BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM - - NGUYỄN THỊ NGA NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG LÂY NHIỄM VI RÚT NPV- Spl (Nucleo polyhedrosis virus - Spodoptera litura) TRÊN TẾ BÀO SÂU KHOANG (Spodoptera litura ) LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI – 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM - - NGUYỄN THỊ NGA NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG LÂY NHIỄM VI RÚT NPV- Spl (Nucleo polyhedrosis virus - Spodoptera litura) TRÊN TẾ BÀO SÂU KHOANG (Spodoptera litura ) CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: 60.42.02.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS LÊ VĂN TRỊNH TS NGUYỄN HỮU ĐỨC HÀ NỘI – 2014 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu kết nêu luận văn trung thực, chưa công bố công trình nghiên cứu khác Tôi xin cam đoan thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Tác giả luận văn Nguyễn Thị Nga Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập nghiên cứu, để hoàn thành luận văn xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Lê Văn Trịnh – Giám đốc Trung tâm Đấu tranh sinh học Ban Giám đốc Viện Bảo vệ thực vật tạo điều kiện cho học tập, tận tình hướng dẫn truyền đạt cho nhiều kinh nghiệm quý báu suốt trình nghiên cứu viết luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Nguyễn Hữu Đức – Phó Trưởng Khoa Công nghệ Sinh học, Trưởng Bộ môn Công nghệ sinh học Động vật – Học Viện nông nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ trình hoàn thành luận văn Để thực nghiên cứu này, xin cảm ơn giúp đỡ, tạo điều kiện bạn đồng nghiệp, cán lãnh đạo Trung tâm Đấu tranh sinh học Viện Bảo vệ thực vật Với tình cảm sâu sắc, xin cảm ơn ủng hộ giúp đỡ Thầy, Cô giáo thuộc Bộ môn Công nghệ sinh học Động vật – Khoa Công nghệ sinh học – Học Viện nông nghiệp Việt Nam trình thực luận văn Cuối cùng, xin cảm ơn Thầy, Cô giáo, chuyên viên Ban quản lý đào tạo – Học Viện nông nghiệp Việt Nam ủng hộ, tạo điều kiện giúp đỡ hoàn thành thủ tục cần thiết để bảo vệ thành công luận văn Hà Nội, năm 2014 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Nga Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH viii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ix MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài nghiên cứu Mục tiêu nghiên cứu đề tài 3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài CHƯƠNG I CƠ SỞ KHOA HỌC VÀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cơ sở khoa học đề tài nghiên cứu 1.2 Những nghiên cứu nước 1.2.1 Vài nét sâu khoang (Spodoptera litura) 1.2.2 Vi rút diệt côn trùng vi rút NPV (Nucleo Polyhedrosis Virus) 1.2.3 Kỹ thuật phân lập làm vi rút NPV phòng trừ sâu hại 16 1.2.4 Kỹ thuật bảo quản vi rút NPV 17 1.2.5 Kỹ thuật lây nhiễm vi rút NPV tế bào sâu khoang 18 1.3 20 Những nghiên cứu nước 1.3.1 Nghiên cứu thu thập phân lập vi rút NPV 21 1.3.2 Nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học từ vi rút NPV 22 CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Đối tượng, phạm vi dụng cụ, hóa chất, thiết bị nghiên cứu 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 26 26 Page iii 2.1.2 Phạm vi nghiên cứu 26 2.1.3 Hóa chất, dụng cụ thiết bị nghiên cứu 26 2.1.4 Địa điểm thời gian nghiên cứu 27 2.2 Nội dung nghiên cứu đề tài 27 2.2.1 Nghiên cứu phân lập, làm chọn lọc tạo thực liệu vi rút NPV có hoạt lực cao sâu khoang 27 2.2.2 Đánh giá hiệu lực gây chết sâu non sâu khoang nguồn NPV lựa chọn 27 2.2.3 Lây nhiễm nhân tạo vi rút NPV tế bào sâu khoang 28 2.3 28 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Nghiên cứu phân lập, làm chọn lọc tạo thực liệu vi rút NPV có hoạt lực cao sâu khoang 28 2.3.2 Nghiên cứu lây nhiễm vi rút NPV sâu khoang tế bào sâu 2.4 khoang nhân nuôi 32 Phương pháp xử lý số liệu 35 CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 37 3.1 Nghiên cứu phân lập, làm chọn lọc tạo thực liệu vi rút NPV có hoạt lực cao sâu khoang 37 3.1.1 Thu thập sâu khoang nhiễm vi rút NPV đồng 37 3.1.2 Phân lập chọn lọc nguồn thực liệu vi rút NPV có hoạt lực cao 38 3.1.3 Kiểm định nguồn vi rút NPV qua phân tích PCR hiển vi điện tử 56 3.1.4 Hiệu lực gây chết sâu non sâu khoang nguồn NPV sâu 3.3 khoang lựa chọn 58 Lây nhiễm vi rút NPV tế bào sâu khoang nhân nuôi 62 3.3.1 Xác định nồng độ tế bào thích hợp cho lây nhiễm 62 3.3.2 Xác định nồng độ vi rút thích hợp cho lây nhiễm 63 3.3.3 Xác định thời gian ủ lây nhiễm vi rút thích hợp 64 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv 3.3.4 Xác định môi trường thích hợp cho lây nhiễm 65 3.3.5 Xác định nhiệt độ thích hợp cho lây nhiễm 67 3.3.6 Xác định pH môi trường thích hợp cho lây nhiễm 68 3.3.7 Kiểm định vi rút NPV nhân tế bào 69 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 74 Kết luận 74 Đề nghị 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO 75 PHỤ LỤC Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v DANH MỤC BẢNG STT 3.1 Tên bảng Trang Số cá thể sâu khoang có biểu nhiễm vi rút NPV thu thập đồng ruộng (Hà Nội, 2013) 37 3.2 Số lượng mẫu sâu khoang nhiễm vi rút NPV sau phân lập 39 3.3 Hiệu lực gây chết sâu khoang nguồn vi rút NPV 41 3.4 Hoạt lực trừ sâu hàm lượng thể vùi hình thành nguồn NPV1 sau phân lập lần 3.5 42 Hoạt lực trừ sâu hàm lượng thể vùi hình thành nguồn vi rút từ NPV2 sau phân lập lần 3.6 43 Hoạt lực trừ sâu hàm lượng thể vùi nguồn vi rút từ NPV3 sau phân lập lần 3.7 44 Hoạt lực trừ sâu hàm lượng thể vùi hình thành nguồn vi rút có tiềm từ NPV1 sau phân lập lần 3.8 45 Hoạt lực trừ sâu hàm lượng thể vùi hình thành nguồnvi rút có tiểm từ NPV2 sau phân lập lần 3.9 46 Hoạt lực trừ sâu hàm lượng thể vùi hình thành nguồn vi rút có tiềm từ NPV3 sau phân lập lần 3.10 47 Hoạt lực trừ sâu hàm lượng thể vùi hình thành nguồn vi rút từ NPV1 sau phân lập lần 3.11 48 Hoạt lực trừ sâu hàm lượng thể vùi hình thành nguồn vi rút từ NPV2 sau phân lập lần 3.12 49 Hoạt lực trừ sâu hàm lượng thể vùi hình thành nguồn vi rút từ NPV3 sau phân lập lần 3.13 50 Hoạt lực trừ sâu hàm lượng thể vùi hình thành nguồn vi rút từ NPV1 sau phân lập lần Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 52 Page vi 3.14 Hoạt lực trừ sâu hàm lượng thể vùi hình thành nguồn vi rút từ NPV2 sau phân lập lần 3.15 53 Hoạt lực trừ sâu hàm lượng thể vùi hình thành nguồn vi rút NPV3 sau phân lập lần 3.16: Các nguồn vi rút NPV sâu khoang tiềm 54 chọn lọc sau lần phân lập 55 3.17 Ký hiệu tên nguồn vi rút NPV sâu khoang lựa chọn 55 3.18 Hiệu lực gây chết sâu khoang mật độ thể vùi hình thành nguồn vi rút NPV 60 3.19 Hoạt lực trừ sâu khoang NPV từ tế bào NPV sâu hại 61 3.20 Hàm lượng thể vùi nhiễm vi rút TL1 với nồng độ tế bào khác 3.21 63 Hàm lượng thể vùi nhiễm vi rút TL1 với nồng độ vi rút khác 64 3.22 Hàm lượng thể vùi thời gian ủ lây nhiễm khác 65 3.23 Hàm lượng vi rút môi trường nuôi cấy tế bào khác lây nhiễm 66 3.24 Hàm lượng vi rút nhiệt độ ủ lây nhiễm vi rút khác 67 3.25 Hàm lượng vi rút mức pH môi trường lây nhiễm vi rút khác Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 68 Page vii DANH MỤC HÌNH STT 1.1 Tên hình Trang Sâu khoang khoẻ mạnh (A) sâu khoang chết nhiễm vi rút NPV (B) 1.2 Chu trình tồn phát triển vi rút NPV tự nhiên 11 1.3 Các dạng Baculovirus (A) thể vùi vi rút (B,C,D) 14 1.4 Quá trình nhiễm vi rút NPV tế bào côn trùng 20 3.1 Sâu khoang chết nhiễm vi rút NPV 38 3.2 Thể vùi nguồn vi rút NPV sau 10 ngày xử lý 38 3.3 Thể vùi nguồn vi rút NPV độ phóng đại 400X 39 3.4 Lây nhiễm vi rút NPV sâu khoang phòng thí nghiệm 40 3.5 Kết điện di sản phẩm PCR mẫu vi rút NPV sâu khoang 57 3.6 Cây phả hệ xây dựng theo phương pháp Neighbor-joining 57 3.7 Hình ảnh thể vùi nguồn vi rút NPV kính hiển vi TEM 58 3.8 Sâu khoang chết sau lây nhiễm vi rút NPV (hình A hình B) 59 3.9 Thể vùi vi rút NPV sau xử lý 59 3.10 Tế bào sâu khoang nhiễm vi rút NPV chụp kính lúp soi 600X 3.11 70 Hình ảnh thể vùi vi rút NPV tế bào sâu khoang kính hiển vi điện tử TEM 70 3.12 Kết điện di PCR vi rút TL1 nhân tế bào sâu khoang 72 3.13 Cây phả hệ xây dựng theo phương pháp Neighbor-joining 73 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page viii PHỤ LỤC XỬ LÝ SỐ LIỆU THÍ NGHIÊM Xử lý số liệu hiệu lực gây chết sâu khoang mật độ thể vùi hình thành nguồn vi rút NPV Statistix 8.2 19/11/2013, 4:04:45 CH Randomized Complete Block AOV Table for HL Source LN CT Error Total DF 11 SS 4.017 406.900 15.316 MS 2.009 135.633 2.553 F P 53.13 0.0001 Note: SS are marginal (type III) sums of squares Grand Mean 73.886 CV 0.71 Relative Efficiency, RCB 0,91 Means of HL for CT CT N Mean TL1 80.00 TL2 68.33 TL3 73.33 Statistix 8.2 4:04:45 CH SE 0.9224 0.9224 0.9224 19/11/2013, LSD All-Pairwise Comparisons Test of HL for CT CT TL1 TL3 TL2 Mean Homogeneous Groups 80.00 A 73.33 C 68.33 B Alpha 0.05 Standard Error for Comparison Critical T Value 2,447 Critical Value for Comparison Error term used: Error, DF All means are significantly different from one another 1.3045 1.1948 Xử lý số liệu hoạt lực trừ sâu khoang NPV từ tế bào NPV sâu hại 2.1 Sau ngày nhiễm vi rút Statistix 8.2 4:12:41 CH 10/02/2014, Randomized Complete Block AOV Table for HL Source LN CT Error Total DF 11 SS 6.154 341.037 11.179 MS 3.077 113.679 1.863 F P 61.01 0.0001 Note: SS are marginal (type III) sums of squares Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 79 Grand Mean 27.334 CV 4.43 Relative Efficiency, RCB 1,06 Means of HL for CT CT N Mean SE CT1 CT2 CT3 CT4 3 3 38.633 43.333 27.333 35.000 0.7881 0.7881 0.7881 0.7881 Statistix 8.2 4:13:19 CH 10/02/2014, LSD All-Pairwise Comparisons Test of HL for CT CT CT2 CT1 CT4 CT3 Mean Homogeneous Groups 43.333 A 38.633 B 35.000 C 27.333 D Alpha 0.05 Standard Error for Comparison Critical T Value 2,447 Critical Value for Comparison Error term used: Error, DF There are groups (A, B, etc.) in which the means are not significantly different from one another 1.1145 3.1921 2.2 Sau ngày nhiễm vi rút Statistix 8.2 4:17:40 CH 17/02/2014, Randomized Complete Block AOV Table for HL Source LN CT Error Total DF 11 SS 10.940 145.157 25.060 MS 5.4701 48.3856 4.1766 F P 11.58 0.0066 Note: SS are marginal (type III) sums of squares Grand Mean 45.722 CV 2.99 Relative Efficiency, RCB 1,00 Means of HL for CT CT CT1 CT2 CT3 CT4 N 3 3 Mean 52.89 46.00 37.33 46.67 SE 1.1799 1.1799 1.1799 1.1799 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 80 Statistix 8.2 4:18:17 CH 17/02/2014, LSD All-Pairwise Comparisons Test of HL for CT CT CT1 CT2 CT4 CT3 Mean Homogeneous Groups 52.89 A 46.00 B 46.67 B 37.33 C Alpha 0.05 Standard Error for Comparison Critical T Value 2,447 Critical Value for Comparison Error term used: Error, DF There are groups (A and B) in which the means are not significantly different from one another 2.3 Sau 10 ngày nhiễm vi rút Statistix 8.2 3:10:18 CH 1.6687 2.7271 23/02/2014, Randomized Complete Block AOV Table for HL Source LN CT Error Total DF 2 SS 22.0860 75.5384 2.1031 99.7276 Grand Mean 76.202 MS 11.0430 37.7692 0.5258 F P 71.83 0.0007 CV 2.99 Tukey's Degree of Freedom Test for Nonadditivity Source DF SS MS F P Nonadditivity 0.05783 0.05783 0.08 0.7898 Remainder 2.04528 0.68176 Relative Efficiency, RCB 5,51 Means of HL for CT CT Mean CT1 80.47 CT2 76.67 CT3 69.00 CT4 78.67 Observations per Mean Standard Error of a Mean 0.4186 Std Error (Diff of Means) 0.5920 Statistix 8.2 3:11:52 CH 16/06/2014, LSD All-Pairwise Comparisons Test of HL for CT CT CT1 CT4 CT2 Mean Homogeneous Groups 80.47 A 78.67 A 76.67 A Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 81 CT3 69.00 B Alpha 0.05 Standard Error for Comparison 0.5920 Critical T Value 2,776 Critical Value for Comparison 4.5457 Error term used: LN*CT, DF All means are significantly different from one another Xử lý số liệu hàm lượng thể vùi nhiễm vi rút TL1 với nồng độ tế bào khác nhauSau 3.1 Sau ngày nhiễm vi rút Statistix 8.2 3:15:27 CH 16/06/2014, Randomized Complete Block AOV Table for HL Source LN CT Error Total DF 2 SS 7.106 198.306 18.735 224.148 Grand Mean 1.410 MS 3.5532 99.1532 4.6838 F P 21.17 0.0075 CV 0.144 Tukey's Degree of Freedom Test for Nonadditivity Source DF SS MS F P Nonadditivity 2.1701 2.17013 0.39 0.5752 Remainder 16.5649 5.52164 Relative Efficiency, RCB 0,86 Means of HL for CT CT Mean CT1 1.681 A CT2 1.450 B CT3 1.100 C Observations per Mean Standard Error of a Mean 1.2495 Std Error (Diff of Means) 1.7671 Statistix 8.2 3:16:27 CH 30/06/2014, LSD All-Pairwise Comparisons Test of HL for CT CT Mean Homogeneous Groups CT1 1.681 CT2 1.450 CT3 1.100 Alpha 0.05 Standard Error for Comparison Critical T Value 2,776 Critical Value for Comparison Error term used: LN*CT, DF There are groups (A and B) in which the means are not significantly different from one another Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 1.7671 0.500 Page 82 3.2 Sau 10 ngày nhiễm vi rút Statistix 8.2 3:22:50 CH 16/06/2014, Randomized Complete Block AOV Table for HL Source LN CT Error Total DF 2 SS 5.401 163.095 36.277 204.773 Grand Mean 74.831 MS 2.7005 81.5475 9.0692 F P 8.99 0.0331 CV 0.354 Tukey's Degree of Freedom Test for Nonadditivity Source DF SS MS F P Nonadditivity 9.4588 9.45880 1.06 0.3793 Remainder 26.8182 8.93939 Relative Efficiency, RCB 0,76 Means of HL for CT CT Mean CT1 1.270 CT2 1.011 CT3 2.433 Observations per Mean Standard Error of a Mean 1.7387 Std Error (Diff of Means) 2.4589 Statistix 8.2 3:23:38 CH 16/06/2014, LSD All-Pairwise Comparisons Test of HL for CT CT Mean Homogeneous Groups CT3 2.433 A CT1 1.270 B CT2 1.011 B Alpha 0.05 Standard Error for Comparison Critical T Value 2,776 Critical Value for Comparison Error term used: LN*CT, DF There are groups (A and B) in which the means are not significantly different from one another 2.4589 0.123 Xử lý số liệu hàm lượng thể vùi nhiễm vi rút TL1 với nồng độ vi rút khác 4.1 Sau ngày nhiễm vi rút Statistix 8.2 3:52:55 CH 16/06/2014, Randomized Complete Block AOV Table for HL Source LN CT DF 2 SS 0.350 98.813 MS 0.1750 49.4065 F P 32.34 0.0034 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 83 Error Total 6.111 105.274 Grand Mean 1.145 1.5278 CV 0.184 Tukey's Degree of Freedom Test for Nonadditivity Source DF SS MS F P Nonadditivity 1.37699 1.37699 0.87 0.4191 Remainder 4.73419 1.57806 Relative Efficiency, RCB 0,72 Means of HL for CT CT Mean CT1 1.470 CT2 0.850 CT3 1.110 Observations per Mean Standard Error of a Mean 0.7136 Std Error (Diff of Means) 1.0092 Statistix 8.2 3:53:58 CH 16/06/2014, LSD All-Pairwise Comparisons Test of HL for CT CT CT1 CT3 CT2 Mean Homogeneous Groups 1.470 A 1.110 B 0.850 C Alpha 0.05 Standard Error for Comparison Critical T Value 2,776 Critical Value for Comparison Error term used: LN*CT, DF All means are significantly different from one another 4.2 1.0092 0.636 Sau 10 ngày nhiễm Statistix 8.2 3:58:14 CH 16/06/2014, Randomized Complete Block AOV Table for HL Source LN CT Error Total DF 2 SS 20.685 305.277 9.979 335.941 MS 10.343 152.638 2.495 F P 61.18 0.0010 Grand Mean 0.66 CV 0.311 Tukey's Degree of Freedom Test for Nonadditivity Source DF SS MS F P Nonadditivity 2.60942 2.60942 1.06 0.3785 Remainder 7.36950 2.45650 Relative Efficiency, RCB 1,64 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 84 Means of HL for CT CT Mean CT1 1.08 CT2 0.53 CT3 0.37 Observations per Mean Standard Error of a Mean 0.9119 Std Error (Diff of Means) 1.2896 Statistix 8.2 3:59:08 CH 16/06/2014, LSD All-Pairwise Comparisons Test of HL for CT CT CT1 CT2 CT3 Mean Homogeneous Groups 1.08 A 0.53 B 0.37 C Alpha 0.05 Standard Error for Comparison Critical T Value 2,776 Critical Value for Comparison Error term used: LN*CT, DF All means are significantly different from one another Xử lý số liệu hàm lượng thể vùi thời gian ủ lây nhiễm khác 5.1 1.2896 0.108 Sau ngày nhiễm vi rút Statistix 8.2 4:02:08 CH 16/07/2014, Randomized Complete Block AOV Table for HL Source LN CT Error Total DF 2 SS 0.8442 18.3358 45.8812 65.0611 Grand Mean 1.548 MS 0.4221 9.1679 11.4703 F P 0.80 0.5105 CV 0.515 Tukey's Degree of Freedom Test for Nonadditivity Source DF SS MS F P Nonadditivity 13.8276 13.8276 1.29 0.3379 Remainder 32.0536 10.6845 Relative Efficiency, RCB 0,70 Means of HL for CT CT Mean CT1 1.72 CT2 1.41 CT3 2.33 CT4 1.33 CT5 0.95 Observations per Mean Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 85 Standard Error of a Mean 1.9554 Std Error (Diff of Means) 2.7653 Statistix 8.2 4:02:35 CH 16/06/2014, LSD All-Pairwise Comparisons Test of HL for CT CT Mean Homogeneous Groups CT3 2.33 A CT1 1.72 B CT2 1.41 BC CT4 1.33 C CT5 0.95 D Alpha 0.05 Standard Error for Comparison 1.7653 Critical T Value 1,776 Critical Value for Comparison 0.202 Error term used: LN*CT, DF There are no significant pairwise differences among the means 5.2 Sau 10 ngày nhiễm Statistix 8.2 4:23:54 CH 16/07/2014, Randomized Complete Block AOV Table for HL Source LN CT Error Total DF 2 SS 3.495 176.330 5.367 185.191 Grand Mean 2.302 MS 1.7473 88.1648 1.3418 F P 65.71 0.0009 CV 0.411 Tukey's Degree of Freedom Test for Nonadditivity Source DF SS MS F P Nonadditivity 0.72707 0.72707 0.47 0.5422 Remainder 4.64004 1.54668 Relative Efficiency, RCB 0,99 Means of HL for CT CT Mean CT1 1.78 CT2 3.47 CT3 3.12 CT4 1.82 CT5 1.32 Observations per Mean Standard Error of a Mean 0.6688 Std Error (Diff of Means) 0.9458 Statistix 8.2 4:24:45 CH 16/07/2014, LSD All-Pairwise Comparisons Test of HL for CT Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 86 CT CT2 CT3 CT1 CT4 CT5 Mean Homogeneous Groups 3.47 A 3.12 A 1.78 B 1.82 B 1.32 C Alpha 0.05 Standard Error for Comparison Critical T Value 2,776 Critical Value for Comparison Error term used: LN*CT, DF There are groups (A and B) in which the means are not significantly different from one another 0.9458 1.612 Xử lý số liệu hàm lượng vi rút môi trường nuôi cấy tế bào khác 6.1 Sau ngày nhiễm Statistix 8.2 5:26:37 CH 23/07/2014, Randomized Complete Block AOV Table for HL Source LN CT Error Total DF 2 SS 4.966 139.133 23.601 167.699 Grand Mean 0.467 MS 2.4829 69.5664 5.9002 F P 11.79 0.0210 CV 0.723 Tukey's Degree of Freedom Test for Nonadditivity Source DF SS MS F P Nonadditivity 0.0521 0.05206 0.01 0.9402 Remainder 23.5486 7.84953 Relative Efficiency, RCB 0,79 Means of HL for CT CT Mean CT1 1.29 CT2 0.20 CT3 0.19 CT4 0.19 Observations per Mean Standard Error of a Mean 1.4024 Std Error (Diff of Means) 1.9833 Statistix 8.2 4:27:12 CH 23/07/2014, LSD All-Pairwise Comparisons Test of HL for CT CT CT1 CT2 CT3 CT4 Mean Homogeneous Groups 1.29 A 0.20 B 0.19 B 0.19 B Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 87 Alpha 0.05 Standard Error for Comparison Critical T Value 2,776 Critical Value for Comparison Error term used: LN*CT, DF There are groups (A and B) in which the means are not significantly different from one another 6.2 1.9833 0.934 Sau 10 ngày nhiễm Statistix 8.2 4:29:58 CH 23/07/2014, Randomized Complete Block AOV Table for HL Source LN CT Error Total DF 2 SS 2.5634 63.4000 23.4068 89.3702 Grand Mean 0.985 MS 1.2817 31.7000 5.8517 F P 5.42 0.0727 CV 0.448 Tukey's Degree of Freedom Test for Nonadditivity Source DF SS MS F P Nonadditivity 7.7182 7.71817 1.48 0.3113 Remainder 15.6887 5.22956 Relative Efficiency, RCB 0,74 Means of HL for CT CT Mean CT1 0.72 CT2 1.40 CT3 0.91 CT4 0.91 Observations per Mean Standard Error of a Mean 1.3966 Std Error (Diff of Means) 1.9751 Statistix 8.2 4:30:27 CH 23/07/2014, LSD All-Pairwise Comparisons Test of HL for CT CT CT2 CT3 CT4 CT1 Mean Homogeneous Groups 1.40 A 0.91 A 0.91 A 0.72 B Alpha 0.05 Standard Error for Comparison Critical T Value 1,776 Critical Value for Comparison Error term used: LN*CT, DF There are groups (A and B) in which the means are not significantly different from one another Xử lý số liệu hàm lượng vi rút nhiệt độ ủ lây nhiễm vi rút khác 7.1 Sau ngày lây nhiễm Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 0.9751 0.286 Page 88 Statistix 8.2 9:25:14 SA 17/08/2014, Randomized Complete Block AOV Table for HL Source LN CT Error Total DF 2 SS 14.2222 16.8889 7.1111 38.2222 Grand Mean 1.180 MS 7.11111 8.44444 1.77778 F P 4.75 0.0878 CV 0.385 Tukey's Degree of Freedom Test for Nonadditivity Source DF SS MS F P Nonadditivity 1.69006 1.69006 0.94 0.4048 Remainder 5.42105 1.80702 Relative Efficiency, RCB 1,61 Means of HL for CT CT Mean CT1 1.08 CT2 1.15 CT3 1.31 Observations per Mean Standard Error of a Mean 0.7698 Std Error (Diff of Means) 1.0887 Statistix 8.2 9:26:38 SA 17/08/2014, LSD All-Pairwise Comparisons Test of HL for CT CT CT3 CT2 CT1 Mean Homogeneous Groups 1.31 A 1.15 A 1.08 B Alpha 0.05 Standard Error for Comparison Critical T Value 2,776 Critical Value for Comparison Error term used: LN*CT, DF There are groups (A and B) in which the means are not significantly different from one another 7.2 Sau ngày nhiễm Statistix 8.2 9:35:26 SA 1.0887 1.508 27/08/2014, Randomized Complete Block AOV Table for HL Source LN CT Error Total DF 2 SS 2.889 796.222 14.444 813.556 Grand Mean 1.700 MS 1.444 398.111 3.611 F P 110.25 0.0003 CV 0.421 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 89 Tukey's Degree of Freedom Test for Nonadditivity Source DF SS MS F P Nonadditivity 0.4462 0.44621 0.10 0.7774 Remainder 13.9982 4.66608 Relative Efficiency, RCB 0,78 Means of HL for CT CT Mean CT1 1.37 CT2 1.85 CT3 1.88 Observations per Mean Standard Error of a Mean 1.0971 Std Error (Diff of Means) 1.5516 Statistix 8.2 9:36:08 SA 27/08/2014, LSD All-Pairwise Comparisons Test of HL for CT CT Mean Homogeneous Groups CT3 1.88 A CT2 1.85 A CT1 1.37 B Alpha 0.05 Standard Error for Comparison Critical T Value 2,776 Critical Value for Comparison Error term used: LN*CT, DF All means are significantly different from one another 1.5516 1.622 Xử lý số liệu hàm lượng vi rút mức pH môi trường lây nhiễm vi rút khác 8.1 Sau ngày nhiễm Statistix 8.2 9:40:13 SA 27/08/2014, Randomized Complete Block AOV Table for HL Source LN CT Error Total DF 2 SS 2.889 113.556 25.778 142.222 Grand Mean 2.435 MS 1.4444 56.7778 6.4444 F P 8.81 0.0342 CV 0.119 Tukey's Degree of Freedom Test for Nonadditivity Source DF SS MS F P Nonadditivity 0.1370 0.13699 0.02 0.9073 Remainder 25.6408 8.54693 Relative Efficiency, RCB 0,74 Means of HL for CT CT Mean Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 90 CT1 1.78 CT2 1.94 CT3 3.17 CT4 2.85 Observations per Mean Standard Error of a Mean 1.4657 Std Error (Diff of Means) 2.0728 Statistix 8.2 9:40:48 SA 27/08/2014, LSD All-Pairwise Comparisons Test of HL for CT CT CT3 CT4 CT2 CT1 Mean Homogeneous Groups 3.17 A 2.85 A 1.94 B 1.78 B Alpha 0.05 Standard Error for Comparison Critical T Value 2,776 Critical Value for Comparison Error term used: LN*CT, DF There are groups (A and B) in which the means are not significantly different from one another -SAU NGAY Statistix 8.2 10:03:00 SA 2.0728 0.466 27/08/2014, Randomized Complete Block AOV Table for HL Source LN CT Error Total DF 2 SS 18.6667 8.0000 5.3333 32.0000 Grand Mean 1.147 MS 9.33333 4.00000 1.33333 F P 3.00 0.1600 CV 0.184 Tukey's Degree of Freedom Test for Nonadditivity Source DF SS MS F P Nonadditivity 0.04762 0.04762 0.03 0.8799 Remainder 5.28571 1.76190 Relative Efficiency, RCB 2,30 Means of HL for CT CT Mean CT1 0.42 CT2 0.83 CT3 1.83 CT4 1.51 Observations per Mean Standard Error of a Mean 0.6667 Std Error (Diff of Means) 0.9428 Statistix 8.2 10:03:44 SA Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 27/08/2014, Page 91 LSD All-Pairwise Comparisons Test of HL for CT CT Mean Homogeneous Groups CT3 1.83 A CT4 1.51 B CT2 0.83 C CT1 0.42 D Alpha 0.05 Standard Error for Comparison Critical T Value 2,776 Critical Value for Comparison Error term used: LN*CT, DF 8.2 0.9428 0.721 Sau 10 nhiễm Statistix 8.2 10:08:38 SA 10/09/2014, Randomized Complete Block AOV Table for HL Source LN CT Error Total DF 2 SS 4.222 160.222 16.444 180.889 Grand Mean 0.285 MS 2.1111 80.1111 4.1111 F P 19.49 0.0087 CV 0.346 Tukey's Degree of Freedom Test for Nonadditivity Source DF SS MS F P Nonadditivity 2.7995 2.79953 0.62 0.4900 Remainder 13.6449 4.54831 Relative Efficiency, RCB 0,81 Means of HL for CT CT Mean CT1 0.27 CT2 0.22 CT3 0.44 CT4 0.21 Observations per Mean Standard Error of a Mean 1.1706 Std Error (Diff of Means) 1.6555 Statistix 8.2 10:09:19 SA 10/09/2014, LSD All-Pairwise Comparisons Test of HL for CT CT Mean Homogeneous Groups CT3 0.44 A CT1 0.27 B CT2 0.22 B CT4 0.21 B Alpha 0.05 Standard Error for Comparison Critical T Value 2,776 Critical Value for Comparison Error term used: LN*CT, DF Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 1.6555 0.136 Page 92 All means are significantly different from one another Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 93 [...]... Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 2 đến khả năng lây nhiễm vi rút NPV – Spl (Nucleo Polyhedrosis Virus Spodoptera litura) trên tế bào sâu khoang (Spodoptera litura) 2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài - Phân lập được các nguồn vi rút NPV sâu khoang - Lây nhiễm nhân tạo thành công nguồn vi rút NPV trên tế bào sâu khoang (Spodoptera litura) 3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài + Ý nghĩa khoa học Kết... 1996; Hoàng Thị Vi t và cs., 200 2) Tại Vi n Sinh học nhiệt đới Thành phố Hồ Chí Minh cũng đã sản xuất được 3 loại chế phẩm vi rút NPV là chế phẩm vi rút NPV sâu xanh (NPV. Ha), đạt 3-5x108 PIB/ml, chế phẩm vi rút NPV sâu khoang (NPV. Sl), đạt 3-5x108 PIB/ml và chế phẩm vi rút sâu xanh da láng (NPV. Se), đạt 3-5x108 PIB/ml (Phạm Thị Thùy, 200 8) Các chế phẩm virus sâu xanh (NPV. Ha) trừ sâu xanh đục quả... VI T TẮT Tên vi t tắt Tên vi t đầy đủ BVTV Bảo vệ thực vật CS Cộng sự DMSO Dimethyl Sulfoxide Da Dalton FBS Fetal Bovine Serum CPV cytoplasmic polyhedroses GV Vi rút hạt (Granular virus) NPV Vi rút nhân đa diện (Nucleo Polyhedrosis Virus) NPV- Spl Nucleo Polyhedrosis Virus – Spodoptera litura NSN Ngày sau nhiễm MNPV Multiple nucleocapsids virion OB Thể vùi (Oclusion Body) SNPV Single Nucleocapsids virion... hành lây nhiễm vi rút NPV Các tác giả còn đề xuất một công thức tính toán liều lượng NPV lây nhiễm thích hợp để đạt hiệu quả cao dựa vào chỉ số MOI (mức độ lây nhiễm) của vi rút đối với tế bào (Goodman và cs., 200 1) Theo Jakubowska và cs (200 9) khi lây nhiễm vi rút SeMNPV và HzAM1 trên tế bào Se301 trong môi trường Grace’s có bổ sung FBS ở 3 mức pH là 6,0; 6,5 và 7,0 thì kết quả rất khác nhau Khi lây nhiễm. .. 200 3) Trên đồng ruộng, sâu khoang cũng như các loài côn trùng bộ Cánh phấn khác thường bị chết do nhiễm vi rút NPV (Nucleo Polyhedrosis Virus) Theo kết quả theo dõi của Vi n Bảo vệ thực vật (200 1), khi sâu khoang phát sinh ở mật độ cao, tỷ lệ sâu bị chết do nhiễm NPV từ 0,2- 1,5% trên rau bắp cải, từ 0,9- 1,6% trên đậu tương và từ 0,3- 1,9% trên lạc (Vi n Bảo vệ thực vật, 200 1) Vì vậy, vi c nghiên cứu. .. và khi lây nhiễm với chỉ số MOI là 0,3 đạt tới 7,8 x 106PIB/ml (Phejun và cs., 200 3) Theo Mekvichitsaeng và cs (199 8), khi lây nhiễm vi rút NPV trên tế bào Heliothis zae (Hz) ở các chỉ số MOI khác nhau thì cho mật độ thể vùi khác nhau Với chỉ số MOI là 0,1 khi nồng độ tế bào là 1 x 106 PIB/ml, sau 5 ngày nhiễm thì thể vùi được giải phóng và sau đó vi rút đã nhiễm vào tế bào Hz Thí nghiệm lây nhiễm được... Page 12 thuộc lớp Virus bao gồm 2 giống: vi rút nhân đa diện (Nucleo Polyhedrosis Virus - NPV) và vi rút hạt (Granulosis Virus – GV) (Erayya và cs., 201 3) Theo Farrar và cs (199 9) thì NPV là nhóm vi rut lớn và có hiệu quả gây chết cao đối với các loài côn trùng, mỗi loài vi rút thường rất chuyên tính Đặc biệt, các loài NPV hoàn toàn không lây nhiễm trên các loài động vật có xương sống Vì thế, chúng... diện Số lượng vi rút và thể đa diện ngày một tăng, kêt quả phá vỡ tế bào chủ, giải phóng vi rút tự do và thể đa diện Vi rút tự do lại tiếp tục xâm nhập vào tế bào lân cận, bắt đầu chu trình phá vỡ tế bào tiêp theo Các tế bào chủ bị phá vỡ, quá trình phát bệnh biểu hiện ra bên ngoài (Reinisch, 198 9) Hình 1.3 Các dạng Baculovirus (A) và thể vùi của vi rút (B,C,D) “Nguồn: Van Oers và Vlak, 2007” Vi rút NPV. .. của vi rút NPV tùy thuộc nhiều vào chất lượng sản phẩm tạo dạng, điều kiện bảo quản, thời gian và nhiệt độ bảo quản cũng như pH của sản phẩm sau khi tạo dạng sử dụng (Sireesha và cs., 201 0) 1.2.5 Kỹ thuật lây nhiễm vi rút NPV trên tế bào sâu khoang Các kết quả nghiên cứu lây nhiễm vi rút NPV trên tế bào nhân nuôi để tạo chế phẩm đã được diễn giải khá chi tiết trong nhiều tài liệu Theo kết quả nghiên cứu. .. NPV trên cơ sở ứng dụng kỹ thuật công nghệ nuôi nhân tế bào côn trùng là vấn đề mới Để góp phần tư liệu hướng tới xây dựng qui trình sản xuất chế phẩm sinh học NPV trên cơ sở nuôi nhân tế bào để phục vụ phòng trừ sâu hại ở nước ta, chúng tôi tiến hành đề tài : Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng Học vi n Nông nghiệp Vi t Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 2 đến khả năng lây nhiễm vi rút