BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM  NGUYỄN THỊ HIẾN ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ QUẦN THỂ NGAO BẾN TRE Meretrix lyrata ( Sowerby, 1851) TẠI VIỆT NAM BẰNG CHỈ THỊ MICROSATELLITE CHUYÊN NGÀNH: NUÔI TRỒNG THỦY SẢN MÃ SỐ:60.62.03.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS THÁI THANH BÌNH HÀ NỘI – 2014 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị Kết có luận văn cố gắng làm việc, nghiên cứu học hỏi cách nghiêm túc thân Tác giả Nguyễn Thị Hiến Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành lòng biết ơn sâu sắc tới TS Thái Thanh Bình - Trưởng phòng Khoa học Hợp tác quốc tế - Trường Cao đẳng Thủy sản, người định hướng tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện để hoàn thành luận văn Tôi xin cảm ơn ThS Hoàng Thị Phương Hồng cán làm việc Phòng thí nghiệm - Trường Cao đẳng Thủy sản nhiệt tình hướng dẫn kỹ thuật phân tích Microsatellite Tôi xin trân trọng cảm ơn Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I tạo điều kiện cho có khóa học Xin gửi lời cảm ơn giúp đỡ, lời động viên bạn bè, đồng nghiệp dành cho suốt trình thực luận văn Cuối lời cảm ơn xin dành cho bố, mẹ anh chị em gia đình, đặc biệt người chồng động viên, giúp đỡ học tập sống Đề tài hoàn thành với hỗ trợ kinh phí đề tài: “Đánh giá đa dạng di truyền số quần thể ngao Bến Tre Meretrix lyrata (Sowerby, 1851) Việt Nam thị microsatellite” Hà Nội, ngày 18 tháng 12 năm 2014 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vii ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu đề tài Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đa dạng di truyền 1.2 Chỉ thị phân tử Microsatellite 1.3 PCR (Polymerase Chain Reaction) 1.4 Ứng dụng thị phân tử đánh giá đa dạng di truyền loài thủy sản Việt Nam 1.5 Một số đặc điểm sinh học ngao Bến Tre .11 1.5.1 Hệ thống phân loại ngao Bến Tre .11 1.5.2 Nguồn gốc phân bố ngao Bến Tre 12 1.5.3 Đặc điểm hình thái- sinh thái 14 1.5.4 Đặc điểm dinh dưỡng 14 1.5.5 Đặc điểm sinh trưởng 15 1.5.6 Đặc điểm sinh sản phát triển 15 1.6 Tình hình nuôi ngao Bến Tre giới Việt Nam 15 1.6.1 Tình hình nuôi ngao giới 15 1.6.2 Tình hình phát triển nuôi ngao Việt Nam .16 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii 1.7 Nghiên cứu đa dạng di truyền ngao Bến Tre Thế Giới Việt Nam 20 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Vật liệu nghiên cứu .22 2.1.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 22 2.1.2 Phương pháp thu bảo quản mẫu .24 2.1.3 Thiết bị .24 2.1.4 Hóa chất .25 2.2 Phương pháp nghiên cứu 25 2.2.1 Tách ADN tổng số 27 2.2.2 Nhân ADN đặc hiệu 31 2.2.3 Phân tích đa hình alen locus Microsatellite 33 2.2.4 Phân tích thống kê 37 2.2.5 Xác định cấu trúc quần thể 37 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .39 3.1 Kết tách chiết ADN tổng số 39 3.2 Kết nhân ADN đặc hiệu .40 3.3 Mức độ đa dạng di truyền số quần thể ngao Việt Nam 42 3.4 Mức độ cận huyết quần thể ngao 45 3.5 Mối quan hệ khoảng cách di truyền quần thể 45 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 48 Kết luận 48 Đề xuất .48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC .55 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Địa điểm thu mẫu số lượng mẫu phân tích 24 Bảng 2.2: Thành phần hóa chất cho phản ứng PCR 31 Bảng 2.3: Cặp mồi dùng để khuếch đại Microsatellite ngao 32 Bảng 2.4 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 32 Bảng 3.1 Số lượng alen, tần số dị hợp tử theo lý thuyết (He), tần số dị hợp tử quan sát (Ho), giá trị thông tin đa hình (PIC), hệ số cận huyết kết kiểm định locus Microsatellite với giả thiết không cân di truyền Hardy-Weinberg 42 Bảng 3.2 Tần số dị hợp tử quan sát (Ho), dị hợp tử mong đợi theo lý thuyết (He) trung bình alen locut (K), Hệ số đồng huyết (Fis), kiểm định với giả thuyết không tuân theo định luật di truyền Hardy – Weinberg quần thể ngao 44 Bảng 3.3 Ma trận giá trị sai khác di truyền (Fst) quần thể phân bố quần thể ngao 45 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ nguyên lý phản ứng PCR Hình 1.2 Ngao Bến Tre (Meretrix lyrata) 12 Hình 1.3 Phân bố ngao Meretrix sp giới (theo Sealife) 13 Hình 1.4 Bãi nuôi ngao Giao Thủy – Nam Định 18 Hình 2.1 Bản đồ thu mẫu ngao Bến Tre 23 Hình 2.2 Máy PCR MyGenic 96 Thermal Block 25 Hình 2.3 Cách tiến hành nhuộm 36 Hình 3.1 Kết kiểm tra ADN tổng số quần thể ngao Bến Tre Thanh Hóa gel agarose 1% 40 Hình 3.2 Kết điện di sản phẩm Microsatellte quần ngao Nam Định với loci MME15 - CQ141846 kiểm tra gel Agarose1% 41 Hình 3.3 Kết sản phẩm Microsatellite với loci MME15-GQ141846 quần thể ngao Nam Định điện di gel polyacrylamide 4,5% 42 Hình 3.4 Cây phân loài di truyền số quần thể ngao Việt Nam 46 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ADN Acid desoxyribonucleic BP Base pair dNTP Deoxy nucleoside triphosphat ĐDDT Đa dạng di truyền Marker Chỉ thị phân tử NXB Nhà xuất NST Nhiễm sắc thể PCR Polymerase Chain Reaction Taq Thermus a quaticus TAE Tris - glacial acetic acid - ethylene diamine tetra acetic acid) TB Trung bình TE Tris – EDTA (Ethylene diamine tetra acetic acid) V Đơn vị đo hiệu điện UV Ultra Violet Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii ĐẶT VẤN ĐỀ Tính cấp thiết đề tài Động vật thân mềm xem đối tượng thích hợp cho phát triển nuôi biển Đây xu nuôi trồng thủy sản kỷ 21 Trong năm qua, nghề nuôi biển phát triển nhanh chóng đem lại công ăn việc làm góp phần cải thiện đời sống cộng đồng dân cư ven biển Trong đó, nuôi ngao xem điển hình hiệu đối tượng nuôi nhuyễn thể vùng cửa sông ven biển Việt Nam (Nguyễn Thanh Tùng, 2007) Ngao Bến Tre (Meretrix lyrata) loài ngao nuôi phổ biến Việt Nam giá trị dinh dưỡng, khả khai thác đặc tính thích nghi chúng với môi trường Phong trào nuôi ngao Việt Nam phát triển mạnh mẽ, số trại sản xuất giống ngao hình thành chưa đáp ứng đủ giống cho người nuôi Do miền Bắc thiếu ngao giống nên tư thương buôn bán giống chuyển ngao từ tỉnh miền Nam tỉnh miền Bắc Thái Bình, Nam Định, Thanh Hóa, Nghệ An để nuôi Dẫn đến không tránh khỏi trộn lẫn dòng ngao vùng miền làm giảm tính đa dạng có nguy giảm chất lượng giống ngao Mặc dù ngao Bến Tre đối tượng nuôi phổ biến nghiên cứu đối tượng hạn chế Nhìn chung nghiên cứu ngao nước đa số tập trung vào sinh học sinh sản kỹ thuật sản xuất giống nuôi thương phẩm Vấn đề đặt cho nghiên cứu cần đánh giá đa dạng sinh học quần thể ngao Bến Tre, so sánh hệ số biến dị di truyền quần thể để đưa quần thể dùng để chọn giống Ngoài cần xem xét có tượng cận huyết hay không cá thể quần thể quần thể với Nhiều năm qua nghề nuôi ngao thương phẩm đem lại nguồn thu nhập đáng kể cho người nuôi từ năm 2005 lại đây, nghề nuôi ngao Việt Nam gặp không khó khăn tượng ngao chết xuất theo mùa hàng năm Theo Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page báo cáo Chi cục Nuôi trồng thủy sản Thái Bình đến ngày 19/8/2014 tổng diện tích ngao bị chết 1.096,33ha/2.569 diện tích ngao nuôi tỉnh Được đồng ý Hội đồng khoa học Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I cho phép phối hợp Trường Cao đẳng Thủy sản, tiến hành thực đề tài “Đánh giá đa dạng di truyền số quần thể ngao Bến Tre Meretrix lyrata (Sowerby, 1851) Việt Nam thị microsatellite” Mục tiêu đề tài - Đánh giá đa dạng di truyền quần thể ngao Bến Tre (Meretrix lyrata) tỉnh Nam Định, Thái Bình, Thanh Hóa, TP Hồ Chí Minh (Cần Giờ), Bến Tre, Cà Mau thị microsatellite làm sở cho việc lựa chọn vật liệu ban đầu phục vụ chọn giống bảo tồn Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu mức độ đa dạng di truyền số quần thể ngao Bến Tre - Nghiên cứu mức độ cận huyết quần thể ngao Bến Tre - Nghiên cứu mối liên hệ, khoảng cách di truyền quần thể ngao Bến Tre Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài - Cung cấp thêm tư liệu thông tin khoa học hữu ích cho công tác nghiên cứu đa dạng di truyền - Những thông tin đa dạng di truyền nguồn gene sở để bảo tồn, khai thác sử dụng cách có hiệu nguồn gene ngao Bến Tre Việt Nam - Góp phần cung cấp thông tin, quy hoạch vùng nuôi ngao Bến Tre số địa phương Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page có sai khác lớn với trung bình Fst = 0,004 Các quần thể ngao miền Nam (Bến Tre, Tp HCM, Cà Mau) có sai khác rõ rệt với trung bình Fst = 0,086 Theo Nei (1978) Fst[...]... khi kiểm tra trên số lượng mẫu lớn hơn Thai Thanh Binh TT và Austin (2 009), đã tiến hành đánh giá đa dạng di truyền của các quần đàn cá chép ở 12 tỉnh Việt Nam bằng chỉ thị Microsatellite, SSCP và giải mã trình tự ADN Kết quả phân tích số liệu Microsatellite và SSCP cho thấy hệ số đa dạng di truyền giữa các quần đàn rất lớn đạt 90,6% nhưng giữa các cá thể trong cùng một quần đàn chỉ đạt 5% Phạm Anh... tính đa hình bên trong mỗi quần đàn rất cao với giá trị thông tin đa hình (PIC) > 0,829, tính đa hình giữa các quần đàn tôm sú cũng cao (PIC) > 0,913 và khoảng cách di truyền giữa các quần đàn lớn 0,4693 – 0,7268, quần đàn I và II có đồ thị phân bố tần số allen tương tự nhau hơn so với quần đàn III Đào Thị Tuyết & ctv (2 003), Sử dụng phương pháp RAPD đánh giá đa hình di truyền quần đàn cá tra nuôi (Pangasius... 1.1 Đa dạng di truyền Đa dạng di truyền ( DDT) là phân mức cơ bản nhất trong đa dạng sinh học, thể hiện qua sự khác nhau của tất cả gen di truyền của tất cả các cá thể thực vật, động vật, nấm và vi sinh vật ĐDDT là sự đa dạng về thành phần gen giữa các cá thể tồn tại trong cùng một loài và giữa các loài khác nhau (http://www.nea.gov.vn/html/DDDT) ĐDDT tạo nên sự khác biệt giữa các cá thể trong quần thể. .. loại của ngao như sau: Ngành thân mềm: Mollusca Lớp hai mảnh vỏ: Họ ngao: Bivalvia Veneridae Giống ngao: Loài ngao: Meretrix Meretrix lyrata (Sowerby, 1851) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 11 Hình 1.2 Ngao Bến Tre (Meretrix lyrata) Tên Tiếng Anh: Lyrate Asiatic Hard Clam Ở Việt Nam, hiện đang sử dụng hai từ ngao và “nghêu” để chỉ các loài nhuyễn thể hai mảnh... tích nuôi nhuyễn thể sẽ đạt 43.360 ha và sản lượng đạt 427.940 tấn Ngao được thả nuôi chủ yếu là ngao Bến Tre Meretrix lyrata (Sowerby, 1851) số còn lại là ngao địa phương như ngao dầu Meretrix meretrix (Linnd, 1758) Nuôi nhuyễn thễ ven biển được bắt đầu sớm ở Việt Nam vì loài Meretrix lyrata có sẵn trong các bãi triều tự nhiên, hoạt động nuôi ngao từ rất sớm khoảng năm 1970 ở Bến Tre sau đó chuyển... dù ngao Bến tre là đối tượng nuôi quan trọng ở Việt Nam, nhưng chưa có nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền các quần thể ngao ở Việt Nam Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 21 CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu Ngao Bến Tre sử dụng trong nghiên cứu được thu ngoài tự nhiên tại Thái Bình, Nam. .. mồi Microsatellite giữa tôm càng xanh Việt Nam và Trung Quốc Tuy nhiên khi phân tích RAPD cho thấy sự khác biệt di truyền giữa 2 quần đàn tôm Trung bình là 14,9 alen (TCXTQ) và 12,9 alen (TCXVN) Trung bình dị hợp tử, giá trị đa dạng di truyền PIC lần lượt là 0,156; 0,84 – 0,88 (TCXTQ) và 0,179; 0.86 – 0,88 (TCXVN) Chỉ số Shanmon là 0,2242 (TCXTQ), 0,279 (TCXVN) Trần Thị Thúy Hà và ctv (2 012), dùng 5 chỉ. .. cho các chỉ thị đặc trưng, cây di truyền được chia thành 5 nhóm Cũng trên đối tượng tôm sú (Peneaus monodo) Nguyễn Thị Thảo & ctv (2 004), sử dụng chỉ thị Microsatellite đánh giá tính đa hình 3 quần đàn tôm sú nuôi ở Việt Nam, kết quả phân tích trên 3 quần đàn, quần đàn I có nguồn gốc ở Miền Nam, quần đàn II có nguồn gốc ở Miền trung và quần đàn III có nguồn gốc nhập ngoại từ Singapore tác giả đã chỉ ra... (2 012), dùng 5 chỉ thị Microsatellite với hai phản ứng PCR đa mồi được sử dụng trên 5 quần đàn tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) nuôi ở Việt Nam nhằm đánh giá đa dạng di truyền của chúng Số alen trên mỗi vị trí Microsatellite dao động từ 6 – 8 alen và có alen xuất hiện với tần số thấp (