vào vị trí bình lên men theo hình 2.7 Hình 2.7 Các vị trí lắp đặt thiết bị bình lên men Bình lên men đƣợc hấp vô trùng, sau tiến hành nạp giống vào bình lên men tiếp tục bổ sung Ampiciline đạt nồng độ cuối 100µg/ml, thao tác đƣợc tiến hành tủ cấy vô trùng Sau đó, bình lên men đƣợc lấy khỏi tủ cấy vô trùng lắp ráp vào hệ thống, lắp ráp hệ thống đƣờng ống nƣớc giải nhiệt, động khuấy, đƣờng khí vào (air inlet), hệ thống đƣờng ống nối với bình đựng dung dịch acid, base, antifoam Hệ thống lên men sau đƣợc lắp ráp hoàn chỉnh nhƣ hình 2.8 - 46 - Luận văn thạc sĩ sinh học Vật liệu – Phương pháp Hình 2.8 Hệ thống thiết bị lên men 2.2.4.2 Lên men cảm ứng biểu FGF-2 Các thông số cài đặt cho trình lên men chủng E coli BL21(DE3)/pET-FGF nhƣ sau: pH=7,00, DO>20%, khuấy tốc độ 250 vòng/phút, sục khí 1vvm Trong đầu, cài đặt nhiệt độ 37oC Sau lên men, bổ sung IPTG đạt nồng độ cuối 0,3mM chỉnh nhiệt độ 25oC, tốc độ khuấy 150 vòng/phút Lên men thời gian 24 Tiến hành thu dịch nuôi cấy phân tích trọng lƣợng khô tế bào (DCW) sau hai kể từ thời điểm bắt đầu lên men nhằm khảo sát động học tăng trƣởng chủng Kiểm tra xác nhận biểu protein FGF-2 tái tổ hợp phƣơng pháp SDS-PAGE định lƣợng phần mềm Quantitive One Mỗi sau cảm ứng với IPTG, thu mẫu để kiểm tra khả biểu chủng theo thời gian cảm ứng Sau 24 lên men, tiến hành ly tâm 1L dịch lên men để thu sinh khối hòa lại 300ml dịch phá tế bào Dịch tế bào đƣợc phá máy phá tế bào M-110EH-30 Microfluidizer Processor để thu nhận protein FGF-2 tái tổ hợp pha tan Dịch sau thu nhận đƣợc định lƣợng phƣơng pháp đo Bradford nhƣ trình bày mục 2.2.6.4 để đánh giá hiệu trình lên men 2.2.4.3 Đánh giá hiệu lên men a Phân tích trọng lƣợng khô tế bào (DCW): - 47 - Luận văn thạc sĩ sinh học Vật liệu – Phương pháp Tại thời điểm thu mẫu, hút 1ml dịch nuôi cấy cho vào eppendorf đƣợc sấy đến khối lƣợng không đổi khối lƣợng eppendorf đƣợc xác định cân Tiến hành ly tâm bỏ dịch sấy 80oC đến khối lƣợng khô tế bào không đổi Mẫu sau sấy đƣợc đem cân để xác định giá trị DCW b Chuẩn bị mẫu cho điện di SDS-PAGE để kiểm tra khả biểu FGF-2 theo thời gian cảm ứng: - Tại thời điểm thu mẫu, hút 1ml dịch nuôi cấy cho vào eppendorf - Ly tâm thu sinh khối 13.000 vòng/phút phút - Rửa tủa nƣớc cất: Hòa tủa thu đƣợc 1ml nƣớc cất, vortex cho tủa hòa nƣớc cất, ly tâm 13.000 vòng/phút phút, loại bỏ dịch thu tủa - Hòa tủa 600μl nƣớc cất - Tiến hành sonicate dịch vừa thu nhận 4oC dịch Ly tâm 13000 vòng/phút 4oC 10 phút, thu tủa riêng - Tiến hành điện di SDS-PAGE mẫu thể tan để đánh giá biểu protein FGF-2 tái tổ hợp tế bào chất E coli suốt trình lên men c Cách tính hiệu thu nhận FGF-2 [1] Hiệu thu nhận FGF-2 tối đa (E) đƣợc tính dựa lƣợng FGF-2 (T) thu đƣợc từ sinh khối khô tế bào (X) 1L (V) dung dịch sau 24 lên men E%  Tx100 X T đƣợc tính dựa vào lƣợng protein tổng (Y) tính đƣợc thông qua nồng độ đƣợc đo phƣơng pháp Bradford ([Protein tổng]) % FGF-2 protein tổng (Z) dịch phần mềm Quantity One công ty Biorad cung cấp T = Y x Z = [Protein tổng] x V x Z 2.2.5 Tinh chế FGF-2 2.2.5.1 Tinh chế sắc ký trao đổi cation - 48 - Luận văn thạc sĩ sinh học Vật liệu – Phương pháp Do pH=7 pH giúp ổn định hoạt tính FGF-2 nên tiến hành tinh chế protein mục tiêu pH=7 Do FGF-2 có pI=9,8 nên pH=7, protein tái tổ hợp FGF-2 tích điện dƣơng nên phƣơng pháp sắc ký trao đổi cation đƣợc sử dụng để tinh chế Trong luận văn này, cột trao đổi cation Hitrap SP FF 5ml (GE Healthcare) đƣợc sử dụng để thu nhận FGF-2 bƣớc Các bước thực hiện: - Rửa hệ thống tinh tế AKTA FPLC nƣớc đƣờng UV 280 trở nên cân - Lắp cột tinh chế cation SP FF 5ml vào hệ thống, rửa cột nƣớc - Cân cột dung dịch A đến đƣờng UV280 trở nên cân - Nạp 30ml mẫu vào cột với tốc độ dòng 2ml/phút, tái cân cột dung dịch A đến cân - Dung ly theo bậc thang: + Chỉnh tốc độ dòng 2ml/phút, 20% dung dịch B (80% dung dịch A) Thu nhận phân đoạn protein tƣơng ứng với 20% dung dịch B + Khi đƣờng UV280 cân bằng, chỉnh nồng độ dung dịch B lên 40% (60% dung dịch A) Thu nhận phân đoạn protein tƣơng ứng với 40% dung dịch B + Tiến hành tƣơng tự với nồng độ dung dịch B 60%, 80% 100% 2.2.5.2 Tinh chế sắc ký lực heparin FGF-2 có tƣơng tác đặc hiệu với heparin Do vậy, khóa luận này, sử dụng cột tinh chế Hitrap Heparin HP 5ml (GE Healthcare) để thu nhận FGF-2 dạng tinh - Rửa hệ thống tinh tế AKTA FPLC nƣớc đƣờng UV280 trở nên cân - Lắp cột tinh chế cation Heparin HP 5ml vào hệ thống, rửa cột nƣớc - Cân cột dung dịch A đến đƣờng UV280 trở nên cân - Nạp 30ml mẫu vào cột với tốc độ dòng 2ml/phút, tái cân cột dung dịch A đến cân - 49 - Luận văn thạc sĩ sinh học Vật liệu – Phương pháp - Dung ly theo bậc thang: + Chỉnh tốc độ dòng 2ml/phút, chỉnh nồng độ dung dịch B lên 40% (60% dung dịch A) Thu nhận phân đoạn protein tƣơng ứng với 40% dung dịch B + Tiến hành tƣơng tự với nồng độ dung dịch B 60%, 80% 100% * Các phân đoạn protein thu đƣợc đƣợc tiến hành phân tích điện di SDSPAGE khẳng định phƣơng pháp lai Western Blot để xác nhận diện FGF-2 Phần mềm Quantity One (Biorad) phƣơng pháp Bradford đƣợc sử dụng để tính hiệu suất phƣơng pháp tinh chế 2.2.6 Các phƣơng pháp phân tích protein 2.2.6.1 Phƣơng pháp điện di SDS-PAGE Gel polyacrylamide sản phẩm trùng ngƣng phân tử acrylamide N,N’-methylene-bis-acrylamide Quá trình trùng ngƣng đƣợc xúc tác hệ thống amonium persulfate (APS) - N,N,N’,N’-tetramethylenediamine (TEMED) Sau trùng ngƣng tạo thành hệ thống lƣới cho phép protein có kích thƣớc khác qua lỗ với vận tốc khác SDS tác nhân biến tính mạnh Phân tử bám lên phần kị nƣớc protein, làm âm tính hóa protein ngăn cản liên kết hydro Thêm vào đó, để loại bỏ cầu nối disulfide phân tử protein, ngƣời ta sử dụng thêm 2mercaptoethanol hay dithiothreitol (DTT) Khi đó, protein đƣợc đƣa cấu trúc bậc I đƣợc phân biệt qua gel dựa chiều dài chúng [35] * Chuẩn bị mẫu điện di SDS-PAGE - Bổ sung dung dịch nạp mẫu 5X vào mẫu cần phân tích với tỷ lệ 4:1, votex nhẹ - Đun 100oC 20 phút, sau ủ vào đá phút để biến tính protein * Chuẩn bị gel điện di Gel điện di polyacrylamide 15% gồm gel gom gel phân tách có thành nhƣ nói * Tiến hành điện di SDS – PAGE - 50 - Luận văn thạc sĩ sinh học Vật liệu – Phương pháp Nạp 10µl mẫu 5µl thang protein vào giếng Tiến hành điện di điều kiện 2mA/giếng, 220V khoảng Khi hoàn tất điện di, lấy gel khỏi kính, cắt bỏ phần gel gom, nhuộm phần gel phân tích 2.2.6.2 Phƣơng pháp nhuộm gel điện di a Phƣơng pháp nhuộm Comassive - Nhuộm gel với dung dịch nhuộm comassive 30 phút - Giải nhuộm dung dịch giải nhuộm, thay dung dịch giải nhuộm sau gel trở nên suốt vạch protein rõ b Phƣơng pháp nhuộm bạc - Lắc gel dung dịch cố định 30 phút - Đổ bỏ dung dịch cố định 1, lắc gel dung dịch cố định 10 phút - Đổ bỏ dung dịch cố định 2, rửa gel với nƣớc lắc gel natrithiosulfate 90 giây - Đổ bỏ dung dịch natrithiosulfate, rửa lại gel nƣớc ngâm dung dịch AgNO3 20 phút 40C - Rửa lại gel nƣớc gel dung dịch developer vạch protein lên - Dừng phản ứng dung dịch stopper 2.2.6.3 Kiểm tra phƣơng pháp lai Western Blot Để phát protein FGF-2, thực lai Western Blot với kháng thể đặc hiệu kháng FGF-2 Sau đó, sử dụng kháng thể thứ cấp anti-Ig chuột-HRP để phát phản ứng chuyên biệt kháng thể kháng FGF-2 với FGF-2 Khi HRP gặp chất H2O2 luminol, HRP thủy phân H2O2 đồng thời oxi hóa luminol Luminol bị oxy hóa trạng thái không bền phát ánh sáng để trở trạng thái bền Ánh sáng có bƣớc sóng ngắn làm cháy phim hình thành vệt phim Nhƣ vậy, có vị trí mang protein mục tiêu (protein FGF-2) tạo vệt phim [28] Thực * Điện di SDS-PAGE - 51 - Luận văn thạc sĩ sinh học Vật liệu – Phương pháp Tiến hành điện di SDS-PAGE với mẫu nhƣ với thang prestained (2,5l) Điện di với điện 220V, 2mA/giếng khoảng * Chuyển màng lai - Ngâm giấy thấm, màng lai nitrocellulose gel dung dịch Towbin 10 phút, lắc nhẹ - Đặt tất vào chuyển màng theo thứ tự: cực dƣơng-xốp đệm-giấy thấmmàng nitrocellulose-gel-giấy thấm-xốp đệm-cực âm (hình 2.9) với hiệu điện 10V, cƣờng độ 100mA 30 phút Hình 2.9 Sơ đồ minh họa thứ tự thành phần bước chuyển màng * Khóa màng - Màng đƣợc đặt sữa gầy, lắc nhẹ 1giờ nhiệt độ phòng hay ủ qua đêm 4oC - Lắc rửa màng lai lần với 15-20 ml PBST/lần, lần phút * Ủ với kháng thể đặc hiệu - Bổ sung 1l kháng thể kháng FGF-2 đặc hiệu đƣợc pha loãng 10ml PBST, lắc nhẹ nhiệt độ phòng - Lắc rửa màng lai lần với 15-20 ml PBST/lần, lần phút * Ủ với kháng thể thứ cấp - 52 - Luận văn thạc sĩ sinh học Vật liệu – Phương pháp - Bổ sung 1l kháng thể thứ cấp anti-Ig chuột-HRP đƣợc pha loãng PBST, lắc nhẹ nhiệt độ phòng 1giờ - Lắc rửa màng lai lần với 15-20ml PBST/lần, lần phút * Hiện phim - Dung dịch phát hiện: detection dectection với tỷ lệ 1:1 - Dung dịch phim: developer 1X, fixer 1X, nƣớc, loại 200ml Đặt màng lai vào bao nylon Nhỏ dung dịch phát lên màng, đặt bao nylon có chứa màng lai vào hộp ép phim, mang vào phòng tối, ép phim lên màng lai, để yên tối khoảng 30 phút Sau ép xong nhúng phim vào dung dịch developer đến thấy vạch đen xuất Sau đó, nhúng vào dung dịch Fixer miếng phim trở nên Rửa phim lại nƣớc máy, phơi khô 2.2.6.4 Định lƣợng protein phƣơng pháp Bradford Phƣơng pháp dựa thay đổi bƣớc sóng hấp thu cực đại thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue tạo phức hợp với protein Trong dung dịch mang tính acid, chƣa kết nối với protein thuốc nhuộm có bƣớc sóng hấp thu cực đại 465 nm; kết hợp với protein thuốc nhuộm hấp thu cực đại bƣớc sóng 595 nm Thực [36] * Dựng đường chuẩn - Chuẩn bị dung dịch albumin nồng độ khác nhau: 0, 20, 40, 60, 80, 100g/ml - Cho 1,8ml dung dịch thuốc thử Bradford vào 200l dịch albumin nồng độ khác nhau, để yên 10 phút - Đo mật độ quang bƣớc sóng 595nm - Dựng đƣờng tƣơng quan tuyến tính nồng độ albumin OD595 đo đƣợc * Định lượng protein tổng dịch tinh chế - Pha loãng dịch protein cần đo nƣớc cất với độ pha loãng khác - 53 - Luận văn thạc sĩ sinh học Vật liệu – Phương pháp - Cho 1,8ml dung dịch thuốc thử Bradford vào 200l dịch protein nồng độ khác nhau, để yên 10 phút - Sau 10 phút, đo mật độ quang bƣớc sóng 595nm - Dựa đƣờng chuẩn giá trị OD595 đo đƣợc, xác định đƣợc lƣợng protein tổng có mẫu Kết đƣợc chấp nhận giá trị OD595 đo đƣợc không vƣợt giới hạn tuyến tính đƣờng chuẩn 2.2.6.5 Định lƣợng FGF-2 phần mềm xác định đậm độ Quantity One Phần mềm Quantity One định lƣợng phân tích nhiều liệu sinh học khác nhau, bao gồm mẫu phóng xạ, nhuộm huỳnh quang gel điện di Phần mềm định lƣợng tƣơng đối protein thực có tế bào thông qua tƣơng quan độ đậm vạch protein diện điện di từ mẫu dung dịch tế bào bị phá màng Công cụ tính giếng vạch có hình dạng không rõ ràng cách điều chỉnh dọc theo chiều dài chúng thông qua công cụ Volume Phần mềm Quantity One biến tín hiệu từ mẫu sinh học thành liệu số nhờ công cụ hỗ trợ ánh sáng hay chất phóng xạ, liệu số đƣợc hiển thị thành thang màu xám máy tính Một liệu số đƣợc trình bày hình tổng thể nhiều pixel nhỏ riêng lẻ Mỗi pixel đƣợc cộng gộp từ giá trị X,Y,Z, X,Y ứng với chiều ngang chiều dọc mẫu ảnh, giá trị Z cƣờng độ tín hiệu pixel Để thấy xác định đƣợc liệu, cƣờng độ cụm pixel phải cao cƣờng độ pixel hình thành nên background ảnh Cƣờng độ tổng liệu cộng gộp tất cƣờng độ pixel hình thành nên vật thể Nghĩa cƣờng độ tổng cao nồng độ protein cao[27] - Mẫu điện di SDS-PAGE đƣợc scan để lƣu giữ dƣới dạng file ảnh Sau file ảnh đƣợc sử dụng để phân tích phần mềm Quantity One, tiện ích Band Analysis Các bƣớc thực nhƣ sau: - Mở giao diện Quantity One, tiện ích Band Analysis - 54 - Luận văn thạc sĩ sinh học Vật liệu – Phương pháp - Mở file mục tiêu - Chọn chức Transform, Auto-scale để tối ƣu hóa hình ảnh - Xác định vùng gel cần phân tích chức Frame-lane - Trong vùng phân tích, chọn giếng chọn chức Lane-Background để xác định background hình ảnh - Phát vạch protein giếng chức Detect Band - Cuối sử dụng chức Band Attribute/Relative Quantity để xác định tỉ lệ vạch protein so với tổng protein giếng - 55 - Luận văn thạc sĩ sinh học [...]... quản trong 20 % glycerol, ở -80oC 2. 2 .2 Cấu trúc chủng E Coli BL21(DE3) mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 2. 2 .2. 1 Thu nhận plasmid pET-fgf2 Các plasmid tái tổ hợp pET-His-fgf2 đƣợc tách chiết bằng phƣơng pháp SDSkiềm tƣơng tự nhƣ mục 2. 2.1 .2 2 .2. 2 .2 Biến nạp plasmid pET-fgf2 vào E coli BL21(DE3) Chuẩn bị tế bào E coli BL21(DE3) khả nạp, biến nạp plasmid pET-fgf2 vào tế bào khả nạp E coli khả nạp và quá trình... E .coli DH5α ở mục 2. 2.1.6 2. 2.3 Biểu hiện protein FGF -2 tái tổ hợp dạng tan trong E coli BL21(DE3) 2. 2.3.1 Cảm ứng biểu hiện protein FGF -2 - Hoạt hóa tế bào E coli BL21(DE3) mang plasmid pET-His-fgf2 tái tổ hợp vào ống nghiệm chứa 5ml LB-Amp100 Lắc 25 0 vòng/phút ở 37°C qua đêm - 44 - Luận văn thạc sĩ sinh học Vật liệu – Phương pháp - Cấy chuyền 500μl dịch vi khuẩn đã nuôi cấy qua đêm vào ống nghiệm chứa... protein tổng (Y) tính đƣợc thông qua nồng độ đƣợc đo bằng phƣơng pháp Bradford ([Protein tổng]) và % FGF -2 trên protein tổng (Z) của dịch nổi bằng phần mềm Quantity One do công ty Biorad cung cấp T = Y x Z = [Protein tổng] x V x Z 2. 2.5 Tinh chế FGF -2 2 .2. 5.1 Tinh chế bằng sắc ký trao đổi cation - 48 - Luận văn thạc sĩ sinh học Vật liệu – Phương pháp Do pH=7 là pH giúp ổn định hoạt tính của FGF -2 nên... độ dung dịch B 60%, 80% và 100% 2. 2.5 .2 Tinh chế bằng sắc ký ái lực heparin FGF -2 có tƣơng tác đặc hiệu với heparin Do vậy, trong khóa luận này, chúng tôi sử dụng cột tinh chế Hitrap Heparin HP 5ml (GE Healthcare) để thu nhận FGF -2 dạng tinh sạch - Rửa hệ thống tinh tế AKTA FPLC bằng nƣớc cho đến khi đƣờng nền UV280 trở nên cân bằng - Lắp cột tinh chế cation Heparin HP 5ml vào hệ thống, rửa cột bằng... mục 2. 2.1.5 Sau khi biến nạp và trải lên đĩa LB-Amp100 Đĩa sau khi trải sẽ đƣợc ủ 37oC trong khoảng 16-18 giờ Tiến hành đồng thời mẫu đối chứng là tế bào khả nạp E coli BL21(DE3) không đƣợc biến nạp plasmid 2. 2 .2. 3 Sàng lọc thể biến nạp bằng phƣơng pháp PCR khuẩn lạc Khuẩn lạc E .coli BL21(DE3) đƣợc PCR kiểm tra với cặp mồi đặc hiệu FGF2F/FGF2-R tƣơng tự nhƣ kiểm tra PCR khuẩn lạc E .coli DH5α ở mục 2. 2.1.6... thu tủa và nổi riêng - Tiến hành điện di SDS-PAGE các mẫu thể tan để đánh giá sự biểu hiện của protein FGF -2 tái tổ hợp trong tế bào chất E coli trong suốt quá trình lên men c Cách tính hiệu quả thu nhận FGF -2 [1] Hiệu quả thu nhận FGF -2 tối đa (E) đƣợc tính dựa trên lƣợng FGF -2 (T) thu đƣợc từ sinh khối khô tế bào (X) trong 1L (V) dung dịch sau 24 giờ lên men E%  Tx100 X T đƣợc tính dựa vào lƣợng... trong 30µl TE, -20 oC Điện di kiểm tra kết quả trên gel agarose 1% 2. 2.1.3 Xử lý gen fgf2 và plasmid pET-His bằng enzyme cắt hạn chế a) Xử lý gen fgf2 bằng hai enzyme cắt hạn chế BamHI và NdeI Thành phần phản ứng cắt: Gen fgf2 30µl Buffer Tango 10X 10µl Enzyme BamHI (10u/µl) 1µl Enzyme NdeI (10u/µl) 1µl dH2O 8µl Tổng thể tích 50µl b) Xử lý plasmid pET-His bằng hai enzyme cắt hạn chế BamHI và NdeI Thành... là 0,3mM và chỉnh nhiệt độ về 25 oC, tốc độ khuấy về 150 vòng/phút Lên men trong thời gian 24 giờ Tiến hành thu dịch nuôi cấy và phân tích trọng lƣợng khô tế bào (DCW) sau mỗi hai giờ kể từ thời điểm bắt đầu lên men nhằm khảo sát động học tăng trƣởng của chủng Kiểm tra và xác nhận sự biểu hiện protein FGF -2 tái tổ hợp bằng phƣơng pháp SDS-PAGE và định lƣợng bằng phần mềm Quantitive One Mỗi 2 giờ sau... hiện gel bằng dung dịch developer cho đến khi các vạch protein hiện lên - Dừng phản ứng bằng dung dịch stopper 2. 2.6.3 Kiểm tra bằng phƣơng pháp lai Western Blot Để phát hiện protein FGF -2, thực hiện lai Western Blot với kháng thể đặc hiệu kháng FGF -2 Sau đó, sử dụng kháng thể thứ cấp anti-Ig chuột-HRP để phát hiện phản ứng chuyên biệt giữa kháng thể kháng FGF -2 với FGF -2 Khi HRP gặp cơ chất H2O2 và. .. tôi tiến hành tinh chế protein mục tiêu ở pH=7 Do FGF -2 có pI=9,8 nên ở pH=7, protein tái tổ hợp FGF -2 tích điện dƣơng nên phƣơng pháp sắc ký trao đổi cation đƣợc sử dụng để tinh chế Trong luận văn này, cột trao đổi cation Hitrap SP FF 5ml (GE Healthcare) đƣợc sử dụng để thu nhận FGF -2 ở bƣớc đầu tiên Các bước thực hiện: - Rửa hệ thống tinh tế AKTA FPLC bằng nƣớc cho đến khi đƣờng nền UV 28 0 trở nên ... Chủng đƣợc bảo quản 20 % glycerol, -80oC 2. 2 .2 Cấu trúc chủng E Coli BL21(DE3) mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 2. 2 .2. 1 Thu nhận plasmid pET-fgf2 Các plasmid tái tổ hợp pET-His-fgf2 đƣợc tách chiết... E .coli BL21(DE3) đƣợc PCR kiểm tra với cặp mồi đặc hiệu FGF2F/FGF2-R tƣơng tự nhƣ kiểm tra PCR khuẩn lạc E .coli DH5α mục 2. 2.1.6 2. 2.3 Biểu protein FGF -2 tái tổ hợp dạng tan E coli BL21(DE3) 2. 2.3.1... SDSkiềm tƣơng tự nhƣ mục 2. 2.1 .2 2 .2. 2 .2 Biến nạp plasmid pET-fgf2 vào E coli BL21(DE3) Chuẩn bị tế bào E coli BL21(DE3) khả nạp, biến nạp plasmid pET-fgf2 vào tế bào khả nạp E coli khả nạp trình biến