TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TRẦN THỤY THẢO TRANG XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG CHẾ PHẨM VI SINH DÙNG TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH NUÔI VÀ BẢO TỒN SINH VẬT BIỂN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGs Ts TRƯƠNG QUỐC PHÚ Ts PHẠM THỊ TUYẾT NGÂN XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG CHẾ PHẨM VI SINH DÙNG TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Trần Thụy Thảo Trang1, Phạm Thị Tuyết Ngân2, Trương Quốc Phú Sinh viên chuyên ngành Nuôi bảo tồn sinh vật biển K37 Khoa Thủy Sản, Đại học Cần thơ E-mail: trang118766@student.ctu.edu.vn ABSTRACT This study aimed to determine the simple method to assess probiotics quality, including part The first part was to probe nutrient sources and bacterial densities, including experiments, each experiment was changed about nutrient sources (glucose and shrimp feed), water treatment ways (without disinfection, chlorine treated, water boiled and water and feed boiled together) and bacterial densities The last part was to assess the commercial probiotics quality, including treatments with kind of probiotics (powder anf solution) was set up with density is about 10 CFU/mL and control treatments (treatment (-) without bacteria and treatment (+) with 10 CFU/mL bacteria) The results showed that the process of probiotics quality assessment: boiling shrimp cultured pond water and pellets of tiger shrimp feed (type 04) together and bacterial densities is 105 CFU/mL in 500 mL, recording TAN by Sera test after 48 hours; if TAN≥ mg/L, the probiotics worked very effectively and reverse Keywords:Probiotics, quatlity, assessment Title: Developing an evaluation process for assessment of probiotics quality in Aquaculture TÓM TẮT Nghiên cứu nhằmtìm phương pháp đơn giản để đánh giá chất lượng chế phẩm vi sinh Nội dung nghiên cứu gồm phần Phần thăm dò nguồn dinh dưỡng mật độ vi sinh, gồm thí nghiệm, thí nghiệm thay đổivề nguồn dinh dưỡng (đường thức ăn tôm), cách xử lý nước (không khử trùng, xử lý chlorine, đun sôi nước đun sôi nước thức ăn) mật độ vi khuẩn Phần 2đánh giá hiệu chế phẩm vi sinh thị trường, gồm nghiệm thức ứng với loại chế phẩm(một loại dạng bột, loại dạng dung dịch) bố trí với mật độ vi khuẩn 105 CFU/mL nghiệm thức đối chứng (đối chứng (-)không bổ sung vi khuẩn đối chứng (+) bổ sung vi khuẩn mật độ 105 CFU/ mL) Kết nghiên cứu thiết lập quy trình đánh giá chế phẩm sau:thể tích bố trí 500 mL, đun sôi lúc nước ao viên thức ăn tôm sú(loại số 4), mật độ vi khuẩn 105 CFU/mL, sau 48 ghi nhận kết tiêu TAN test môi trường, TAN ≥ mg/Lthì chế phẩm vi sinh có hiệu quả, ngược lại không hiệu Từ khóa: Chế phẩm vi sinh,chất lượng, đánh giá GIỚI THIỆU Thuốc kháng sinh lựa chọn ưu tiên kiểm soát dịch bệnh thủy sản Tuy nhiên, sử dụng thuốc hóa chất tràn lan dẫn đến việc kháng thuốc loài nuôi tồn dư sản phẩm thủy sản, gây ảnh hưởng đến môi trường nước, ảnh hưởng đến sức khỏe người hoạt động thương mại Vì vậy, việc sử dụng chế phẩm vi sinh để kiểm soát dịch bệnh mà đảm bảo sản phẩm xuất an toàn thân thiện với môi trường nhận nhiều công nhận người (Lê Thanh Lựu, 2005) Thông qua tuyên truyền công ty từ thực tiễn ứng dụng, người dân có cách nhìn khả quan tác dụng tích cực mà chế phẩm vi sinh mang lại Tỷ lệ nông dân sử dụng chế phẩm sinh học tăng dần từ 35% năm 2003 lên 98% năm 2006 (Nguyễn Hữu Đức, 2007 trích Phạm Thị Tuyết Ngân ctv., 2011) Nhưng đứng trước nhiều sản phẩm thị trường, họ lại gặp khó khăn chưa rõ cách lựa chọn sản phẩm mang lại hiệu nhất.Bên cạnh đó, thông tin từ phía công ty sản xuất cung cấp người dân lại kiểm chứng cách dễ dàng phương pháp đánh giá tương đối phức tạp đòi hỏi chuyên môn cao Thực trạng đòi hỏi phải có phương pháp đánh giá chế phẩm vi sinh đơn giản để người dân tự thực việc lựa chọn sản phẩm từ hình thành khả tự phán đoán cho thân Vì vậy, nghiên cứu “Phương pháp chọn lựa chế phẩm vi sinh có thị trường” thực VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu nghiên cứu Hệ thống keo nhựa loại 800 mL chai thủy tinh loại L Tăm tre thị trường ống tiêm loại mL Chế phẩm vi sinh thị trường, chọn mua 02 loại (01 loại dạng bột, 01 loại dạng dung dịch) Nguồn vi khuẩn gồm: Bacillus subtilisvà Lactobacillus acidophilus lấy từ Bộ sưu tập vi sinh vật, Phòng thí nghiệm Vi sinh (Bộ môn Thủy sinh học ứng dụng -Khoa Thủy Sản) Các trang thiết bị thu phân tích mẫu vi sinh, Phòng thí nghiệm Vi sinh (Bộ môn Thủy sinh học ứng dụng – Khoa Thủy sản) Các trang thiết bị thu mẫu phân tích mẫu nước, Phòng thí nghiệm Phân tích chất lượng nước (Bộ môn Thủy sinh học ứng dụng – Khoa Thủy sản) 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Thăm dò nguồn dinh dưỡng mật độ vi sinh Gồm thí nghiệm (TN) với điều kiện cách bố trí mô tả sau: Bảng Điều kiện cách bố trí thí nghiệm thăm dò TN Dinh dưỡng Đường (1,5 g) Thức ăn tôm (1 g) Giống vi Mật độ vi sinh khuẩn (CFU/mL) Bacillus 0, 103, 104, 105, 106 Lactobacillus Nguồn nước Phương pháp khử trùng Số NT Lặp lại Nước ao Nước ót pha Không Bacillus 0, 103, 104, 105, 106 Lactobacillus Nước ao Nước ót pha Không 3 Thức ăn tôm (0,25 g) Bacillus 0, 103, 104, 105, 106 Nước ót pha Chlorine Thức ăn tôm (0,1 g) Bacillus 0, 103, 104, 105, 106 Nước ót pha Đun sôi nước 5 Thức ăn tôm (0,1 g) Bacillus 0, 103, 104, 105, 106 Nước ót pha Đun sôi nước thức ăn Mỗi thí nghiệm bố trí từ 3-5 ngày Cách theo dõi tiêu pH, TAN mật độ vi sinh nêu mục 2.2.3 2.2.2 Đánh giá hiệu chế phẩm vi sinh thị trường Thí nghiệm gồm nghiệm thức ứng với loại chế phẩm thị trường (một loại dạng bột, loại dạng dung dịch) bố trí với mật độ vi khuẩn 105 CFU/mL nghiệm thức đối chứng (đối chứng (-) không bổ sung vi khuẩn đối chứng (+) bổ sung vi khuẩn mật độ 105 CFU/ mL) 2.2.3 Các tiêu theo dõi phát triển vi khuẩn thí nghiệm Bảng Phương pháp đo yếu tố môi trường vi sinh Chỉ tiêu Phương pháp phân tích pH Bộ test Sera máy đo pH TAN Bộ test Sera phương pháp Phenate (APHA et al., 1995) Mật độ Phương pháp đếm khuẩn lạc vi khuẩn (Baumann et al., 1980) Thông tin khác Kiểm tra nguồn nước trước bố trí Sau cho thức ăn vào (chưa hấp tiệt trùng) Sau hấp tiệt trùng (chưa bổ sung vi sinh) Sau 24 từ lúc bổ sung vi sinh (trong ngày liên tiếp) Trữ mẫu tủ lạnh, xác định mật độ kết thúc thí nghiệm 2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu Chương trình MS Excel sử dụng để trữ số liệu, xử lý xếp Số liệu phân tích thống kê theo ANOVA (Steele Torrie, 1980), kiểm định phép thử Duncan phần mềm thống kê SPSS Sự khác biệt có ý nghĩa mức alpha 0,05 Tất giá trị trung bình tính với ± độ lệch chuẩn (S.E.) KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thăm dò nguồn dinh dưỡng mật độ vi sinh Thí nghiệm Kết tiêu môi trường thí nghiệm trình bày bảng cho thấy chệnh lệch nhiều pH nghiệm thức với nghiệm thức với nghiệm thức đối chứng Hàm lượng TAN tất nghiệm thức mg/L Bảng Các tiêu môi trường thí nghiệm Chỉ tiêu Nguồn nước Nghiệm thức 103 104 105 106 Nước ao tôm 7,5 8,1± 0,25 8,0± 0,1 8,0±0,1 7,8±0,25 Nước ót pha 7,5 7,7±0,23 7,7±0,23 7,7±0,23 7,3±0,21 Nước ao tôm 0 0 Nước ót pha 0 0 pH TAN Ghi chú: Giá trị thể trung bình độ lệch chuẩn Theo nguyên lý, môi trường dinh dưỡng đầy đủ, Bacillus Lactobacillus hoạt động tốt diễn đồng thời trình amôn hóa giúp chuyển hóa chất hữu thành vô (NH3) làm hàm lượng TAN nước tăng, đồng thời trình lên men vi khuẩn tạo thành acid hữu làmgiảm pH(Phạm Thị Tuyết Ngân, 2011) Ở thí nghiệm 1, tiêu pH thay đổi không rõ ràng hàm lượng TAN nước không đổi (=0 mg/L) nên cần loại bỏ đường tiến hành thí nghiệm với nguồn dinh dưỡng khác Thí nghiệm Sau thay đổi nguồn dinh dưỡng thành thức ăn tôm,kết biến động tiêu môi trường thí nghiệm sau: pH nghiệm thức khác biệt không nhiều (nằm khoảng từ 6,7 đến 7,1), nghiệm thức so với nghiệm thức đối chứng có chênh lệch không đáng kể (0,2-0,6 đơn vị pH) Hàm lượng TAN có khác biệt nghiệm thức (3,7 mg/L) so với nghiệm thức đối chứng (4 mg/L) nghiệm thức khác biệt (Bảng 4) Bảng Các tiêu môi trường thí nghiệm Chỉ tiêu pH TAN Nguồn nước Nghiệm thức 10 104 105 106 Nước ao tôm 6,5±0,44 7,0±0,73 7,1±0,64 7,0±0,74 6,7±0,65 Nước ót pha 6,5±0,46 6,9±0,79 7,0±0,77 7,0±0,77 6,9±0,59 Nước ao tôm 4,0±1,5 3,7±2 3,7±2 3,7±2 3,7±2 Nước ót pha 3,0±1,5 3,7±2 3,7±2 3,7±2 3,7±2 Ghi chú: Giá trị thể trung bình độ lệch chuẩn Nguyên nhân nguồn nước bố trí không xử lý, vi sinh vật nước hoạt động đồng thời với vi khuẩn bố sung Bên cạnh đó, liều lượng dinh dưỡng cao (1g thức ăn/500 mL nước) nên dẫn đến hàm lượng TAN nghiệm thức không khác biệt Vì vậy, chưa thể xây dựng phương pháp mà phải thực thí nghiệm thăm dò tiếp tục Thí nghiệm Ở thí nghiệm 3, chlorine dùng để khử trùng vi sinh vật nước nhằm đảm bảo mật độ vi sinh có sẵn không làm ảnh hưởng đến thí nghiệm thăm dò Tuy nhiên,theo kết thu bảng thìpH biến động bất thường TAN tăng nhanh nghiệm thức Bảng Các tiêu môi trường thí nghiệm Chỉ tiêu Nguồn nước Nghiệm thức 10 104 105 106 Nước ao tôm 7,5±0,35 7,7±0,28 7,8±0,23 7,7±0,34 7,8±0,19 Nước ót pha 7,6±0,48 7,7±0,36 7,7±0,29 7,8±0,36 7,8±0,3 Nước ao tôm 3,5±1,83 3,6±1,8 3,6±1,93 3,6±1,9 3,6±2 Nước ót pha 3,5±1,7 3,7±1,67 3,7±1,68 3,7±1,93 3,7±1,72 pH TAN Ghi chú: Giá trị thể trung bình độ lệch chuẩn Mặc dù sử dụng chlorine chưa hiệu quả, đặc biệt bào tử vi sinh vật, chúng có khả chịu đựng chlorine nồng độ cao so với tế bào sinh dưỡng chlorine khó khuếch tán qua vỏ bào tử (Trương Quốc Phú, 2011) Qua kết thí nghiệm, hàm lượng TAN tăng nhanh chứng tỏ liều lượng thức ăn cao (0,25 g/500mL) phải tiếp tục giảm lượng thức ăn.Khi tiến hành xác định mật độ vi khuẩn cuối thí nghiệm, nhận thấy diện vi khuẩn Lactobacillus môi trường nước nên không bổ sung giống vi khuẩn thí nghiệm kế tiếp.Chỉ tiêu môi trường nước ao tôm nước ót pha loãng khác biệt nên thí nghiệm sau dùng nước ót pha Thí nghiệm Với liều lượng thức giảm 0,1 g/500mL xử lý nguồn nước cách đun sôi kết tiêu môi trường khác biệt nghiệm thức (bảng 6), đặc biệt nghiệm thức đối chứng, không bổ sung vi sinh TAN tăng Điều bên thức ăn có nguồn vi khuẩn cần đun sôi thức ăn nguồn nước thí nghiệm Bảng Các tiêu môi trường thí nghiệm Chỉ tiêu pH Nước ót pha TAN Nghiệm thức Nguồn nước 103 104 105 106 7,4±0,33 7,4±0,33 7,4±0,34 7,5±0,33 7,4±0,29 1,7±0,91 1,7±0,86 1,7±0,93 1,7±0,96 1,7±0,9 Ghi chú: Giá trị thể trung bình độ lệch chuẩn Thí nghiệm Kết quảthí nghiệm trình bày bảng cho thấy số pHcao nghiệm thức đối chứng (pH: 7,8), giảm dần nghiệm thức (pH: 7,3) thấp nghiệm thức (pH: 7,1).Hàm lượng TAN thấp nghiệm thức đối chứng (0,32 mg/L), tăng dần nghiệm thức (0,84 mg/L) cao nghiệm thức (0,89mg/L) Ở hai tiêu có khác biệt có ý nghĩa thống kê nghiệm thức đối chứng so với hai nghiệm thức lại (p0,05) Bảng Các tiêu môi trường thí nghiệm Nghiệm thức pH TAN Máy đo Test a Máy đo Test a a 7,8±0,27 7,4±0,41 0,32±0,07 0,35±0,09a 103 7,3±0,23b 7,0±0,13b 0,84±0,73b 0,77±0,71b 105 7,1±0,18b 6,8±0,25c 0,89±0,70b 0,86±0,70b Ghi chú: Giá trị thể trung bình độ lệch chuẩn Các giá trị cột có chữ khác khác biệt có ý nghĩa thống kê (p ... vi sinh để bố trí thí nghiệm: Đối với chế phẩm vi sinh dạng dung dịch: dùng kim tiêm có thị trường hút trực tiếp lượng chế phẩm vi sinh cần dùng Đối với chế phẩm vi sinh dạng bột: cho g chế phẩm. .. phẩm vi sinh (tương đương với mL đong cốc test môi trường) pha loãng với 1L nước, khuấy đều, sau dùng kim tiêm hút lượng chế phẩm vi sinh cần dùng Cách tính lượng chế phẩm vi sinh cần dùng để... dàng phương pháp đánh giá tương đối phức tạp đòi hỏi chuyên môn cao Thực trạng đòi hỏi phải có phương pháp đánh giá chế phẩm vi sinh đơn giản để người dân tự thực vi c lựa chọn sản phẩm từ hình